煙葉衰老過程中類胡蘿卜素代謝及相關基因表達分析

文利超 吳鳳燕 李偉 郭永峰

摘??要：成熟葉片中類胡蘿卜素含量與煙葉品質密切相關。為探究煙草葉片衰老過程中類胡蘿卜素組分變化及代謝相關基因表達情況，本研究以普通煙草紅花大金元為材料，采用液相色譜法測定不同發(fā)育時期煙葉中新黃質、葉黃質和β-胡蘿卜素的含量;通過轉錄組數據分析結合實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法，分析煙草葉片衰老成熟過程中類胡蘿卜素代謝相關基因的表達變化。結果顯示，煙草進入成熟衰老期葉片中新黃質、葉黃質、β-胡蘿卜素含量逐漸降低;類胡蘿卜素合成基因、、、、、和呈現(xiàn)下調表達，類胡蘿卜素降解基因、和呈現(xiàn)上調表達，和呈現(xiàn)下調表達。類胡蘿卜素轉化基因、、呈上調表達。類胡蘿卜素合成相關轉錄因子基因、、、呈現(xiàn)下調表達，而、呈現(xiàn)上調表達。隨著煙葉成熟衰老，類胡蘿卜素合成減弱，而降解增強。研究結果為煙葉成熟衰老過程中類胡蘿卜素代謝的分子調控及針對類胡蘿卜素含量定向改良煙草品種奠定了基礎。

關鍵詞：類胡蘿卜素;轉錄組;類胡蘿卜素代謝基因;qRT-PCR;煙草

中圖分類號：S572.03 ?????????文章編號：1007-5119（2019）04-0062-07 ?? ??DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.04.010

Analysis of Carotenoid Metabolism and Related Gene Expressions during Senescence of Tobacco Leaves

WEN Lichao， WU Fengyan， LI Wei， GUO Yongfeng

（1. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China）

Carotenoid content in mature leaves is important for tobacco quality. In order to explore the changes of carotenoid components and related gene expression during tobacco leaf senescence， the contents of neoxanthin， lutein and β-carotene in the middle leaves of Honghuadajinyuan were analyzed in leaves from different developmental stages using liquid chromatography. Meanwhile， the expression of genes related to carotenoid metabolism was analyzed based on transcriptome data and quantitative real-time PCR verification. The results showed that the contents?of neoxanthin， lutein， and β-carotene in tobacco leaves gradually decreased during tobacco leaf senescence and the carotenoid synthesis genes ， ， ， ， ， ?and ?were down-regulated. The carotenoid-degrading genes ， ?and ?were up-regulated and ?and ?were down-regulated. The carotenoid converting genes ， ?and ?were up-regulated.?The transcription factors involved in the carotenoid synthesis process ， ， ?and ?were down-regulated， while ?and ?were up-regulated. The results showed that， with the aging of tobacco leaves， the synthesis of carotenoids decreased and the degradation increased. The results from this study will facilitate in depth understanding of the molecular regulation of carotenoid metabolism during the maturation and senescence of tobacco leaves?and promote genetic improvement of tobacco varieties targeting carotenoid content.

?carotenoids; transcriptome; carotenoid metabolic genes;?qRT-PCR; tobacco

類胡蘿卜素是由8個異戊二烯單位組成，主要呈現(xiàn)紅色、橙紅色和黃色的色素物質。在植物體內，其分布于葉綠體中，主要包括葉黃質（Lutein）和胡蘿卜素（Carotene）兩大類。在煙草中，類胡蘿卜素的含量與煙葉的品質密切相關，一方面類胡蘿卜素含量直接決定煙葉的外觀質量，另一方面類胡蘿卜素是煙草香氣成分的前體物質，其降解產物閾值相對較低，刺激性小，香氣質較好，是煙葉中揮發(fā)性香氣成分的主要來源。多項研究已表明，煙葉的質量與類胡蘿卜素降解產物的含量呈正相關。同時，類胡蘿卜素具有提高光合效率、抑制和清除自由基的作用，對改善煙葉品質和降低煙氣自由基傷害也具有重要意義。

類胡蘿卜素在植物體內的生物合成及轉化途徑目前已經研究比較清楚，異戊二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）依次在牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（GGPS）、八氫番茄紅素合成酶（PSY）、八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）、ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）及類胡蘿卜素異構酶（CRTISO）的作用下形成全反式番茄紅素。隨后，全反式番茄紅素經過番茄紅素ε-環(huán)化酶（LCYE）或番茄紅素β-環(huán)化酶（LCYB）催化下發(fā)生環(huán)化，分別形成α-胡蘿卜素或β-胡蘿卜素。在α-胡蘿卜素由β-環(huán)羥化酶（ECH）和ε-環(huán)羥化酶（BCH）共同催化轉化成葉黃質（Lutein）;另一分支途徑中的β-胡蘿卜素在BCH酶的兩次催化下發(fā)生羥基化反應轉化為玉米黃素（Zeaxanthin），玉米黃素環(huán)氧酶（ZEP）和新黃質合成酶（NXS）依次催化最終將玉米黃素轉化為新黃質（Neoxanthin）。

相對于類胡蘿卜素的生物合成，其降解過程的研究進展較慢。類胡蘿卜素裂解雙氧合酶（CCDs）是植物類胡蘿卜素降解代謝途徑中的關鍵酶。煙葉中CCDs通過降解不同類胡蘿卜素底物的不同雙鍵，產生不同碳原子數的化合物，最終生成多種致香物質。脂肪氧化酶（LOX）是催化類胡蘿卜素氧化降解的關鍵酶，主要催化類胡蘿卜素和1，4-二烯不飽和脂肪酸的過氧化，產生與香味有關的揮發(fā)性羰基化合物。ENZELL等研究表明，許多致香物質如：香葉醇、紫黃質、β-二氫大馬酮等均是由LOX酶催化而成。此外，宋朝鵬等研究發(fā)現(xiàn)，煙葉烘烤變黃過程中類胡蘿卜素的降解速度與多酚氧化酶（PPO）、脂氧合酶（LOX）、過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等各種酶活性具有一定的相關性。類胡蘿卜素除了降解生成各種香氣成分外，代謝途徑中間產物堇菜黃素和新黃質經9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素單加氧酶（NCED）催化形成ABA。

類胡蘿卜素的代謝途徑是一個非常復雜的過程，由多個轉錄因子共同參與其調控。在煙草中過表達葡萄R2R3-MYB轉錄因子（VvMYB5b）能夠明顯提高煙草植株β-胡蘿卜素含量。LIU等研究證明光信號傳導基因和對番茄類胡蘿卜素合成分別起著正調控和負調控作用，在RNAi轉基因番茄中，葉片的光形態(tài)發(fā)生受到一定的抑制，葉片中的類囊體數目與類胡蘿卜素合成明顯降低;而抑制基因則促進光形態(tài)發(fā)生，增加了植物體內的類胡蘿卜素含量。DAVULURI等通過RNAi技術抑制番茄果實中光敏色素基因的表達，導致果實中類胡蘿卜素含量增加。GILIBERTO等在番茄中超量表達隱花色素基因，果實中類胡蘿卜素含量明顯升高。另外，ORANGE基因在質體膜周圍發(fā)揮功能，起到類胡蘿卜素代謝庫的作用，并且，該基因在成熟葉片中表達量較高，其他組織器官相對較弱，這可能與煙葉類胡蘿卜素的積累有關。

目前，煙葉成熟衰老過程中，類胡蘿卜代謝及相關基因的表達變化規(guī)律研究尚少。本試驗以普通煙草紅花大金元為材料，分析打頂后煙葉類胡蘿卜素的含量變化;利用轉錄組分析和qRT-PCR技術對樣品類胡蘿卜素代謝相關基因表達進行定量驗證，初步明確了煙葉衰老過程中類胡蘿卜素代謝的變化規(guī)律，為煙葉成熟衰老過程中類胡蘿卜素代謝的分子調控奠定基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗試劑與材料

1.1.1 ?供試材料??普通煙草（）紅花大金元，由中國農業(yè)科學院煙草研究所種子資源中心提供。

1.1.2 ?試驗試劑??SYBR? Fast qPCR Mix、Prime?ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）等試劑均購自寶生物工程（大連）有限

公司;標準品，包括新黃質、葉黃質、β-胡蘿卜素，均為色譜純，購自日本WAKO公司;丙酮、甲醇、乙腈，均為色譜純，購自德國MERCK公司。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?樣品采集??以大田生長的普通煙草（紅花大金元）中部葉（自下而上第9～10片有效葉）作為研究對象，取樣煙株不進行采收，于打頂后15，25，35，45，55，65，75，85 d取樣，直到打頂85 d后中部葉片逐漸脫落，取樣結束。每次取樣時選擇生長狀態(tài)一致的煙株12株，每3株的同一葉位中部葉混合為一個樣本，共4次生物學重復，用于類胡蘿卜素含量測定和RNA提取。收集后的葉片用錫箔紙包裹后迅速置于液氮中速凍，?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?類胡蘿卜素含量測定??樣品前處理：煙草葉片液氮研磨至細粉末狀，冷凍干燥48 h，稱取0.05 g左右凍干粉末于2 mL的離心管中，加入1 mL 90%丙酮，超聲波萃取40 min，12000 rpm離心10 min。用1 mL注射器吸取上清液，過0.2 μm濾膜后裝入棕色進樣瓶。

色譜條件：Zorbax SB C18柱（4.6×250 mm，5 μm）;流動相∶∶=2∶14∶84;柱溫25 ℃;流速1.0 mL/min;進樣量10 μL;檢測波長：新黃質445 nm;葉黃質460 nm;β-胡蘿卜素455 nm。

1.2.3 ?類胡蘿卜素代謝相關基因轉錄組分析??采用一種高效提取煙草成熟葉片總RNA的方法提取各時期葉片總RNA，并送至華大公司進行轉錄組測序分析。以15 d作為對照，后續(xù)時間點與15 d進行兩兩比較。以|log 2 Ratio|≥1.0和FDR≤0.001為篩選標準，獲得煙草葉片衰老過程中上調基因集和下調基因集。

在NCBI數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索與類胡蘿卜素代謝相關的蛋白序列，在中國煙草基因組數據庫中進行比對（未公開發(fā)表），提取相似率在90%以上的基因ID;用比對上的ID號從實驗室已有的轉錄組數據中選擇差異表達（|log 2 Ratio|≥1，≤0.05）ID號（表1），利用熱圖繪制軟件GPS，Heml繪制基因表達熱圖。

1.2.4 ?類胡蘿卜素代謝基因qRT-PCR驗證??參照寶生物RNAiso Plus試劑盒說明書提取煙草葉片總RNA，利用PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（寶生物）進行反轉錄獲得cDNA。

選取打頂后15 d（未衰老葉片）、45 d（衰老早期葉片）、65 d（衰老中期葉片）和75 d（衰老晚期葉片）4個代表性時期的煙草葉片cDNA為模板，利用Premier Prime 5.0軟件設計類胡蘿卜素代謝相關基因的qRT-PCR引物（表1），ABI7500型實時熒光定量PCR儀進行SYBR GREEN I Real-Time PCR反應，以看家基因為內參，相應基因在打頂后15 d的表達量為單位1，采用2?ΔΔCt法計算該基因在45、65和75 d的相對表達量，SPSS 22.0進行方差分析。

2 ?結??果

2.1 ?煙草不同發(fā)育時期葉片中類胡蘿卜素含量

由圖1可以看出，煙草成熟衰老過程中，葉片中類胡蘿卜素各組分呈現(xiàn)下降趨勢，包括新黃質、葉黃質、β-類胡蘿卜素;衰老后期（75～85 d時），新黃質含量下降最明顯，從15 d的0.105 mg/g下降到0.005 mg/g，85 d與15 d相比含量下降了95%;葉黃質在15 d時含量為0.812 mg/g，85 d時含量為0.113 mg/g，85 d和15 d相比含量下降了86%;β-類胡蘿卜素在15 d時含量為1.060 mg/g，85 d時含量為0.133 mg/g，85和15 d相比含量下降了87%。以上結果顯示葉片中類胡蘿卜素含量隨著煙葉成熟衰老逐步降低。

2.2 ?葉片衰老時期類胡蘿卜素代謝基因轉錄組數據分析

在本試驗中，共檢索到26個類胡蘿卜素代謝相關基因（圖2），涉及類胡蘿卜素合成、轉化、降解以及調控等過程。圖2顯示，隨著煙葉成熟衰老，類胡蘿卜素合成上游基因、、、和在整個衰老時期均下調表達，其中下調最明顯，在85 d時表達量比15 d下降了91%，PSY在65 d時表達量下調到15 d的1/5，、和在衰老葉片中的表達量下降到15 d的1/2左右;類胡蘿卜素合成途徑下游相關基因、下調表達，在65 d時表達量約降低到15 d的30%，和衰老后期略微上調;與類胡蘿卜素轉化相關的基因、、上調表達，其中的表達量上升最明顯，65 d后表達量上調65倍，在55 d之后表達量上調4.31倍，逆轉化基因在85 d之前略微下調。類胡蘿卜素降解相關基因分別是、、、和，其中和在衰老過程上調表達，上調2.55倍，上調36.68倍，而、和下調表達。參與類胡蘿卜素代謝的轉錄因子較多，包括、、、、、及其同源基因，其中、上調表達，上調最明顯，表達量提高4.52倍，下調基因有、、和。圖2中基因表達變化說明類胡蘿卜素代謝是通過多個基因協(xié)同調控實現(xiàn)的，相關基因表達變化趨勢同

2.3 ?葉片衰老時期類胡蘿卜素代謝基因qRT-PCR分析

qRT-PCR分析表明（表2），類胡蘿卜素代謝上游合成基因在葉片衰老過程中下調表達，65?d時表達量下調至0.74倍，基因在45?d時上調表達，45?d后該基因表達量明顯下降。下游合成基因、下調表達，75 d時表達量分別下降至15?d的0.50倍和0.21倍;類胡蘿卜素轉化基因、、呈現(xiàn)上調表達，在65?d時表達量分別上調9.20、3.25和3.21倍，而在整個衰老時期下調表達，在75?d時下調至15?d的0.32倍。其中，類胡蘿卜素轉化為ABA的關鍵基因明顯上調，表明衰老葉片中類胡蘿卜素正在積極地轉化為ABA，從而促使葉片衰老過程的持續(xù)進行。另外，類胡蘿卜素降解基因表達量在45?d后明顯下降，而與基因上調顯著，75 d時分別上調3.9倍和18.09倍。調節(jié)類胡蘿卜素合成的轉錄因子HY5、COP1、DET1在煙葉衰老過程中表達量呈現(xiàn)下調趨勢。其中COP1和DET1下調最明顯，75 d時表達量分別下降到15?d的0.45倍和0.38倍。而表達量在衰老葉片中上調表達，65?d時表達量上調至15?d的7.55倍。定量分析結果與轉錄組分析結果基本一致，這說明轉錄組測序結果能夠反映類胡蘿卜素代謝相關基因在衰老過程中的表達情況。

3 ?討??論

類胡蘿卜素降解是煙草葉片衰老過程的重要過程。本研究表明，類胡蘿卜素在煙葉衰老過程中是逐漸降低的，類胡蘿卜素合成途徑上游基因、、、、在煙葉進入衰老期后呈現(xiàn)下調表達，這與測定的類胡蘿卜素含量下降數據一致。和作為合成支路上的兩個關鍵酶基因對代謝途徑物質流走向和類胡蘿卜素組分的變化起著重要作用。全反式番茄紅素在LYCE酶催化下生成δ-胡蘿卜素，隨后在LYC及ECH/BCH酶催化下生成終產物葉黃質，衰老轉錄組數據和定量驗證結果顯示，表達量在65 d后明顯下調，而該分支下游酶基因/在衰老后期表達變化不明顯，這進一步說明基因在衰老過程中的下調表達是衰老葉片中葉黃質含量降低的主要原因。另一分支途徑中，催化

全反式番茄紅素生成β-類胡蘿卜素，定量數據顯示，基因在煙葉衰老過程中呈現(xiàn)持續(xù)下調的表達模式，且該基因下調速度明顯大于，這與煙葉衰老過程中β-類胡蘿卜素含量下降比葉黃質含量下降速度快的結果相吻合。上述結果表明和基因表達的相對強弱對下游途徑中δ-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素相關產物的積累起著決定性的作用。

ABA是促進葉片衰老的重要激素，可以調節(jié)植物對于非生物逆境的適應能力。在類胡蘿卜生物合成途徑中，ABA是由分支途徑催化的最終產物，玉米黃質經過ZEP、NXS、NCED 3個關鍵酶一步步催化合成ABA。其中，NCED作為關鍵限速酶直接調控內源ABA含量，在衰老過程中上調最為顯著。ZEP除了在ABA生物合成途徑中發(fā)揮著重要作用外，還在葉片、莖等葉綠體含量比較豐富的組織中參與植物的葉黃素循環(huán)。此外，在植物的特定生長發(fā)育階段以及種子等非光合器官中，的表達水平同樣限制著ABA的合成。衰老轉錄組數據和定量驗證結果顯示，該途徑關鍵酶基因、、在煙葉進入衰老期后均呈現(xiàn)上調表達。類胡蘿卜素代謝途徑中間產物新黃質和β-類胡蘿卜素作為ABA的前體被大量消耗，再加上上游基因的下調表達，使新黃質和β-類胡蘿卜素含量大大降低。

在類胡蘿卜素的降解代謝中、、均有十分重要的作用，其中基因是催化類胡蘿卜素降解產生的醛類與酮類物質的關鍵基因，降解的產物有香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、β-環(huán)檸檬醛等，能夠改善煙葉的品質。本試驗也表明，在煙葉衰老過程中，類胡蘿卜素降解基因、、均呈現(xiàn)上調表達。

本試驗結合轉錄組數據及qRT-PCR驗證分析，研究了煙葉衰老過程中類胡蘿卜素的合成、轉化和降解過程中關鍵基因的表達變化規(guī)律，如何在分子水平上對類胡蘿卜素代謝進行調控，提高煙葉香氣質和香氣量，應作為今后煙葉致香物質研究的重點。

4 ?結??論

研究表明，煙草葉片衰老過程中新黃質、葉黃質、β-類胡蘿卜素含量不斷下降。類胡蘿卜素合成相關基因在煙葉衰老過程中下調表達，包括、、、以及/;催化煙葉中類胡蘿卜素轉化為ABA的合成代謝基因表達量增加，包括、、;與類胡蘿卜素降解相關的基因、、表達上調。類胡蘿卜素代謝途徑中的轉錄因子基因，上調最明顯，、下調表達。本研究結果為通過分子手段調控類胡蘿卜素代謝過程改良煙葉品質、選育優(yōu)良品種提供了一定的理論參考。

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