基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的有關(guān)苓桂術(shù)甘湯干預(yù)治療心力衰竭的作用機制

謝璇 王青 蘇聰平

摘要 目的：根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法尋找苓桂術(shù)甘湯治療心血管疾病的潛在靶點。方法：從在線的中醫(yī)藥生物信息學(xué)分析網(wǎng)站（BATMAN-TCM）篩查和預(yù)見苓桂術(shù)甘湯干預(yù)心力衰竭的可能的有效成分及其作用于心力衰竭的靶點。使用Cytoscape軟件建立苓桂術(shù)甘湯以及其中所含的單味藥針對心力衰竭的靶點-成分網(wǎng)絡(luò)圖。采取韋恩圖（Venny 2.1）進一步研究苓桂術(shù)甘湯中茯苓及甘草治療心力衰竭的機制。結(jié)果：我們從結(jié)果里發(fā)現(xiàn)苓桂術(shù)甘湯在治療心力衰竭方面有79個活性成分，有18個靶點與心力衰竭是相關(guān)的，且檢索到的靶點和有效成分有緊密的關(guān)系，找到的18個靶點主要是：ACE;ADRA2A;ADRA2B等。甘草在苓桂術(shù)甘湯中的靶點數(shù)最多，占全方治療心力衰竭總靶點數(shù)的94.4%。結(jié)論：苓桂術(shù)甘湯改善心力衰竭的機制可能與降低AngⅡ、抑制RAS的活性、調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)等具有相關(guān)性，其中甘草在治療心力衰竭方面是苓桂術(shù)甘湯中最突出藥物。

關(guān)鍵詞 苓桂術(shù)甘湯;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);茯苓;甘草;心力衰竭;靶點

Abstract Objective：To explore the potential targets of Linggui Zhugan Decoction for the treatment of heart failure by using network pharmacology.Methods：A bioinformatics analysis website for traditional Chinese medicine（BATMAN-TCM）was used to predict and screen the possible active components of Linggui Zhugan Decoction in the intervention of heart failure and its targets for heart failure.The Cytoscape software was used to construct a target-component network for the treatment of heart failure with Linggui Zhugan Decoction and its single medicines.Venn diagram（Venny 2.1）was used to further study the mechanism of Poria and Radix et Rhizoma Glycyrrhizae of Linggui Zhugan Decoction in the treatment of heart failure.Results：A total of 79 active components in the Linggui Zhugan Decoction were screened out from the results.There were 18 targets associated with heart failure，and the active components and targets were closely related.The 18 targets obtained mainly included：ACE; ADRA2A; ADRA2B and so on.The target number of Radix et Rhizoma Glycyrrhizae in Linggui Zhugan Decoction was the largest that it accounted for 94.4% of the total targets of the decoction in the treatment for heart failure.Conclusion：The mechanism of Linggui Zhugan Decoction in improving heart failure may be related to the decrease of AngII，the inhibition of RAS activity，and the regulation of sympathetic nervous system，etc.Among which，Radix et Rhizoma Glycyrrhizae is the most prominent in the aspect of Linggui Zhugan Decoction in treating heart failure.

Key Words Linggui Zhugan Decoction; Network pharmacology; Poria; Radix et Rhizoma Glycyrrhizae; Heart failure; Target

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.011

苓桂術(shù)甘湯出自張仲景《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治》：“心下有痰飲，胸脅支滿，目眩，苓桂術(shù)甘湯主之”。“夫短氣有微飲，當(dāng)從小便去之，苓桂術(shù)甘湯主之;腎氣丸亦主之”。及《傷寒論》原文“傷寒若吐若下后，心下逆滿，氣上沖胸，起則頭眩，脈沉緊，發(fā)汗則動經(jīng)，身為振振搖者，茯苓桂枝白術(shù)甘草湯主之”。該方具有溫陽化飲，健脾利濕之功效的臨床常用方劑。茯苓具有淡滲利濕的功效，可以驅(qū)遂飲邪自小便而出，因利而去，故為君藥。桂枝通陽化氣，使飲邪從汗而解，又兼有平?jīng)_降逆之功，故以為臣，與茯苓相配伍，一利一溫，對于寒性的水飲停滯者，有溫化滲利的優(yōu)點。濕生于脾，脾虛則濕氣漸起，白術(shù)燥濕健脾，助脾運化，使脾陽盛而水濕自去，佐茯苓還可以消痰以除支滿。甘草補中，佐桂枝培育土氣以制水邪，四藥合用共奏飲去脾和，濕不復(fù)起之功效。可用于治療痰飲病，短氣，眩暈，心悸，胃口差，耳鳴，耳聾，美尼爾氏綜合征，心臟病中有心絞痛、水腫、喘咳、漏尿、各種神經(jīng)官能癥、慢性腎小球腎炎等多種疾病。其在應(yīng)用上加減化裁很靈活，治病范圍也很廣泛，臨床只要運用得當(dāng)，效果非常好。

慢性心力衰竭（Chronic Heart Failure，CHF）指由多種情況所導(dǎo)致的心肌損傷造成心臟功能結(jié)構(gòu)的該百年，致使充盈功能低下導(dǎo)致心室泵血以至射血量不足，達不到器官及組織代謝所需要的血量的一種復(fù)雜的臨床綜合征，是一種臨床多發(fā)病、常見病，是多種心血管疾病的最后結(jié)局。心力衰竭患者在尋求西醫(yī)的治療過程中會產(chǎn)生大量的金錢花費、療效確有可能不是十分顯著，并且由于經(jīng)濟原因，一部分患者往往不能遵從醫(yī)生的指導(dǎo)用藥，私自的減藥，這對于疾病的治療是十分不利的，因此我們需要在中醫(yī)領(lǐng)域探尋治療心功能衰竭的方法，達到在臨床上愈發(fā)頻繁的運用中醫(yī)經(jīng)典方劑的效果。自研究開始以來有許多關(guān)于苓桂術(shù)甘湯治療心血管疾病的結(jié)果，苓桂術(shù)甘湯也從一個簡單的經(jīng)方轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床常用的治療高血壓、冠心病、心律失常、CHF等疾病方劑[1-7]。施慧等[8]運用苓桂術(shù)甘湯的含藥血清，在大鼠原代心肌細胞上用脂多糖來誘導(dǎo)并觀察IKK/IκB/NF-κB信號通路上相關(guān)蛋白表達，結(jié)果表明苓桂術(shù)甘湯通過對下游靶分子的轉(zhuǎn)錄進行干預(yù)，可以有效的調(diào)節(jié)IKK/IκB/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達，進一步達到減弱細胞因子的過度激活的目的。此外，苓桂術(shù)甘湯能明顯降低CHF大鼠血清IL-1β、ET-1、TNF-α和AngⅡ水平，抑制大鼠心室重構(gòu)，大大提高CHF大鼠心臟舒縮能力的作用，還能使采用多柔比星造模的心力衰竭大鼠的心臟功能，結(jié)果顯示苓桂術(shù)甘湯具有抗多柔比星所造成的心肌毒性作用，其機理可能是抑制脂肪酸氧化以及AMPK活化[9-10]。然而，中藥方劑中具有多種復(fù)雜的化學(xué)成分以及其治療疾病的多樣化，導(dǎo)致在心力衰竭方面苓桂術(shù)甘湯的具體作用原理目前還是不明朗，所以我們采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方式深入發(fā)掘苓桂術(shù)甘湯主要的活性成分以及所對應(yīng)的作用靶點并通過Cytoscape軟件研究其與病種間的相關(guān)性，從而將苓桂術(shù)甘湯干預(yù)治療心力衰竭的作用機制完整的有條理的梳理出來，這對未來治療心力衰竭具有深遠意義[11]。

1 材料與方法

1.1 靶點及其相對的有效成分的預(yù)測挖掘 在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中尋找苓桂術(shù)甘湯治療心力衰竭的潛在靶點，進入BATMAN-TCM服務(wù)器（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm），分別輸入苓桂術(shù)甘湯主要靶點，取得分別的靶點相對的有效成分選擇的結(jié)果，應(yīng)用得到的具體數(shù)據(jù)進行分析[12]。通過系統(tǒng)解讀疾病與靶點之間的關(guān)系連接，BATMAN-TCM可以針對活性成分與目的靶點之間的關(guān)聯(lián)性進行評判（Score）。應(yīng)用統(tǒng)計分析方法，采用最優(yōu)的衍算方法得到苓桂術(shù)甘湯治療疾病的有意義的P值。之后我們選擇苓桂術(shù)甘湯所治療的疾病種有統(tǒng)計學(xué)意義的。以P<0.05作為“通路-藥物”結(jié)構(gòu)構(gòu)建的基本要求。以Score cut off=20為基線，得到苓桂術(shù)甘湯治療心力衰竭的具有統(tǒng)計學(xué)意義的分析報告，以及其所對應(yīng)的靶點，并且得到活性成分的結(jié)果。

1.2 有效成分和靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 根據(jù)得到的活性成分與可能的靶點，我們采用Cytoscape軟件，利用關(guān)聯(lián)功能（Merge）建立一個藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。在生成的網(wǎng)絡(luò)圖里，線代表化合物-靶點的相互作用，節(jié)點代表化合物和靶點。

1.3 茯苓與甘草靶點分析 苓桂術(shù)甘湯重用茯苓為君，甘草雖為佐使藥卻有不可替代的意義?！夺t(yī)宗金鑒》：“《靈樞》謂心胞絡(luò)之脈動則病胸脅支滿者，謂痰飲積于心胞，其病則必若是也。目眩者，痰飲阻其胸中之陽，不能布津于上也。茯苓淡滲，遂飲出下竅，因利而去，故用以為君。桂枝通陽輸水走皮毛，從汗而解，故以為臣。白術(shù)燥濕，佐茯苓消痰以除支滿。甘草補中，佐桂枝建土以制水邪也。在BATMAN-TCM中尋找君藥茯苓和佐使藥甘草治療心力衰竭的靶點。使用韋恩圖（Venn diagram）深入探索茯苓與甘草治療心力衰竭的不同作用機理。

2 結(jié)果

2.1 在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中，檢索苓桂術(shù)甘湯干預(yù)治療心力衰竭的靶點，發(fā)現(xiàn)苓桂術(shù)甘湯治療心力衰竭的靶點共18個，如表1所示，（其中治療心力衰竭靶點為14個，另外含有充血性心力衰竭靶點6個，ADRBK1;TNF為兩者共有靶點，）是苓桂術(shù)甘湯治療心力衰竭有效靶點，與心力衰竭的典型信號通路相一致（P<0.05）。

2.2 檢索苓桂術(shù)甘湯的有效成分 在BATMAN-TCM中我們檢索出苓桂術(shù)甘湯中共有178個化合物，茯苓含54種化合物、桂枝含32種化合物、白術(shù)含26種化合物、甘草含172種化合物。通過人工檢索得到79個苓桂術(shù)甘湯干預(yù)治療心力衰竭的靶點所對應(yīng)的化合物。在表2中，若某些靶點對應(yīng)的靶成分多于3個，則只寫出其對應(yīng)的前3個成分，這里包括木質(zhì)素、有機酸、生物堿、皂苷及萜類等（P<0.05）。而后，分別將18個心力衰竭靶點輸入單味藥檢索中，得到各個藥治療心力衰竭做出貢獻的相關(guān)成分，在表3中，若有某些靶點具有多于3個靶成分，則只列出排名前3的成分（P<0.05）。

2.3 活性成分-作用靶點的網(wǎng)絡(luò)模型的建立及解析采用Cytoscape軟件建立在衰竭方面，苓桂術(shù)甘湯中有效成分-作用靶點的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)示意圖。在圖1中我們可以看出，在治療心力衰竭方面的18個潛在靶點分別對應(yīng)79個活性成分，多種的有效的成分對應(yīng)同一個的靶點，也可以對應(yīng)不同的靶點，這全面展示出苓桂術(shù)甘湯在治療心力衰竭種的多靶點、多成分的作用原理。

2.4 茯苓與甘草靶點解析 利用韋恩圖（Venny 2.1）深入探索苓桂術(shù)甘湯中的君藥茯苓與佐使藥甘草在治療心力衰竭的機制方面的關(guān)系。結(jié)果表明，在治療心力衰竭上茯苓與甘草共有的靶點數(shù)量為4，占2藥全部靶點數(shù)的23.5%;茯苓獨有的靶點數(shù)為0，（其全部靶點為充血性心力衰竭靶點）;甘草獨有的靶點數(shù)為13（甘草的靶點中，心力衰竭靶點為14個，充血性心力衰竭靶點6個，ADRBK1;TNF為共有靶點），占總數(shù)的76.5%。

3 討論

現(xiàn)今研究中藥方劑主要采用的是固有的分離提取法，例如水提醇沉法、溶劑提取法、超臨界流體提取法、水蒸氣蒸餾法通過將其內(nèi)涵的有用部位及活性成分汲取出來，或者研究其內(nèi)含的某些單體藥物，以動物或細胞等實驗方法用來測試，以期得到治療疾病的活性成分組合，或研究某些活性部位的作用機理，再將其進行組合從而促進中藥新藥的再開發(fā)與利用[13]。通過大量的實驗研究我們得到了一些研究成果，但因時間花費大，且研究的結(jié)果可能與臨床實際有所出入，而中藥方劑具有成分多靶點多的特證使其在單一種類的研究方面不能很好的展示出中藥的優(yōu)點，因此采用原來的方式得到的結(jié)果不能很好的展現(xiàn)出中藥方劑的療效[14]。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來深入挖掘中藥方劑的特征，根據(jù)中藥里的化學(xué)成分是明了的，疾病中的靶點也是清楚的前提下，多角度全方位的利用現(xiàn)代科技帶來的研究成果，并且使用在線工具繪制中藥方劑里化學(xué)成分的多靶點、多路徑的作用機制示意圖，并使有效成分與相關(guān)靶標及疾病的復(fù)雜分子作用機制可以直截了當(dāng)?shù)恼故驹谑廊嗣媲?。這種方法對中藥新藥的再開發(fā)再利用給予新的可能[15]。

文中用苓桂術(shù)甘湯為代表，利用在線的中醫(yī)藥生物信息學(xué)分析網(wǎng)站探索苓桂術(shù)甘湯治療心力衰竭的可能，并用得到的相關(guān)靶點進行深入挖掘，根據(jù)靶點與疾病可能存在的相關(guān)道路，推測苓桂術(shù)甘湯治療心力衰竭的可能機理，并且篩選了苓桂術(shù)甘湯中君藥茯苓與佐使藥甘草的治療心力衰竭的靶點。統(tǒng)計結(jié)果給我們展現(xiàn)出苓桂術(shù)甘湯治療慢性心力衰竭的作用機制靶點包括1型血管緊張素II受體、α2型腎上腺素受體、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶等。眾多實驗表明，抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性、降低血管緊張素Ⅱ、全面阻滯交感神經(jīng)系統(tǒng)是治療心力衰竭的關(guān)鍵的癥結(jié)[16-18]。由表3顯示，雖然檢索桂枝與白術(shù)時沒有顯示其具有抗心力衰竭的作用，但其中某些成分對苓桂術(shù)甘湯整體治療心力衰竭做出了貢獻，體現(xiàn)出方劑中君臣佐使的特性。通過分析君藥茯苓與佐使藥甘草的靶點我們發(fā)現(xiàn)，甘草在苓桂術(shù)甘湯治療心力衰竭的過程中擔(dān)任重要作用因素。有實驗研究表明，甘草在治療心力衰竭方面有特殊貢獻，以炙甘草湯——以甘草為君藥，聯(lián)合曲美他嗪可明顯提高慢性老年性心力衰竭合并竇性心動過緩患者的心臟舒縮功能，降低血漿NT-proBNP和H-FABP水平，改善心功能。而與麻黃附子細辛湯連用炙甘草湯可使竇性心動過緩的患者，更有效地活氣血、養(yǎng)心脈，使心率趨于穩(wěn)定，提高治療總有效率[19-20]。體外實驗研究表明在心肌細胞內(nèi)甘草次酸和甘草酸可以發(fā)揮作用使活性氧的含量下降，而甘草次酸和甘草酸是甘草治療心力衰竭的突出療效組成部分[21]。與桂枝和茯苓配伍可以達到增加藥理效果的治療的心血管疾病的功效，桂枝甘草湯可以有效保護采用冠脈結(jié)扎術(shù)造模的心力衰竭大鼠的心肌功能，其主要的作用機理為消滅氧自由基，抗脂質(zhì)氧化，及下調(diào)TGF-β1、ICAM-1表達;通過分析心率、治療效果、中醫(yī)癥候積分、及心電圖，加味桂枝甘草龍骨牡蠣湯具有十分明顯的減輕心悸體征的療效，能大大減弱心悸癥狀，降低心肌缺血的情況;防己黃芪湯可增強心力衰竭所致水腫患者的心功能，提高24 h尿量，改善治療效果，且安全性好;真武湯合防己黃芪湯加減可以使CHF患者的心功能分級提升、改善心功能和心室重構(gòu)、中醫(yī)證候方面產(chǎn)生顯著療效[22]。

通過對苓桂術(shù)甘湯相關(guān)靶點與化學(xué)成分的相互作用進行分析，或許可以發(fā)現(xiàn)中藥方劑在分子水平上的繁雜的作用原理，從網(wǎng)絡(luò)水平和分子水平研究經(jīng)典方劑苓桂術(shù)甘湯治療心力衰竭的具體機理，為經(jīng)方治療心力衰竭提供現(xiàn)代化的科學(xué)研究結(jié)果。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究“藥物-疾病-基因-靶點”的互相影響，可從多維度展現(xiàn)中藥方劑的治療情況，可能對苓桂術(shù)甘湯的藥理作用靶點、篩選其中有效靶成分做出提示，結(jié)合文獻分析可明顯降低實驗強度，加速中藥科學(xué)化進程及對臨床應(yīng)用經(jīng)方做出重要提示[23-24]。

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（2018-12-12收稿 責(zé)任編輯：徐穎）