不結球白菜霜霉病菌株生物學特性及致病力研究

文鍇 張雷 王清明 徐旋 王璐璐

摘要? ? 為了研究不結球白菜霜霉病菌菌株生物學特征及致病力，以10份不結球白菜霜霉病病變葉為材料，收集、提取、培養(yǎng)并保存霜霉病菌菌株，測定菌株生物學特性，調查其病情指數(shù)。結果表明，當溫度為6～25 ℃時，孢子囊均可萌發(fā)，18 ℃萌發(fā)率達到最大值;在相對濕度為98%～100%條件下，孢子囊均可萌發(fā);在相對濕度為100%條件下，孢子囊萌發(fā)率達到最大值，在48 h萌發(fā)率達到最大。南京地區(qū)霜霉病菌孢子囊相對較大，天津地區(qū)霜霉病菌孢子囊相對較小。不結球白菜品種042-S2-1病情指數(shù)為4.80，為高抗;品種084-S2-6病情指數(shù)為68.15，為感病。Cc-nj2的侵染能力最強，Cc-nj3的侵染能力最弱。綜合分析可知，不結球白菜品種042-S2-1和027-S2-1為抗病材料，084-S2-6為感病材料。

關鍵詞? ? 不結球白菜霜霉病;生物學特性;孢子囊;病情指數(shù);致病力

中圖分類號? ? S435.121.4+5? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）21-0131-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

不結球白菜又叫青菜、小白菜，生長周期短、產量高、適應性廣、種類繁多，對調節(jié)蔬菜市場供應具有重要作用。在多年的栽培生產過程中，不結球白菜病害高發(fā)，其中黑斑病、白粉病、霜霉病對產量影響較大。霜霉菌（Hyaloperonospora parasitica）是引起不結球白菜霜霉病的病原菌，霜霉病是不結球白菜生產上的一大病害，主要危害葉片，影響葉肉品質，尤其是影響苗期生長。不結球白菜霜霉病具有高發(fā)病率、強傳染性等特點，大大降低了不結球白菜的產量，嚴重制約了我國不結球白菜產業(yè)的發(fā)展。據(jù)國內外有關報道，不同不結球白菜品種對霜霉病存在明顯抗性差異，菌株對不同蔬菜品種的侵染能力存在明顯差異，霜霉病伴隨不結球白菜整個生長周期[1]。在春、秋季節(jié)，不結球白菜霜霉病菌株的致病能力比夏、冬季節(jié)更強。由于霜霉病菌株進化快速[2]，化學殺菌劑對于新進化的霜霉病病菌的防治效果較差[3-4]。目前，通過對蔬菜的抗性基因研究和培育不結球白菜抗病品種是防治霜霉病最為有效的方法。由于蔬菜抗性較差，田間管理者為了降低霜霉病危害，通常每5～7 d噴施1次殺菌劑[5]。由于抗殺菌劑菌株群體緩慢出現(xiàn)，田間管理者將面對新的抗病難題[6]。致病型的真菌性狀在蔬菜上呈現(xiàn)很多不同的特點，形態(tài)學上的差異給病原菌的鑒定與分類工作增加了難度，而霜霉菌侵染能力受其生理機制的影響?；诖耍疚耐ㄟ^對不結球白菜霜霉病菌株生物學特性及致病力的研究，進一步探究不結球白菜品種的抗病性。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 供試材料

供試不結球白菜品種為027-S2-1、SZQ、042-S2-1、084-S2-6和NHCC-020-S2-2。供試霜霉病菌株分別來自沈陽、天津和南京等地（表1），病葉采集后裝于無菌密封箱，帶回實驗室備用，共計10份。收集的病菌要求未施用殺菌劑，且純凈、新鮮、無雜菌。采集病葉后，用蒸餾水沖洗3～4次，在18～25 ℃暗培養(yǎng)箱中保濕24～48 h，待出現(xiàn)新鮮且濃密的霜霉菌層，備用。

1.2? ? 試驗方法

1.2.1? ? 孢子囊懸浮液制備。用滅菌的蒸餾水將采集的病葉表面污垢雜質沖洗干凈后，用滅菌的濾紙充分吸干葉面水分，在溫度18 ℃、濕度為100%的全黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。培養(yǎng)后用滅菌的毛筆輕輕刷下新鮮孢子囊，溶解到滅菌蒸餾水中配制孢子囊懸浮液。

1.2.2? ? 不結球白菜霜霉病病菌孢子囊萌發(fā)方式。參照改進后崔鐵軍等[7]的方法，吸取少量新鮮孢子囊懸浮液制片，于顯微鏡下統(tǒng)計觀察。

1.2.3? ? 不結球白菜霜霉病病菌生物學特性測定。

（1）溫度對不結球白菜霜霉病病菌孢子囊萌發(fā)的影響。將新鮮孢子囊懸浮液分別置于0、6、12、16、18、22、25 ℃條件下，于4、8、12、16、24 h后分別檢測萌發(fā)率，每個處理3次重復。

（2）相對濕度對不結球白菜霜霉病病菌孢子囊萌發(fā)的影響。采集的病葉用蒸餾水沖洗干凈后，置于溫度為18 ℃，相對濕度分別為90%、95%、98%、100%的條件下培養(yǎng)。待長出菌層，于培養(yǎng)4、8、16、24、36、48 h分別顯微鏡制片檢測孢子囊萌發(fā)率，每個處理3次重復。

1.2.4? ? 不結球白菜霜霉病菌形態(tài)學觀察。將每個品種的菌株分別置于光學顯微鏡和體式顯微鏡下觀察。每個菌株在10×40倍顯微鏡下用顯微測微尺隨機測定，孢子囊數(shù)量不少于50個，計算孢子囊大小。

1.2.5? ? 不結球白菜霜霉菌致病性研究。把菌源Cc-nj1分別接種于不結球白菜品種027-S2-1、SZQ、084-S2-6和042-S2-1。同時，于SZQ上分別接種菌源Cc-tj1、Cc-sy1、Cc-nj2和Cc-nj3，于NHCC-020-S2-2上接種菌源Cc-nj4和Cc-tj1，子葉期接種7 d后，肉眼結合體視顯微鏡進行觀察統(tǒng)計，調查病情指數(shù)，于各品種不結球白菜子葉期以注射器注射的方式接種菌種。結果調查按葉片的病斑面積分級，記錄病情指數(shù)。改良后的分級標準：0級，無病斑;1級，病斑微小，病斑面積占葉面積20%及以下;3級，病斑較大且面積占葉面積的20%～40%;5級，病斑面積占葉面積的40%～60%，病斑大且多;7級，病斑面積占葉面積的60%及以上，病斑多，存在局部壞死現(xiàn)象[8]。病情指數(shù)計算公式如下：

依病情指數(shù)（DI）將不結球白菜對霜霉病的抗性分為以下5級：高抗（HR），DI≤20;抗?。≧），2080。

2? ? 結果與分析

2.1? ? 不結球白菜霜霉菌形態(tài)學結構觀察

通過霜霉菌的形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，不結球白菜霜霉菌孢子梗有明顯主干，存在分支，分支發(fā)達、細長且相互交織，孢子囊位于頂端且形成芽管，芽管可形成分支（圖1），孢子囊呈球形或橢球形（圖2）。

2.2? ? 溫度對不結球白菜霜霉菌孢子囊萌發(fā)的影響

在供試范圍溫度內，0 ℃條件下未發(fā)現(xiàn)孢子囊萌發(fā)，6～25 ℃均有孢子囊萌發(fā)，但6 ℃條件下前12 h未發(fā)現(xiàn)孢子囊萌發(fā)。孢子囊萌發(fā)率隨溫度升高呈先升后降的趨勢，18 ℃條件下萌發(fā)率達到最大值（表2）。較高或較低的溫度都會降低霜霉菌孢子囊的萌發(fā)率。

2.3? ? 相對濕度對不結球白菜霜霉菌孢子囊萌發(fā)的影響

在供試相對濕度范圍內，在相對濕度95%以下，孢子囊不萌發(fā);在相對濕度98%～100%條件下，孢子囊均可萌發(fā)。相對濕度98%和100%條件下，孢子囊萌發(fā)率存在較大差異。在相對濕度100%條件下，孢子囊萌發(fā)率達到最大值，且在48 h萌發(fā)率達到最大（表3）。

2.4? ? 不結球白菜霜霉菌孢子囊大小

從表4可以看出，南京地區(qū)霜霉菌孢子囊平均大小為22.02～32.57 μm×22.15～31.76 μm;天津地區(qū)孢子囊平均大小為19.17～22.55 μm×19.99～22.29 μm。綜合比較可知，南京地區(qū)霜霉菌孢子囊相對較大，天津地區(qū)霜霉菌孢子囊相對較小。

2.5? ? 不結球白菜霜霉菌致病性

由表5可以看出，根據(jù)子葉期發(fā)病情況，不同不結球白菜品種間發(fā)病率和發(fā)病指數(shù)有明顯差異，發(fā)病率為4.80%～100.00%，病情指數(shù)為4.80～87.14。高抗品種為042-S2-1，病情指數(shù)為4.80;感病品種為084-S2-6，病情指數(shù)為68.15。Cc-nj2的侵染能力最強，使SZQ發(fā)病指數(shù)達87.14;Cc-nj3的侵染能力較弱，使SZQ發(fā)病指數(shù)為28.42。綜合分析可知，不結球白菜042-S2-1和027-S2-1為抗病品種，084-S2-6為感病品種。

由表5可以看出，所有不結球白菜品種均可感染霜霉病菌。同一品種霜霉菌菌株對不同鑒別寄主的致病能力存在差異;不同霜霉菌菌株對同一種寄主的侵染力和致病性都存在差異。綜合分析可知，不同區(qū)域的不結球白菜霜霉菌存在生理小種分化現(xiàn)象。

3? ? 結論與討論

霜霉菌傳播主要以風為載體，主要寄生在葉片上，無性繁殖，適宜的溫度和濕度有利于霜霉菌生長。對于不結球白菜霜霉病病原菌的防治，菜農多采用多菌靈治理，但效果不佳?；诖?，本試驗就不同溫度和相對濕度等環(huán)境因素對不結球白菜霜霉病病原菌孢子囊萌發(fā)率的影響進行研究。研究發(fā)現(xiàn)，在供試條件下，孢子囊在6～25 ℃范圍內均有萌發(fā)，但6 ℃條件下孢子囊萌發(fā)率低且前12 h未發(fā)現(xiàn)萌發(fā)，18 ℃為孢子囊萌發(fā)的最適溫度，較高或較低溫度都會使霜霉菌孢子囊的萌發(fā)力有一定程度下降。南京地區(qū)不結球白菜霜霉病高發(fā)于4月前后，這可能與18 ℃的最適溫度有關。在供試相對濕度條件范圍內，孢子囊在相對濕度為95%及以下基本不萌發(fā);相對濕度為 98%時孢子囊萌發(fā)率低，且前16 h孢子囊不萌發(fā)，至 24 h孢子囊萌發(fā)率只有2%;相對濕度為100%時孢子囊萌發(fā)率達到最大，48 h萌發(fā)率達到14.0%，這表明水分條件是孢子囊萌發(fā)的必要條件。南京及長江中下游地區(qū)3—5月多雨天氣，是霜霉病的高發(fā)期，這可能與100%的相對濕度是霜霉菌萌發(fā)最適相對濕度有關。

霜霉病是影響不結球白菜產量和品質的重要病害之一。不結球白菜霜霉菌為專性寄生菌，菌株不易保存，在一定程度上影響了不結球白菜霜霉病機理的研究。從病原物生物學特性和致病性入手對研究品種抗霜霉病發(fā)病機理具有重要意義[9]。通過接種方法的優(yōu)化，接種后葉片發(fā)病周期短、重復性好，調查快捷、易操作，能快速測定不結球白菜品種的抗病性和霜霉菌菌株的致病性。根據(jù)統(tǒng)計結果，可將品種分為高抗、抗病、中抗、感抗和高感等5類，其中多為中抗或感病品種。Cc-nj2的侵染能力最強，Cc-nj3的侵染能力最弱，這可能與菌株的使用以及采集的地域差異有關，有待進一步研究。一般認為，接種后葉片出現(xiàn)局部壞死為過敏性壞死反應，壞死斑的出現(xiàn)能夠隔離菌絲在葉片內部延伸，阻止霜霉病的進一步蔓延。

本研究明確了不結球白菜在不同環(huán)境下的生物學特性及致病性，以期為該病的發(fā)生與防治提供理論基礎與依據(jù)。雖然本試驗只對10種不結球白菜霜霉菌菌株進行研究，但選擇的菌株代表性較強，且來自不同的地區(qū)和寄主，客觀性較強，對菌株生理小種進一步鑒定具有一定的說服力。為進一步探究不結球白菜霜霉菌生理小種生物學特性和致病性差異，全國各個地區(qū)和不同氣候條件下不結球白菜霜霉病病株的收集工作必不可少。

4? ? 參考文獻

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作者簡介? ?文鍇（1990—），男，河北邢臺人，碩士，研究實習員。研究方向：蔬菜育種。

收稿日期? ?2020-07-01