羽衣甘藍小孢子胚胎細胞結(jié)構(gòu)變化及其植株再生

姚悅梅　張振超　山溪　肖燕　朱建飛　戴忠良

摘要：【目的】研究組織培養(yǎng)過程中羽衣甘藍小孢子胚胎細胞結(jié)構(gòu)變化及其植株再生，為小孢子培養(yǎng)技術(shù)在羽衣甘藍中的應(yīng)用提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳?2個羽衣甘藍品種為材料，采用LEICA倒置熒光顯微鏡研究小孢子熱激后的胚胎細胞結(jié)構(gòu)變化、胚胎發(fā)育過程及出胚率差異，運用透射顯微鏡觀察胚性小孢子細胞核的融合過程，并分析不同培養(yǎng)基（B5分化培養(yǎng)基和MS分化培養(yǎng)基）及其瓊脂濃度（0.8%、1.0%和1.2%）對胚狀體成苗率的影響。采用遮蓋方式馴化組培苗后移栽大田，統(tǒng)計其成活率?！窘Y(jié)果】在12個羽衣甘藍品種中，除Y4花蕾的小孢子未發(fā)育成胚狀體外，其他品種花蕾的小孢子均發(fā)育成不同數(shù)目的胚狀體。其中，Y1和Y2平均每個花蕾的出胚數(shù)較高，分別為11.84和10.36個;Y3、Y7和Y8平均每個花蕾的出胚數(shù)較少，分別為1.55、1.45和0.94個。對于出胚數(shù)多的品種，對稱分裂是其小孢子細胞分裂的主要方式，小孢子發(fā)育形成子葉形胚狀體的比例也較高;而出胚數(shù)少的品種易發(fā)生小孢子不對稱分裂，最終形成較多的畸形胚，子葉形胚數(shù)量較少。32.5 ℃熱激1 d即可啟動小孢子細胞胚胎發(fā)育進程，經(jīng)原胚、球形胚、心形胚、魚雷形胚，最終形成子葉形胚。熱激處理后培養(yǎng)2 d小孢子進行第一次對稱分裂形成兩個大小、形狀相似的細胞;培養(yǎng)5～7 d后兩個細胞（胚性小孢子）逐漸靠近并融合在一起，細胞核核膜緊靠在一起，隨后聚結(jié)融合，核酸物質(zhì)混合，融合早期形成類似花生形的細胞核結(jié)構(gòu)。含不同濃度瓊脂的B5分化培養(yǎng)基和MS分化培養(yǎng)基中胚狀體成苗率排序均表現(xiàn)為0.8%瓊脂<1.0%瓊脂<1.2%瓊脂，且同一瓊脂濃度下，B5分化培養(yǎng)基的胚狀體成苗率均較MS分化培養(yǎng)基的高。組培苗馴化后移栽大田，成活率可達100%?！窘Y(jié)論】通過小孢子培養(yǎng)可快速有效獲得羽衣甘藍小孢子單、雙倍體再生植株。在培養(yǎng)過程中，胚性小孢子細胞核融合可能是導致單倍體小孢子自發(fā)加倍成為多倍體的重要方式，且含1.2%瓊脂的B5分化培養(yǎng)基更適合用于羽衣甘藍胚狀體增殖分化成苗。

關(guān)鍵詞： 羽衣甘藍;小孢子培養(yǎng);胚胎發(fā)育;細胞學觀察;胚狀體;核膜聚結(jié)

中圖分類號： S635.9 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）05-0924-08

Abstract：【Objective】The aim was to study the cellular structure changes and plant regeneration during microspore culture of kale，and to lay a theoretical foundation for the application of microspore culture technology in kale. 【Method】 Twelve kale varieties were used as experimental materials to study the changes of cell structure，embryonic development and embryonic rate after microspore heat shock by LEICA inverted fluorescence microscopy. The fusion process of two nuclei by transmission electron microscopy was observed. The effects of different differentiation media（B5 and MS） and agar concentrations（0.8%， 1.0% and 1.2%） on embryoid seedling formation in culture medium were also studied. The seedlings were domesticated by covering method then transplanted into field and calculated the survival rate finally. 【Result】Among 12 kale varieties， the other varieties developed into different numbers of embryoids except genotype Y4. The average number of embryos per bud of Y1 and Y2 was higher （11.84 and 10.36） than others， but the genotypes of Y3， Y7 and Y8 developed fewer number of embryos per bud， which were 1.55， 1.45 and 0.94 respectively. For easy embryogenic genotypes， symmetrical division was the main mode of microspore division and the proportion of cotyledon embryos was higher. But for the varieties developed into fewer embryos were prone to asymmetrical division， resulting in many abnormal embryos and fewer cotyledon embryos. After heat shock for 1 d at 35 ℃，microspores initiated the first cell division，and the embryogenic microspores formed proembryos firstly，then globular embryo，heart-like embryo，torpedo embryo，and developed into cotyledonary embryos finally. After 2 d of culture， the microspores underwent the first symmetrical division to form two cells of similar size and shape. The two nuclear membranes of 5-7 d two cells（embryogenic microspores） gradually approached，followed by coalescence and fusion in culture，then nucleic acids mixed together and a peanut-like structure formed. The order of the frequency of embryo regeneration of B5 medium and MS medium with different concentrations of agar was 0.8% agar <1.0% agar <1.2% agar， and at the same concentration of agar， the frequency of embryo regeneration of B5 medium was higher than that of MS medium. After domestication， the survival rate of tissue culture seedlings could reach 100% after transplanted into field. 【Conclusion】Microspore culture can obtain doubled haploid regenerated plants of kale quickly and effectively. During microspore culture， nuclear fusion of embryogenic microspore might be an important way to cause haploid microspore to become polyploidy spontaneously. B5 differentiation medium with 1.2% agar is more suitable for embryos regenerate into seedlings of kale.

Key words： kale; microspore culture; embryonic development; cytological observation; embryoid; nuclear membrane coalescence

0 引言

【研究意義】羽衣甘藍（Brassica oleracea L. var. acephala）葉形多姿，葉色絢麗，耐寒性較強，且營養(yǎng)豐富，既可用于秋冬園林景觀綠化造型，又能作為營養(yǎng)蔬菜用于食療保?。ü鶎幍?，2017）。目前，國內(nèi)的羽衣甘藍商品種主要來自日本及歐美國家，種子價格昂貴，國內(nèi)種質(zhì)資源匱乏，常規(guī)田間育種手段費時費力且效率較低，而小孢子培養(yǎng)技術(shù)可快速創(chuàng)制新種質(zhì)。通過該技術(shù)可顯微觀察不同類型羽衣甘藍小孢子胚胎細胞結(jié)構(gòu)變化和細胞核融合過程，但其應(yīng)用受限于基因型障礙和培養(yǎng)基成分等（戴希剛等，2012;王玉書等，2015）。因此，改進羽衣甘藍小孢子培養(yǎng)技術(shù)，提高小孢子出胚率和胚狀體再生成苗率對創(chuàng)制其優(yōu)異育種材料、縮短育種進程、提高育種效率具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】大量研究證明，羽衣甘藍游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用受諸多因素影響，其中基因型發(fā)揮決定性影響（張振超等，2013;祝朋芳等，2015;韓碩等，2018）。熱激誘導后，小孢子的細胞質(zhì)和細胞核結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如體積膨大、細胞核移至細胞中心及細胞質(zhì)重分布等，然后進入到孢子體發(fā)育途徑（Zeng et al.，2015），誘導小孢子胚胎發(fā)育主要包括A、B和C 3個途徑（Hu and Kasha，1999），其中，A途徑是小孢子誘導后進行不對稱第一次細胞有絲分裂;B途徑是小孢子誘導后進行對稱第一次有絲分裂，可形成兩個相似的營養(yǎng)核，該途徑是許多物種胚胎發(fā)生和形成的關(guān)鍵途徑（Zeng et al.，2015）;C途徑始于營養(yǎng)核和生殖核的融合及持續(xù)的有絲分裂，形成具有二倍體染色體數(shù)目的愈傷組織或胚狀體（Gerszberg，2018）。這3個途徑常共存于同一個培養(yǎng)中，且其變化頻率隨基因型、脅迫處理及培養(yǎng)條件不同而存在差異（Soriano et al.，2013;Gerszberg，2018）。Testillano等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，熱激誘導后培養(yǎng)5～7 d的玉米胚性小孢子細胞通過核融合的方式（C途徑）在胚域發(fā)生染色體加倍。Zeng等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，青花菜×白頭甘藍雜交種小孢子培養(yǎng)中，胚胎發(fā)育的主要途徑為B途徑，少數(shù)為C途徑?！颈狙芯壳腥朦c】目前，鮮見有關(guān)小孢子細胞胚胎實時動態(tài)變化及胚性小孢子細胞核融合形成多倍體的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以12個羽衣甘藍品種為材料，采用LEICA倒置熒光顯微鏡研究小孢子熱激后的細胞結(jié)構(gòu)變化、胚胎發(fā)育過程及出胚率差異，運用透射電鏡觀察兩個胚性小孢子的細胞核融合過程，并分析不同培養(yǎng)基（B5分化培養(yǎng)基和MS分化培養(yǎng)基）及其瓊脂濃度（0.8%、1.0%和1.2%）對胚狀體成苗率的影響，最后采用遮蓋方式馴化組培苗后移栽大田，統(tǒng)計其成活率，以期為羽衣甘藍小孢子培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為12個不同類型的羽衣甘藍品種，具體品種名和來源地如表1所示，分別由江蘇札幌采種場、浙江虹越花卉有限公司和農(nóng)友種苗（中國）有限公司提供。小孢子培養(yǎng)所用試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。主要儀器設(shè)備：盧湘儀離心機（TDZ-WS，上海盧湘儀離心機儀器有限公司）、LEICA倒置熒光顯微鏡（LEICA，日本）、透射顯微鏡（JROL JEM-1200EX，日本）、成像系統(tǒng)（LEICA DFC 300FX，日本）等。

1. 2 小孢子分離及培養(yǎng)

2015年8月20日開始育苗，選取10株苗齡30～35 d的健康苗定植于江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所育種基地溫室。當年11～12月和翌年3～4月，室外平均溫度在12.0 ℃左右時，取合適花蕾用于游離小孢子分離及培養(yǎng)，具體方法參照Soriano等（2013）、張振超等（2013）的文獻報道。從健壯花序上觀察選取單核靠邊期的花蕾，在超凈工作臺中用5.6%次氯酸鈉溶液振蕩滅菌20 min，以無菌水沖洗3～5次，將無菌花蕾置于100 mL無菌燒杯，加入10 mL NLN-13液體培養(yǎng)基，用無菌玻璃棒研磨勻漿，懸浮液用40 μm孔徑尼龍網(wǎng)過濾到50 mL無菌離心管中，密封后850 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀中加入NLN-13液體培養(yǎng)基40 mL，并加入1 mL活性炭，混勻后分裝入直徑為60 mm的培養(yǎng)皿中，每皿4 mL，分別用Parafilm密封后置于32.5 ℃培養(yǎng)箱中黑暗熱激處理1～2 d，轉(zhuǎn)至（25.0±1.0）℃培養(yǎng)箱中靜置暗培養(yǎng)。當肉眼可見胚狀體時將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至65 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3周后統(tǒng)計平均每個花蕾的出胚數(shù)。試驗設(shè)5個重復(fù)，每個重復(fù)15個花蕾。最后比較分析不同品種羽衣甘藍小孢子的出胚差異。

1. 3 小孢子胚胎發(fā)育實時動態(tài)觀察

通過DAPI熒光染色法觀察羽衣甘藍不同大小花蕾中小孢子發(fā)育情況（康潔，2010;張振超等，2015）。觀察前在載玻片上滴一滴工作液，用鑷子壓碎花藥使小孢子均勻散布在工作液中，移去殘余花蕾，蓋上蓋玻片，在LEICA倒置熒光顯微鏡（40×10）下觀察，并采用成像系統(tǒng)拍照記錄，每個品種不同大小花蕾隨機取10個，每個花蕾觀察2個花藥、10個不同視野。

小孢子培養(yǎng)過程中，采用LEICA倒置熒光顯微鏡（40×10）每3 d觀察一次，每皿觀察5個不同視野，統(tǒng)計小孢子萌發(fā)數(shù)，并對其形態(tài)拍照記錄。

1. 4 胚性小孢子細胞核融合過程觀察

采用洪健等（1998）的方法進行電鏡切片制樣及觀察。小孢子懸浮液1000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀中加入2.5%戊二醛，將沉淀振蕩懸浮。制片時，1000 r/min離心5 min小孢子懸浮液，棄上清液，沉淀用磷酸鹽緩沖液清洗2次后1000 r/min離心5 min，沉淀用1%四氧化鋨固定4 h，1000 r/min離心5 min后沉淀用磷酸鹽緩沖液清洗2次，再用丙酮進行梯度脫水，用Epon 812樹脂包埋后進行超薄切片，所制切片在透射顯微鏡（放大倍數(shù)為4000～7500倍）下觀察，并拍照記錄。

1. 5 不同培養(yǎng)基及其瓊脂濃度對胚狀體成苗率的影響

胚狀體在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d左右后分別轉(zhuǎn)接至B5分化培養(yǎng)基[B5培養(yǎng)基+23%蔗糖+不同濃度（0.8%、1.0%和1.2%）瓊脂，pH 6.0]和MS分化培養(yǎng)基[MS培養(yǎng)基+25%蔗糖+不同濃度（0.8%、1.0%和1.2%）瓊脂，pH 6.0]上，30 d后統(tǒng)計胚狀體成苗率，分析不同培養(yǎng)基及其瓊脂濃度對胚狀體成苗率的影響。然后將其轉(zhuǎn)接至固體生根培養(yǎng)基（1/2 MS培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IAA+20%蔗糖+0.8%瓊脂，pH 5.8～6.0）上，在光照培養(yǎng)室[光周期為14 h光照/10 h黑暗，溫度（25.0±2.0）℃]中培養(yǎng)25～30 d。

1. 6 再生植株馴化和移栽

在固體生根培養(yǎng)基培養(yǎng)25～30 d后對組培苗進行馴化和移栽。先把組培瓶從培養(yǎng)室移出，松開瓶蓋注入少量自來水，室溫條件下煉苗4～5 d。從瓶中小心取出組培苗，洗凈根部培養(yǎng)基，用800～1000倍百菌清浸泡基部2～3 min后栽種于72孔穴盤的瑞士品氏育苗專用基質(zhì)中，白色透明塑料膜覆蓋保濕7～10 d后移栽至大田，觀察小孢子再生植株生長勢、農(nóng)藝性狀等，并統(tǒng)計其成活率。

1. 7 統(tǒng)計分析

采用Excel 2007和SAS 9.4對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 小孢子胚胎發(fā)生情況分析結(jié)果

不同羽衣甘藍品種平均每個花蕾出胚數(shù)如表2所示。在12個品種中，除Y4花蕾的小孢子未發(fā)育成胚狀體外，其他品種花蕾的小孢子均能發(fā)育成不同數(shù)目的胚狀體。其中，Y2平均每個花蕾的出胚數(shù)最高，為11.84個;其次是Y1，為10.36個;Y3、Y7和Y8平均每個花蕾出胚數(shù)較少，分別為1.55、1.45和0.94個。

2. 2 小孢子胚胎發(fā)育過程的細胞學觀察結(jié)果

由圖1可知，小孢子經(jīng)母細胞減數(shù)分裂后形成4個單倍體小孢子（四分體）（圖1-a），隨后形成明顯的細胞壁，體積逐漸增大，細胞質(zhì)發(fā)生液泡化（圖1-b），液泡細胞核從中心位置被擠壓到細胞壁一側(cè)（圖1-c），小孢子繼續(xù)分離發(fā)育產(chǎn)生1個營養(yǎng)核和1個生殖核，即為雙核期小孢子，其明顯特征是兩個細胞核間形成細胞板，兩個細胞大小及形態(tài)不均等（圖1-d）。這些形態(tài)特征的變化為選擇適期培養(yǎng)的花蕾提供了較準確的依據(jù)。

32.5 ℃熱激1 d即可啟動小孢子細胞胚胎發(fā)育進程。一部分小孢子細胞膨大（圖1-e和圖1-h），呈圓球形或卵圓形（圖1-g），細胞壁裂解;（25.0±1.0）℃暗培養(yǎng)3 d后發(fā)生多次對稱分裂（圖1-f）或不對稱分裂（圖1-g），發(fā)生對稱分裂的小孢子繼續(xù)培養(yǎng)形成原胚（圖1-i）;15 d后逐漸發(fā)育形成肉眼可見的球形（圖1-j）、心形（圖1-k）或魚雷形胚狀體（圖1-l）;25 d后發(fā)育形成子葉形胚（圖1-m和1-o）。未感受到熱激的小孢子則無法發(fā)育，如圖1-e、圖1-g和圖1-h中箭頭所示。此外，觀察發(fā)現(xiàn)小孢子發(fā)育并非同步進行（圖1-o），在同一培養(yǎng)皿中，部分小孢子生長發(fā)育較好，形成子葉形胚，還有部分小孢子仍處在其他不同發(fā)育時期，甚至有部分小孢子發(fā)育成畸形胚，即不對稱分裂的小孢子停止發(fā)育或繼續(xù)膨大至細胞壁破裂（圖1-n）。

綜合分析發(fā)現(xiàn)，對于出胚數(shù)多的品種，對稱分裂是其小孢子細胞分裂的主要方式，小孢子發(fā)育形成子葉形胚狀體的比列也較高;而出胚數(shù)少的品種易發(fā)生小孢子不對稱分裂，最終形成較多的畸形胚，子葉形胚數(shù)量較少。

2. 3 胚性小孢子細胞核融合過程觀察結(jié)果

32.5 ℃熱激1 d后繼續(xù)培養(yǎng)2 d小孢子進行第一次對稱分裂形成兩個大小、形狀相似的細胞，兩個細胞相鄰，但無細胞壁包被，細胞核染色較淺，細胞器散布在細胞質(zhì)中（圖2-a）。培養(yǎng)5～7 d后兩個細胞（胚性小孢子）逐漸靠近并融合在一起，染色質(zhì)壓縮折疊所構(gòu)成的形式與大核仁基本一致（圖2-b），兩個細胞的細胞核在細胞質(zhì)中逐漸靠近，核膜緊靠在一起，細胞的其他區(qū)域則發(fā)生融合（圖2-c）。在兩個細胞核膜融合處可看到核酸物質(zhì)混合，兩個核仁仍是獨立狀態(tài)，融合早期形成類似花生形的細胞核結(jié)構(gòu)（圖2-d）。

2. 4 不同培養(yǎng)基及其瓊脂濃度對胚狀體成苗率的影響

以出胚數(shù)最多的羽衣甘藍品種Y2小孢子胚狀體為試材，研究B5分化培養(yǎng)基和MS分化培養(yǎng)基及其瓊脂濃度對胚狀體成苗率的影響，結(jié)果如表3所示。含不同濃度瓊脂的B5分化培養(yǎng)基和MS分化培養(yǎng)基中胚狀體成苗率排序均表現(xiàn)為0.8%瓊脂<1.0%瓊脂<1.2%瓊脂，尤其是含0.8%瓊脂的B5分化培養(yǎng)基和MS分化培養(yǎng)基中胚狀體成苗率均明顯較低，分別為43.6%和36.4%;含1.2%瓊脂的B5分化培養(yǎng)基和MS分化培養(yǎng)基中胚狀體成苗率較高，分別為85.7%和78.2%。且同一瓊脂濃度下，B5分化培養(yǎng)基的胚狀體成苗率均較MS分化培養(yǎng)基高?？梢姡?.2%瓊脂的B5分化培養(yǎng)基更適合用于羽衣甘藍胚狀體增殖分化成苗。

通過觀察發(fā)現(xiàn)，小孢子胚狀體水含量較高，當瓊脂濃度低（0.8%）時，因培養(yǎng)基中水含量較高，胚狀體易產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象而導致死亡（圖3-a）;當瓊脂濃度高（1.0%和1.2%）時，培養(yǎng)基中水含量相對較低，玻璃化現(xiàn)象明顯降低（圖3-b）;培養(yǎng)4 d后，胚狀體長出根毛，子葉變綠，胚頂端抽生出小芽，20 d后長成健壯的莖（圖3-c），將莖轉(zhuǎn)接至固體生根培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，7 d后可觀察到根部有白色毛狀物出現(xiàn)，15 d后開始生根，培養(yǎng)30 d后發(fā)現(xiàn)植株生長健壯、根系旺盛（圖3-d）。

2. 5 再生植株馴化移栽結(jié)果

圖4展示小孢子再生植株的馴化移栽過程。組培苗在固體生根培養(yǎng)基培養(yǎng)25～30 d后，其根系旺盛，且有4～5片葉子（圖4-a和圖4-b），先用清水洗去組培苗根部培養(yǎng)基（圖4-c），再用百菌清溶液浸泡可有效預(yù)防病菌對組培苗的侵害。使用瑞士品氏育苗專用基質(zhì)栽培、白色塑料膜覆蓋保濕等方法可有效促進組培苗更快緩苗，成活率達100%，且長勢旺盛（圖4-d和圖4-e）。移栽大田后，小孢子再生植株的成活率為100%，且生長勢、植株性狀和農(nóng)藝性狀與種子實生苗無明顯差異（圖4-f）。

3 討論

羽衣甘藍是異花授粉植物，具有明顯的雜種優(yōu)勢，其商品種幾乎全為雜交種，因此，雜種育種成為羽衣甘藍品種選育的主要方式（祝朋芳等，2015）。選育純合穩(wěn)定的自交系育種材料一般需要5～6代連續(xù)自交，而采用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)可在1～2年內(nèi)獲得大量DH單體植株，應(yīng)用前景廣闊（袁素霞等，2010;彭楚媛，2017）。雖然前人在羽衣甘藍小孢子培養(yǎng)技術(shù)方面研究已取得一些成果，但未有突破性的進展，其應(yīng)用主要受限于基因型障礙和培養(yǎng)基成分等（戴希剛等，2012;張振超等，2015，2018）。本研究選取12個不同類型的羽衣甘藍品種開展游離小孢子培養(yǎng)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除Y4未獲得胚狀體外，其他材料均獲得了不同數(shù)目的胚狀體，其中Y2和Y1平均每個花蕾的出胚數(shù)較高，Y3、Y7和Y8平均每個花蕾出胚數(shù)較少。結(jié)合后期研究發(fā)現(xiàn)，對于出胚數(shù)多的品種，小孢子發(fā)育形成子葉形胚狀體的比例較高，胚狀體成苗率也較高，而出胚數(shù)少的品種易形成較多的畸形胚，胚狀體成苗率較低。

配子體形成過程中，花藥先后分化形成孢原組織和小孢子母細胞，經(jīng)減數(shù)分裂形成四分體孢子，單核小孢子不斷細胞分裂后經(jīng)單核和雙核階段，最后形成三核花粉粒，不對稱分裂是小孢子自然分裂形成花粉粒的主要方式（毛忠良等，2012）。而在游離小孢子培養(yǎng)過程中，單核晚期至雙核早期的小孢子易受外界刺激，由配子體發(fā)育轉(zhuǎn)變?yōu)殒咦芋w發(fā)育，在羽衣甘藍小孢子培養(yǎng)中，最常用的外界刺激為32～33.0 ℃熱激處理1～2 d（馮輝等，2007;毛忠良等，2012;王玉書等，2015）。本研究發(fā)現(xiàn)，32.5 ℃熱激處理1 d即可有效促進羽衣甘藍小孢子胚胎發(fā)育。發(fā)育過早的單核小孢子細胞尚未成形，在培養(yǎng)過程中可能會由于對外部環(huán)境不適應(yīng)而凋亡;發(fā)育過晚的小孢子細胞結(jié)構(gòu)已經(jīng)固化，其脫分化能力較差，外界熱激脅迫處理不易誘發(fā)其改變發(fā)育途徑而形成胚狀體（馮輝等，2007;袁素霞等，2010;張振超等，2015）。研究發(fā)現(xiàn)，游離小孢子受高溫刺激后，即發(fā)生多次不對稱或?qū)ΨQ分裂，不對稱細胞分裂形成的小孢子細胞在培養(yǎng)過程中會凋亡或形成畸形胚（A途徑），對稱分裂則形成兩個形態(tài)和結(jié)構(gòu)相似的細胞核（B途徑），均無核膜包被，而細胞器和細胞質(zhì)均勻散布在細胞核周圍，其原因可能是雖然小孢子熱激后同一細胞內(nèi)細胞核發(fā)生了對稱分裂，但細胞質(zhì)仍然保持原來狀態(tài)，未發(fā)生分裂（Hosp et al.，2007;毛忠良等，2012;Zeng et al.，2015）。本研究發(fā)現(xiàn)，供試材料經(jīng)熱激處理后，大部分發(fā)育小孢子發(fā)生對稱分裂（B途徑），最終形成單倍體胚。C途徑是小孢子胚胎發(fā)育過程中發(fā)生自然加倍的重要途徑（Walley et al.，2012），如大麥、玉米和小麥小孢子培養(yǎng)時其胚性小孢子發(fā)生核融合最終形成多倍體胚（Sunderland，1974;Shim and Kasha，2003;Testillano et al.，2004）。本研究還發(fā)現(xiàn)，小部分胚性小孢子沿C途徑發(fā)育所形成的兩個細胞核融合最終形成二倍體胚。

胚狀體成苗率與培養(yǎng)基類型和成分有關(guān)（張振超等，2015）。本研究發(fā)現(xiàn)，含不同瓊脂濃度的B5分化培養(yǎng)基和MS分化培養(yǎng)基中胚狀體成苗率排序均表現(xiàn)為0.8%瓊脂<1.0%瓊脂<1.2%瓊脂，且同一瓊脂濃度下，B5分化培養(yǎng)基的胚狀體成苗率均較MS分化培養(yǎng)基的高，說明含1.2%瓊脂的B5分化培養(yǎng)基更適合用于羽衣甘藍胚狀體增殖分化成苗。馮翠等（2011）也研究發(fā)現(xiàn)，瓊脂濃度影響青花菜胚狀體成苗率，可通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中水分含量，降低胚狀體玻璃化現(xiàn)象，促進胚狀體成苗。

4 結(jié)論

通過小孢子培養(yǎng)可快速有效獲得羽衣甘藍小孢子單、雙倍體再生植株。在培養(yǎng)過程中，胚性小孢子細胞核融合可能是導致單倍體小孢子自發(fā)加倍成為多倍體的重要方式，且含1.2%瓊脂的B5分化培養(yǎng)基更適合用于羽衣甘藍胚狀體增殖分化成苗。

參考文獻：

戴希剛，施雪萍，包滿珠. 2012. 基因型與培養(yǎng)條件對羽衣甘藍小孢子胚胎發(fā)生的影響[J]. 植物生理學報，48（11）：1113-1119. [Dai X G，Shi X P，Bao M Z. 2012. Effects of genotype and culture condition on microspore embryogenesis of ornamental kale（Brassica oleracea var. acepha-la）[J]. Plant Physiology Journal，48（11）：1113-1119.]

馮翠，曾愛松，嚴繼勇，宋立曉，高兵，侯喜林. 2011. 影響青花菜游離小孢子培養(yǎng)的因素[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學學報，34（6）：20-24. [Feng C，Zeng A S，Yan J Y，Song L X，Gao B，Hou X L. 2011. The factors affecting isolated microspore culture in Brassica oleracea L var. italica[J]. Journal of Nanjing Agricultural University，34（6）：20-24.]

馮輝，姜鳳英，馮建云，王超楠. 2007. 羽衣甘藍游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究及應(yīng)用[J]. 園藝學報，34（4）：1019-1022. [Feng H，Jiang F Y，F(xiàn)eng J Y，Wang C N. 2007. Establishment and application of the system for isolated microspore culture in kale（Brassica oleracea L. var. acephala DC.）[J]. Acta Horticulturae Sinica，34（4）：1019-1022.]

郭寧，高懷杰，韓碩，宗梅，王桂香，張月云，劉凡. 2017. 觀賞羽衣甘藍SSR標記分型與親緣關(guān)系研究[J]. 植物遺傳資源學報，18（2）：349-357. [Guo N，Gao H J，Han S，Zong M，Wang G X，Zhang Y Y，Liu F. 2017. Genotypic and genetic relationship analysis of ornamental kale（Brassica oleracea var. acephala） by SSR markers[J]. Journal of Plant Genetic Resources，18（2）：349-357.]

韓碩，郭寧，張月云，宗梅，王桂香，劉凡. 2018. 羽衣甘藍雙單倍體育種技術(shù)研究[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，26（3）：521-529. [Han S，Guo N，Zhang Y Y，Zong M，Wang G X，Liu F. 2018. Researches on the double haploid breeding of ornamental kale（Brassica oleracea var. acephala）[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，26（3）：521-529.]

洪健，黎軍英，高其康，蔣德安. 1998. 鉀營養(yǎng)影響水稻葉綠體的形態(tài)定量分析[J]. 浙江農(nóng)業(yè)大學學報，24（S）：1-4. [Hong J，Li J Y，Gao Q K，Jiang D A. 1998. Morphome-tric analysis of effect of K nutrition on developmental course of rice chloroplast[J]. Journal of Zhejiang Agricultural University，24（S）：1-4.]

康潔. 2010. 番茄小孢子發(fā)育時期鑒定和游離方法的研究[J]. 中國農(nóng)學通報，26（17）：75-78. [Kang J. 2010. Research on the method for developmental stage identification and free for the microspore of tomato[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，26（17）：75-78.]

毛忠良，張振超，姚悅梅，戴忠良，秦文斌，潘躍平. 2012. 羽衣甘藍小孢子胚胎發(fā)生觀察及再生植株倍性鑒定[J]. 西北植物學報，32（10）：2016-2022. [Mao Z L，Zhang Z C，Yao Y M，Dai Z L，Qin W B，Pan Y P. 2012. In vitro microspore embyogenesis and chromosome doubling of kale[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，32（10）：2016-2022.]

彭楚媛. 2017. 羽衣甘藍游離小孢子培養(yǎng)與再生體系構(gòu)建[D]. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學. [Peng C Y. 2017. Research on regengration and genetic transformation system of kale[D]. Shenyang：Shenyang Agricultural University.]

王玉書，王歡，范震宇，馮輝. 2015. 觀賞羽衣甘藍小孢子培養(yǎng)及再生植株倍性變異[J]. 核農(nóng)學報，29（6）：1037-1043. [Wang Y S，Wang H，F(xiàn)an Z Y，F(xiàn)eng H. 2015. Isolated microspore culture and ploidy variation of regenerated plants in ornamental kale[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，29（6）：1037-1043.]

袁素霞，劉玉梅，方智遠，楊麗梅，莊木，張揚勇，孫培田. 2010. 結(jié)球甘藍和青花菜小孢子胚植株再生[J]. 植物學報，45（2）：226-232. [Yuan S X，Liu Y M，F(xiàn)ang Z Y，Yang L M，Zhuang M，Zhang Y Y，Sun P T. 2010. Plant regeneration from microspore-derived embryos in cabbage（Brassica oleracea var. capitata） and broccoli（Brassica oleracea var. italica）[J]. Chinese Bulletin of Botany，45（2）：226-232.]

張振超，耿鑫鑫，戴忠良，潘躍平，王兵，許玲，顏志明，周偉軍. 2013. 甘藍類植物小孢子培養(yǎng)及植株再生研究[J]. 核農(nóng)學報，27（7）：929-937. [Zhang Z C，Geng X X，Dai Z L，Pan Y P，Wang B，Xu L，Yan Z M，Zhou W J. 2013. Microspore embryogenesis and plant regeneration of bra-ssica plants[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，27（7）：929-937.]

張振超，潘躍平，毛忠良，顏志明，吳國平，姚悅梅，秦文斌，解振強，戴忠良. 2015. 青花菜與甘藍型油菜小孢子共培養(yǎng)技術(shù)研究[J]. 核農(nóng)學報，29（8）：1487-1493. [Zhang Z C，Pan Y P，Mao Z L，Yan Z M，Wu G P，Yao Y M，Qin W B，Xie Z Q，Dai Z L. 2015. A preliminary research on improvement of microspore embryogenesis for recalcitrant broccoli genotypes[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，29（8）：1487-1493.]

張振超，姚悅梅，毛忠良，孫國勝，秦文斌，戴忠良. 2018. 基于高通量測序的青花菜早期發(fā)育小孢子轉(zhuǎn)錄組分析與基因功能注釋[J]. 核農(nóng)學報，32（5）：848-855. [Zhang Z C，Yao Y M，Mao Z L，Sun G S，Qin W B，Dai Z L. 2018. Transcriptome analysis and gene function annotation of early developmental broccoli microspores based on high-throughput sequencing technology[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，32（5）：848-855.]

祝朋芳，王衛(wèi)珍，李珺，劉暢，年玉欣. 2015. 羽衣甘藍游離小孢子胚胎發(fā)生、植株再生與增殖的研究[J]. 北方園藝，（13）：111-115. [Zhu P F，Wang W Z，Li J，Liu C，Nian Y X. 2015. Study on microspore embryogenesis regeneration and ?propagation in vitro on ornamental kale（Brassica oleracea var. acephala）[J]. Northern Horticulture，（13）：111-115.]

Gerszberg A. 2018. Tissue culture and genetic transformation of cabbage（Brassica oleracea var. capitata）：An overview[J]. Planta，248（5）：1037-1048.

Hosp J，Maraschin S F，Touraev A，Boutilier K. 2007. Functional genomics of microspore embryogenesis[J]. Euphy-tica，158（3）：275-285.

Hu T，Kasha K J .1999. A cytological study of pretreatments used to improve isolated microspore cultures of wheat （Triticum aestivum L.） cv. Chris[J]. Genome，42（3）：432-441.

Shim Y S，Kasha K J. 2003. The influence of pretreatment on cell stage progression and the time of DNA synthesis in barley（Hordeum vulgare L.） uninucleate microspores[J]. Plant Cell Report，21（11）：1065-1071.

Soriano M，Li H，Boutilier K. 2013. Microspore embryogenesis：Establishment of embryo identity and pattern in culture[J]. Plant Reproduction，26（3）：181-196.

Sunderland N. 1974. Anther culture as a means of haploid induction[M]//Kasha K J. Haploids in Higher Plants：Advances and Potential. Guelph：University of Guelph.

Testillano P S，Georgiev S，Mogensen H L，Coronado M J，Dumas C，Risueno M C，Matthys-Rochon E. 2004. Spontaneous chromosome doubling results from nuclear fusion during in vitro maize induced microspore embryogenesis[J]. Chromosoma，112（7）：342-349.

Walley P G，Carder J，Skipper E，Mathas E，Lynn J，Pink D，Buchanan-Wollaston V. 2012. A new broccoli×broccoli immortal mapping population and framework genetic map：Tools for breeders and complex trait analysis[J]. Theore-tical and Applied Genetics，124（3）：467-484.

Zeng A S，Yan J Y，Song L X，Gao B，Zhang Y X，Li J Q，Liu H H，Hou X L，Li Y. 2015. Induction and development of microspore-derived embryos in broccoli 3 white-headed cabbage hybrids microspore culture[J]. Euphytica，203（2）：261-272.

（責任編輯 陳 燕）