補腎活血通竅湯對慶大霉素耳中毒豚鼠聽性腦干反應閾值的影響及機制研究

張珂 劉帥軍 李紅娟

摘要 目的：探討補腎活血通竅湯對慶大霉素耳中毒豚鼠聽性腦干反應（ABR）閾值的影響及機制。方法：將50只豚鼠隨機分為空白組、模型組和高/中/低劑量實驗組，每組10只。模型組和實驗組每日腹腔注射硫酸慶大霉素100 mg/kg構(gòu)建慶大霉素耳中毒模型，空白組每日腹腔注射生理鹽水25 mL/kg，同時高/中/低劑量實驗組分別灌胃高/中/低劑量補腎活血通竅湯（含生藥量2.40、0.50、0.10 mg/mL）0.8 mL/只，模型組和空白組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)干預10 d。干預結(jié)束后檢測各組豚鼠ABR閾值;蛋白免疫印跡法（WB）及免疫組化染色觀察各組豚鼠耳蝸組織自噬相關蛋白及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表達情況。結(jié)果：造模后，與空白組比較，模型組豚鼠ABR閾值、耳蝸組織LC3、Beclin1蛋白表達量及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞、毛細胞及血管紋中Caspase-3蛋白表達量升高（P<0.05）;補腎活血通竅湯干預結(jié)束后，與模型組比較，中/高劑量實驗組ABR閾值及耳蝸組織LC3、Beclin1蛋白表達量及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞、毛細胞及血管紋中Caspase-3蛋白表達量降低（P<0.05），低劑量實驗組上述各項指標無明顯變化（P>0.05）。結(jié)論：補腎活血通竅湯可對慶大霉素耳中毒損傷起到保護作用，其機制與抑制耳蝸細胞自噬及凋亡程序的發(fā)生有關。

關鍵詞 補腎活血通竅湯;耳蝸;慶大霉素;聽性腦干反應;細胞自噬;凋亡

Abstract Objective：To explore the effects and mechanism of Bushen Huoxue Tongqiao Decoction on auditory brainstem response（ABR）threshold of guinea pigs with gentamycin ototoxicity.Methods：A total of 50 guinea pigs were randomly divided into a blank group，a model group and high/medium/low-dose（H/M/L-dose）experiment groups，with 10 in each group.The model group and the experimental groups were established gentamycin ototoxicity model by intraperitoneal injection of gentamycin sulfate 100 mg/kg daily，and the blank group received intraperitoneal injection of normal saline 25 mL/kg daily.Meanwhile，the H/M/L-dose experiment groups were respectively given intragastric administration of high/medium/low dose of Bushen Huoxue Tongqiao Decoction（containing raw medicine dose of 2.40，0.50 and 0.10 mg/mL）with 0.8 mL for each one.The model group and the blank group were given intragastric administration of the same amount of normal saline.The continuous intervention lasted for 10 d.After the intervention，the ABR threshold of each guinea pig was detected; and the expression of autophagy related protein and cysteine aspartic proteinase-3（Caspase-3）protein in the cochlear tissues of the guinea pigs were observed by Western blotting（WB）and immunohistochemical staining.Results：After the modeling，when compared with the blank group，the ABR threshold，the expression of LC3 and Beclin1 protein in the cochlear tissue and the expression of Caspase-3 protein in the spiral ganglion cells，hair cells and stria vascularis of the guinea pigs in the model group were increased（P<0.05）.After the intervention of Bushen Huoxue Tongqiao Decoction，when compared with the model group，the ABR threshold，the expression of LC3 and Beclin1 protein in the cochlear tissue and the expression of Caspase-3 protein in the spiral ganglion cells，hair cells and stria vascularis in the M and H-dose experiment groups were decreased（P<0.05）.And there was no significant difference in the above indexes of the L-dose experiment group（P>0.05）.Conclusion：Bushen Huoxue Tongqiao Decoction can play a protective role in the damage of gentamicin ototoxicity，and the mechanism is related to the inhibition of autophagy and apoptosis in cochlear cells.

Key Words Bushen Huoxue Tongqiao Decoction; Cochlea; Gentamicin; Auditory brainstem response; Autophagy; Apoptosis

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.023

感音神經(jīng)性耳聾是耳鼻喉科常見病，包括噪聲性聾、藥物性聾、突發(fā)性聾等多種疾病類型。感音神經(jīng)性耳聾的發(fā)生與機體氧自由基、外界機械力及鈣超載等導致聽覺感受器損害有關[1-2]。目前臨床常規(guī)藥物治療急性期感音性耳聾雖可改善聽力，延緩聽力下降，但效果有限，因此人們開始尋找新的藥物和治療方法。中醫(yī)認為聾屬于聽力減退癥，其發(fā)生機制多由腎精虧損、肝火上擾、氣滯血癖所致，多屬腎虛血瘀證，采用補腎活血中藥治療可使耳鳴患者腎氣充足、精氣調(diào)和、耳竅之氣行血活，效果顯著，但目前關于中藥治療的作用機制的研究尚不充分[3-4]。因此本研究通過構(gòu)建慶大霉素耳中毒豚鼠模型，觀察中藥補腎活血通竅湯對模型動物的聽力改善情況，并初步研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康成年純白紅目豚鼠50只，雄性，體質(zhì)量（250±25）g，購于中國醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（遼）2007-0003。

1.1.2 藥物 補腎活血通竅湯（方為：黃芪、丹參、熟地黃各15 g，骨碎補、淫羊藿、當歸、川芎、石菖蒲各10 g，磁石20 g，水蛭1 g）;鹽酸氯胺酮注射液（長春長紅制藥有限公司，批號：KH080403）;硫酸慶大霉素注射液（山東恩威藥業(yè)有限公司，批號：150881507）;LC3、Beclin1及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體（購于美國Santa Cruz公司），美國Santa Cruz公司等。

1.1.3 試劑與儀器 DS-425P電子天平，上海寺崗電子有限公司;Allegra 64R高速冷凍離心機，美國Beckman Coulter有限公司;VIASYS腦干誘發(fā)電位儀，美國GSI公司;CKX-31熒光倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司;725型紫外可見分光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司;Mini Protean3Cell小型垂直電泳儀，北京富瑞恒創(chuàng)科技有限公司;Motic DigiClass/DigiLab 1.2圖像分析軟件，麥克奧迪（廈門）醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 根據(jù)體質(zhì)量將豚鼠隨機分為空白組、模型組和高/中/低劑量實驗組，每組10只。空白組每日腹腔注射生理鹽水25 mL/kg，模型組和高/中/低劑量實驗組每日腹腔注射硫酸慶大霉素100 mg/kg，同時高/中/低劑量實驗組灌胃高/中/低劑量補腎活血通竅湯（分別含生藥量2.40、0.50、0.10 mg/mL）[5]0.8 mL/只，模型組和空白組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)干預10 d。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 各組豚鼠聽性腦干反應（ABR）閾值的檢測

藥物干預結(jié)束后，各組豚鼠腹腔麻醉后，耳機置入外耳道，記錄電極放置于顱頂中點處顱骨中，參考電極及地線分別置于給聲耳及對側(cè)耳突部皮下。刺激聲為疏密相交替的次/秒的短聲，帶通濾波50～3 000 Hz，疊加1 024次，掃描時程20 ms，測試強度從80 dB nHL開始，10 dB為1檔逐級下降進行測試，以能引出Ⅲ波的最小聲強確定反應閾，每只豚鼠測量3次后取平均值定為ABR閾值。

1.2.2.2 蛋白免疫印跡法（WB）檢測各組豚鼠耳蝸組織細胞自噬相關蛋白表達情況

將各組豚鼠斷頭處死，迅速取出聽泡，暴露耳蝸，小心剝除蝸殼，將蝸內(nèi)組織及蝸軸取出，加入裂解液后高速勻漿粉碎后冰上裂解30 min，將組織蛋白經(jīng)BCA法定量后，取50 μg進行常規(guī)WB檢測，以β-actin為參照，經(jīng)GIS-1000數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)分析各組細胞自噬向相關蛋白LC3表達情況。

1.2.2.3 免疫組化染色觀察各組豚鼠耳蝸組織中Caspase-3蛋白表達情況

耳蝸取出后，于蝸頂鉆孔，與蝸內(nèi)緩慢注射多聚甲醛磷酸緩沖液，并于該固定液中4 ℃固定24 h，第2天將其放入乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液中脫鈣7 d，用石蠟包埋后制成切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶后，采用免疫組化法檢測組織中Caspase-3蛋白表達情況，最后于光學顯微鏡下判定染色結(jié)果，陽性著色為細胞膜或細胞漿棕黃及棕褐色，采用Motic DigiClass/DigiLab 1.2圖像分析軟件計算各組豚鼠耳蝸組織中Caspase-3表達平均灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析上述指標，均數(shù)±標準差（±s）表示計量資料，采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 補腎活血通竅湯對各組豚鼠ABR閾值的影響

與空白組比較，模型組豚鼠ABR閾值升高（P<0.05），與模型組比較，中/高劑量實驗組ABR閾值降低（P<0.05），低劑量實驗組和模型組ABR閾值無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 補腎活血通竅湯對豚鼠耳蝸組織自噬相關蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組豚鼠耳蝸組織LC3、Beclin1蛋白表達量升高（P<0.05），與模型組比較，中/高劑量實驗組耳蝸組織LC3、Beclin1蛋白表達量降低（P<0.05），低劑量實驗組和模型組耳蝸組織LC3、Beclin1蛋白表達量無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1。

2.3 補腎活血通竅湯對豚鼠耳蝸組織中Caspase-3蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組豚鼠耳蝸組織螺旋神經(jīng)節(jié)細胞、毛細胞及血管紋中Caspase-3蛋白表達量升高（P<0.05）;與模型組比較，中/高劑量實驗組耳蝸組織螺旋神經(jīng)節(jié)細胞、毛細胞及血管紋中Caspase-3蛋白表達量降低（P<0.05），低劑量實驗組和模型組耳蝸組織中Caspase-3蛋白表達量無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

3 討論

內(nèi)耳毛細胞的丟失或損傷是引起感音神經(jīng)性耳聾的主要原因，耳蝸毛細胞缺血缺氧，活性氧大量堆積后，導致內(nèi)耳骨迷路的微血管產(chǎn)生內(nèi)皮素-1（ET-1）[6]。研究[7]顯示，ET-1可以增強血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）及血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的活性，作為強烈的縮血管物質(zhì)，ACE及AngⅡ協(xié)同作用使內(nèi)耳缺血加重，同時ET-1可加速細胞內(nèi)鈣離子（Ca2+）釋放，促進Ca2+通道開放及內(nèi)流，造成細內(nèi)鈣超載，進而導致內(nèi)耳毛細胞損傷及死亡。本研究參照Oishi N等[8]慶大霉素豚鼠耳毒性造模過程，選用體質(zhì)量較大的雄性豚鼠，前期預實驗結(jié)果顯示，給予慶大霉素100 mg/kg、連續(xù)腹腔注射10 d，耳聾模型建立成功。本研究結(jié)果中也同樣顯示出，與空白組比較，造模后模型組豚鼠ABR閾值升高。

藥物中毒性聾屬中醫(yī)耳聾范疇，中醫(yī)學治療耳聾具有悠久的歷史，耳屬腎，耳與腎關系頗為密切。中醫(yī)認為腎開竅于耳，腎之精氣充沛，耳得所養(yǎng)則聽覺聰敏，腎元虧虛則耳竅失養(yǎng)，聽力失聰[9]。《證治匯補·卷四》曰：“腎開竅于耳，因肺主氣，一身之氣貫于耳故也”，外邪犯肺，肺氣閉郁，鼻竅不通，咽鼓管不通，則耳失聰敏?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》記載：“腎開竅于耳，腎和則耳能聞五音”，腎主骨生髓，髓海和腎精不足，可引起耳聾，肝失所養(yǎng)致肝氣郁結(jié)。若藥毒致腎元虧虛，濁邪內(nèi)犯則耳竅失養(yǎng)，久而竅絡閉阻，成血瘀證。因此治療當以通耳竅、補肝腎，兼活血化瘀為治[10]。符國慶等[11]根據(jù)中醫(yī)理論對110例突發(fā)性耳聾患者采用中藥龍膽瀉肝湯和葛根方治療，效果顯著，患者血流變學指標得以改善，耳鳴分級改善也優(yōu)于單純常規(guī)西藥治療。本研究所用的補腎活血通竅湯，方中熟地黃、骨碎補、淫羊藿益腎填精，當歸、黃芪養(yǎng)血活血，川芎、丹參、活血化瘀通絡，石菖蒲、水蛭開竅行氣，磁石鎮(zhèn)納浮陽安神，聰耳通竅[12]。全方可發(fā)揮益腎填精、開竅通絡、行氣活血的功效。本研究對實驗組豚鼠分別灌胃不同濃度的補腎活血通竅湯，干預10 d后結(jié)果顯示，與模型組比較，中/高劑量實驗組ABR閾值降低，表明慶大霉素耳中毒豚鼠聽力經(jīng)補腎活血通竅湯干預后聽力改善顯著。

當外部刺激持續(xù)存在時，細胞將發(fā)生凋亡、自噬和壞死。大量研究[13]已表明，感音神經(jīng)性耳聾存在著內(nèi)耳毛細胞的凋亡。Caspase-3處于凋亡有序級聯(lián)反應的下游，是細胞凋亡的關鍵執(zhí)行者。自噬是細胞的一種防御和應激，可以成為細胞應激條件下的一種保護反應，使細胞維持自身微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，LC3-Ⅱ是自噬體的標志分子，定位于自噬體膜上，對自噬小體的形成起著至關重要的作用[14]。本研究結(jié)果表明，模型組豚鼠耳蝸細胞自噬蛋白LC3、Beclin1水平及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞、毛細胞及血管紋中Caspase-3蛋白表達量升高，表明慶大霉素會造成耳蝸細胞凋亡及自噬性死亡，補腎活血通竅湯保護性用藥后，中/高劑量實驗組豚鼠耳蝸細胞自噬蛋白LC3、Beclin1水平及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞、毛細胞及血管紋中Caspase-3蛋白表達量又發(fā)生降低，表明補腎活血通竅湯可以抑制慶大霉素耳中毒豚鼠耳蝸組織凋亡及自噬現(xiàn)象的發(fā)生。

綜上所述，補腎活血通竅湯對于因慶大霉素造成的感音神經(jīng)性耳聾具有一定的保護作用，且與藥物呈現(xiàn)濃度依賴性，其通過抑制自噬及凋亡的發(fā)生來減輕耳蝸細胞損傷，減少聽力損失，可作為治療感音神經(jīng)性耳聾的潛在藥物。

參考文獻

[1]陳彩鳳，陳淑慧，廖月紅，等.電針配合中藥穴位注射治療感音神經(jīng)性耳聾的效果及機制[J].廣東醫(yī)學，2016，37（13）：2021-2024.

[2]劉錦峰，戴金升，王寧宇.人工耳蝸植入對單側(cè)感音神經(jīng)性聾患者聲源定位的影響[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2016，51（8）：623-630.

[3]周雅婷，林炎龍，何揚子.針刺輔助治療感音神經(jīng)性耳聾的病例對照研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2017，37（2）：250-251.

[4]陳家麟.補腎活血在老年性耳聾患者治療中的應用[J].醫(yī)療裝備，2016，29（11）：156-157.

[5]祁青，孫勤國，江波.補腎活血化痰湯聯(lián)合針刺治療老年性神經(jīng)性耳鳴的臨床觀察[J].湖北中醫(yī)雜志，2013，35（12）：40-41.

[6]王明明，韓月臣，陳成芳，等.急性低頻感音神經(jīng)性聾預后相關因素分析[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2016，51（9）：644-649.

[7]Baldwin M，Watkin P.Predicting the degree of hearing loss using click auditory brainstem response in babies referred from newborn hearing screening[J].Ear Hear，2014，34（3）：1-9.

[8]Oishi N，Kendall A，Schacht J.Metformin protects against gentamicin-induced hair cell death in vitro but not ototoxicity in vivo[J].Neuroscience Letters，2014，583（7）：65-69.

[9]唐愛華.通竅活血湯加減聯(lián)合針灸辨治氣滯血瘀證突發(fā)性耳聾患者的臨床研究[J].中醫(yī)藥學報，2016，44（6）：78-81.

[10]吳飛虎，朱丹華.通竅活血湯聯(lián)合腦蛋白水解物治療氣滯血瘀型突發(fā)性耳聾的臨床觀察[J].中成藥，2017，21（1）：228-230.

[11]符國慶，王翔，李淑芳，等.龍膽瀉肝湯合葛根方輔助治療突發(fā)性耳聾[J].中國實驗方劑學雜志，2016，43（13）：169-172.

[12]王蘋.自擬益氣補腎活血通竅湯治療神經(jīng)性耳鳴22例療效觀察[J].臨床合理用藥雜志，2013，6（22）：44-44.

[13]Lin C F，Lee K J，Yu S S，et al.Effect of comorbid diabetes and hypercholesterolemia on the prognosis of idiopathic sudden sensorineural hearing loss[J].Laryngoscope，2016，126（1）：142-149.

[14]Blagonravov M L，Korshunova A Y，Azova M M，et al.Cardiomyocyte Autophagia and Morphological Alterations in the Left Ventricular Myocardium during Acute Focal Ischemia[J].Bulletin of Experimental Biology & Medicine，2016，160（3）：398-400.

（2018-12-05收稿 責任編輯：徐穎）