楤木胚狀體的誘導(dǎo)及再生體系的建立

孔凡芹， 李樹忠， 黃瑋婷， 方中明，2

(1.武漢生物工程學(xué)院應(yīng)用生物技術(shù)研究中心，湖北武漢 430415； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070)

楤木(Araliachinensis)別名烏龍頭，為五加科楤木屬的多年生落葉灌木或小喬木，是山林地區(qū)所產(chǎn)的藥、菜兩用的名貴野菜[1]，被譽(yù)為“山野菜之王”。楤木的鮮嫩芽富含人體所需的多種氨基酸和大量的礦質(zhì)元素[2]。楤木的干燥根皮、莖皮及葉均可入藥，長(zhǎng)期食用可調(diào)節(jié)神經(jīng)，強(qiáng)身健體，延年益壽[3]。

近年來(lái)，由于野生資源的過(guò)度開采，造成楤木供不應(yīng)求的局面。楤木的繁殖方法分為種子繁殖和營(yíng)養(yǎng)繁殖。由于其種子細(xì)小難收集，深度休眠，需要對(duì)其進(jìn)行4～5個(gè)月的層積處理，給種子繁殖帶來(lái)了極大的不便[4]。營(yíng)養(yǎng)繁殖包括根、莖繁殖等，但由于楤木莖中心髓組織較大，莖插不容易生根[5]，因此根段繁殖是其主要繁殖方式，但繁殖系數(shù)低，且不利于野生資源的保護(hù)[4]。

采用組織培養(yǎng)進(jìn)行快速繁殖是加快楤木繁殖速度的有效途徑，且能保持其優(yōu)良性狀。近20年來(lái)，楤木屬植物在組織培養(yǎng)方面取得較大進(jìn)展，已建立了遼東楤木(A.elata，又名龍牙楤木)成熟的快繁體系[6]，基本建立了長(zhǎng)白楤木(A.continentalis)[7]、云南楤木(A.thomsnii)[8]、食用土當(dāng)歸(A.cordata)[9]等種的快繁體系，遼東楤木等甚至已經(jīng)通過(guò)體細(xì)胞胚的培養(yǎng)制作出了能夠自然發(fā)芽的人工種子[10]。目前有關(guān)楤木組織培養(yǎng)的研究結(jié)果較少。

再生植株的形成共有2條途徑。通過(guò)叢生芽途徑繁殖的苗木相對(duì)較弱小，成苗需要專門壯苗生根，耗時(shí)長(zhǎng)，擴(kuò)繁慢。而通過(guò)體細(xì)胞胚增殖分化途徑，得到的胚狀體不但能實(shí)現(xiàn)快速大量增殖，而且分化的小苗健壯完整。目前楤木屬植物普遍存在的主要問(wèn)題是體細(xì)胞胚定向分化成苗的控制因素尚不清楚，成苗率低，玻璃化較嚴(yán)重，結(jié)果存在偶然性[11-12]，因此，研究楤木體細(xì)胞胚定向分化成苗尤為重要。

本試驗(yàn)建立了楤木愈傷誘導(dǎo)、誘導(dǎo)愈傷分化胚狀體、胚狀體分化成苗、幼苗生根壯苗整個(gè)快繁體系，著重研究了植物激素對(duì)楤木愈傷分化成胚狀體的影響和胚狀體分化成苗的影響，以期為建立和完善楤木高效的快繁體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為甘肅省隴南市宕昌縣山區(qū)野生楤木嫩莖。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 愈傷的誘導(dǎo) 剪取楤木帶葉的嫩莖為外植體，用無(wú)菌水洗凈，先用70%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗1次，再用 0.1% 氯化汞消毒10 min，無(wú)菌水沖洗5次。然后將帶葉的嫩莖切成0.5 cm的莖段，接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面。愈傷誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L，在此基礎(chǔ)上，單獨(dú)添加激素6-BA或2，4-D，濃度梯度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L，探究不同激素對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響。培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間12 h/d，培養(yǎng)溫度(25±1)℃。培養(yǎng)1周后，開始觀察和統(tǒng)計(jì)每種處理愈傷組織的褐化程度、生長(zhǎng)量和愈傷誘導(dǎo)率，篩選楤木愈傷誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。愈傷誘導(dǎo)率=愈傷數(shù)/外植體個(gè)數(shù)×100%。

1.2.2 胚狀體的誘導(dǎo)和增殖 選取誘導(dǎo)培養(yǎng)基中健康的愈傷組織為材料，接種于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭2 g/L+NAA 0.4 mg/L，在此基礎(chǔ)上，單獨(dú)添加激素ZT或2，4-D或 6-BA，濃度梯度為0、0.5、1、1.5、2 mg/L，探究不同激素對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響。胚狀體誘導(dǎo)45 d后，轉(zhuǎn)入胚狀體增殖培養(yǎng)基(同胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基)增殖，探究不同激素對(duì)胚狀體增殖的影響，增殖周期為45 d。在胚狀體誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)后，分別觀察和統(tǒng)計(jì)胚狀體誘導(dǎo)和增殖情況，篩選出楤木胚狀體誘導(dǎo)和增殖的最佳培養(yǎng)基。胚狀體增殖倍數(shù)=增殖出的胚狀體數(shù)/接種的胚狀體數(shù)。

1.2.3 胚狀體分化成苗 選取子葉期的胚狀體作為接種材料，接種于分化培養(yǎng)基中。分化培養(yǎng)基為MS+IAA 0.05 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭2 g/L，在此基礎(chǔ)上，單獨(dú)添加激素ZT或6-BA，濃度梯度分別為0、0.2、0.5、1、1.5、2 mg/L；或單獨(dú)添加KT，濃度梯度為0、1、2、3、4、5 mg/L，探究不同激素對(duì)胚狀體分化的影響。60 d后統(tǒng)計(jì)胚狀體分化的情況。分化率=分化出的苗數(shù)/接種的胚狀體數(shù)。

1.2.4 幼苗的壯苗和生根 選取剛分化出真葉的幼芽為接種材料，接入壯苗和生根培養(yǎng)基中。壯苗和生根培養(yǎng)基為1/2MS+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭2 g/L，在此基礎(chǔ)上，單獨(dú)添加激素IAA、NAA或IBA，濃度梯度為0、0.02、0.05、0.1、0.4、1 mg/L，探究不同激素對(duì)幼苗壯苗和生根的影響。30 d 后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)、根長(zhǎng)、根生長(zhǎng)狀況，篩選出壯苗和生根的最佳培養(yǎng)基。生根率=生根外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)每個(gè)處理接種30瓶，重復(fù)3次。數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行變量分析(ANOVA)，以Duncan’s在0.05水平上進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響

從表1可以看出，不同濃度的2，4-D處理楤木嫩莖，均能誘導(dǎo)出愈傷，其生長(zhǎng)量隨2，4-D濃度增加先增加后降低。當(dāng)2，4-D濃度為1.5 mg/L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)最快，且愈傷只有輕微褐化現(xiàn)象，為楤木嫩莖誘導(dǎo)愈傷的最佳濃度。不同濃度6-BA處理均出現(xiàn)愈傷嚴(yán)重褐化的現(xiàn)象，且愈傷誘導(dǎo)率非常低。當(dāng)6-BA濃度為1 mg/L或1.5 mg/L時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率僅為13.89%。因此適合楤木外植體脫分化并誘導(dǎo)出愈傷的培養(yǎng)基是MS+2，4-D 1.5 mg/L(圖1-A)。

表1不同激素對(duì)楤木愈傷誘導(dǎo)的影響

注：褐化程度：“*”表示褐化輕微，“**”表示褐化較為嚴(yán)重，“***”表示褐化嚴(yán)重，影響進(jìn)一步分化。生長(zhǎng)量中，“*”表示略有生長(zhǎng)，“**”表示每塊接種材料增殖1 cm3以下，“***”表示每塊接種材料增殖1 cm3以上。

2.2 不同激素對(duì)胚狀體誘導(dǎo)和增殖的影響

將愈傷接入胚狀體分化培養(yǎng)基中，30 d后，愈傷出現(xiàn)明顯的綠色胚點(diǎn)。45 d后，綠色胚點(diǎn)增多，并出現(xiàn)突起的淡綠色芽尖。從表2可以看出，不同濃度ZT處理得到的胚性愈傷很少，基本沒有胚點(diǎn)分化。ZT濃度為0.5 mg/L時(shí)愈傷生長(zhǎng)最為健康，其他濃度的ZT處理誘導(dǎo)出的愈傷有少量水漬化現(xiàn)象。不同濃度2，4-D處理得到的胚性愈傷很少，很少有綠色胚點(diǎn)或嫩黃色胚點(diǎn)，僅在1 mg/L時(shí)胚狀體分化效果較好，愈傷能夠分化出2～3個(gè)綠色胚點(diǎn)，且無(wú)水漬化無(wú)褐化現(xiàn)象。6-BA濃度為0.5 mg/L或1 mg/L時(shí)對(duì)愈傷誘導(dǎo)出胚狀體的效果較好，愈傷有較多的綠色胚點(diǎn)，且有魚雷期胚狀體，生長(zhǎng)良好。6-BA濃度大于1 mg/L后，對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)效果較差，愈傷有輕微褐化現(xiàn)象，分化出的少量芽體還被愈傷緊密包裹。因此，楤木胚狀體誘導(dǎo)以0.5 mg/L或1 mg/L 6-BA配合0.4 mg/L NAA的效果最好。

選取誘導(dǎo)出的胚狀體為接種材料，對(duì)胚狀體增殖情況開展研究(表2)。不同濃度ZT處理下的胚狀體玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重，分化的胚狀體多畸形。不同濃度2，4-D處理的胚狀體增殖倍數(shù)低，有玻璃化和退化成愈傷的現(xiàn)象。2，4-D濃度為1 mg/L時(shí)胚狀體增殖倍數(shù)顯著高于其他濃度處理，低濃度(0.5 mg/L)容易引起胚狀體玻璃化，而高濃度(1.5、2 mg/L)容易引起胚狀體再變成愈傷。6-BA處理的胚狀體增殖較快，以0.5 mg/L的6-BA增殖倍數(shù)最大，為11.337倍，與其他各組處理存在顯著差異。在6-BA濃度大于 0.5 mg/L 后，增殖倍數(shù)隨著濃度增加而逐漸降低，6-BA濃度達(dá)到 2 mg/L 時(shí)，增殖系數(shù)急劇減少，胚狀體質(zhì)量大幅度降低。通過(guò)胚狀體的誘導(dǎo)和增殖的整體效果可知，0.5 mg/L 6-BA配合0.4 mg/L NAA對(duì)楤木胚狀體誘導(dǎo)和增殖的效果最好(圖1-B、圖1-C)。

表2不同激素對(duì)楤木胚狀體誘導(dǎo)和增殖的影響

注：“胚狀體”列中，“*”表示優(yōu)良胚狀體占有總生物量的比例為20%以下，“**”表示20%～30%，“***”表示>30%～40%，“****”表示>40%～50%，“*****”表示50%以上。成型苗指分化出2張以上真葉的完整苗，“-”表示基本沒有，“*”表示每瓶3株以下，“**”表示每瓶3～5株。

2.3 不同激素對(duì)胚狀體分化成幼苗的影響

選取質(zhì)量較好的胚狀體為接種材料，探究不同激素對(duì)胚狀體分化成幼苗的影響。從表3可以看出，不同濃度6-BA處理中，以0.5 mg/L或1 mg/L濃度時(shí)胚狀體分化成苗率相對(duì)較高，苗長(zhǎng)和根長(zhǎng)生長(zhǎng)狀況也較好。當(dāng)6-BA濃度達(dá)到 1.5 mg/L 以上時(shí)，誘導(dǎo)的苗株嚴(yán)重畸形、玻璃化。不同濃度ZT處理中，誘導(dǎo)苗分化的分化率均比相同濃度的6-BA處理明顯提高，且植株長(zhǎng)勢(shì)健壯，根系發(fā)達(dá)。ZT 1 mg/L或 1.5 mg/L 濃度處理，苗較為健壯；而ZT 0.5 mg/L處理時(shí)分化率最高，達(dá)4.069，與其他各組處理存在顯著差異。當(dāng)ZT濃度達(dá)到2 mg/L時(shí)，苗株的生長(zhǎng)狀況較差，且分化率下降至1.625。KT誘導(dǎo)胚狀體分化試驗(yàn)表明，分化率較低，接入的材料容易死亡，已分化的幼苗生長(zhǎng)狀態(tài)較差，幼苗纖細(xì)矮小，葉淡黃色。綜合分析表明，可選用0.5 mg/L ZT+0.05 mg/L IAA作為胚狀體分化成幼苗的培養(yǎng)基，通過(guò)壯苗可得到大量健壯的苗株(圖1-D)。

表3不同激素對(duì)楤木胚狀體分化的影響

2.4 不同激素對(duì)幼苗壯苗和生根的影響

將有3張以上真葉且生長(zhǎng)狀態(tài)一致的幼苗，接入不同生根培養(yǎng)基，觀察和統(tǒng)計(jì)不同激素對(duì)幼苗壯苗和生根的影響(表4)。結(jié)果表明，0.1 mg/L NAA處理生根率最高，達(dá)到98.6%，與其余各組生根率存在顯著差異。當(dāng)激素濃度達(dá)到1 mg/L時(shí)，IAA、NAA、IBA 3種激素處理均出現(xiàn)幼苗大量枯死的現(xiàn)象，說(shuō)明高濃度的生長(zhǎng)素不適合幼苗生長(zhǎng)及生根。以上結(jié)果表明，楤木壯苗和生根誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基是1/2MS+0.1 mg/L NAA(圖1-E)。

3 討論

本試驗(yàn)前期在誘導(dǎo)楤木外植體愈傷過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，嫩莖和幼葉誘導(dǎo)愈傷的速度存在較大差異，嫩莖誘導(dǎo)出愈傷的速度快，且愈傷組織質(zhì)地疏松，顏色偏白色；而幼葉誘導(dǎo)愈傷速度慢，但是愈傷組織質(zhì)地致密，顏色偏向淡黃色，故本研究選用嫩莖作為外植體材料進(jìn)一步擴(kuò)大試驗(yàn)。這與李正楠等發(fā)現(xiàn)龍芽楤木同一植株的不同部位做外植體誘導(dǎo)愈傷的難易程度和愈傷的胚性化難易存在很大的差異[13-14]。本試驗(yàn)在胚狀體誘導(dǎo)與增殖過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中不加入激素時(shí)胚狀體難以分化，且分化出的少量胚狀體生長(zhǎng)畸形嚴(yán)重，說(shuō)明外源激素是胚狀體分化的必要因素，這與王仲慧等的外源激素對(duì)半夏胚狀體誘導(dǎo)的結(jié)果[15]相似。6-BA、ZT、 2，4-D對(duì)胚狀體誘導(dǎo)效果差異較大，6-BA誘導(dǎo)隨著繼代次數(shù)的增加，只要激素濃度緩慢減少，胚狀體誘導(dǎo)數(shù)量越來(lái)越多。2，4-D繼代誘導(dǎo)過(guò)程中，第二次繼代產(chǎn)生大量胚狀體在繼續(xù)培養(yǎng) 15 d 左右后胚狀體全部枯萎。閔子揚(yáng)等發(fā)現(xiàn)胚狀體誘導(dǎo)出后，轉(zhuǎn)接誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)胚狀體繼續(xù)發(fā)育影響極大[16]。達(dá)克東等認(rèn)為胚狀體對(duì)外源激素反應(yīng)靈敏，只有外源激素與內(nèi)源激素達(dá)到某種平衡時(shí)才能誘導(dǎo)胚狀體繼續(xù)發(fā)育[17-18]。由此可知，胚狀體在繼代培養(yǎng)過(guò)程中不斷在體內(nèi)積累了可觀的激素，多次繼代需要不斷降低誘導(dǎo)激素的濃度。

表4不同激素對(duì)楤木生根的影響

近年來(lái)，體細(xì)胞胚的發(fā)生機(jī)制的研究已經(jīng)比較深入，大部分研究者認(rèn)為胚狀體是由一個(gè)細(xì)胞分裂的， 因?yàn)橹参锛?xì)胞的全能性證明它們有單細(xì)胞繁殖的強(qiáng)大潛力，認(rèn)為體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程是由一個(gè)圓形細(xì)胞經(jīng)過(guò)激素刺激后胚性化[10]，胚性細(xì)胞在愈傷內(nèi)或表面分裂成頂細(xì)胞和基細(xì)胞，后發(fā)育成為胚狀體。在本試驗(yàn)2，4-D楤木誘導(dǎo)胚狀體的第一次繼代和第三次繼代中，出現(xiàn)了愈傷組織表面出現(xiàn)綠色斑點(diǎn)，后聚集突起成為魚雷期或子葉期胚狀體的現(xiàn)象，與單細(xì)胞發(fā)育成胚狀體的描述差異較大，更與多個(gè)細(xì)胞聚集生成胚狀體的描述相似[19]，所以筆者認(rèn)為胚狀體誘導(dǎo)中以單細(xì)胞起源為主，并與多細(xì)胞集合體共存，具體情況因?yàn)檎T導(dǎo)激素的種類和濃度不同而存在著差異。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，楤木胚狀體由增殖培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接到幼苗分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，未分化出2張以上真葉的胚狀體接入后極易玻璃化或者死亡，而分化出真葉后分離接入或者將幾個(gè)魚雷期[20]胚狀體與其相連的愈傷組織一同接入苗分化培養(yǎng)基之后則能極大提高成活率和分化率。呂晉惠等認(rèn)為，胚狀體的分化是因?yàn)榕郀铙w內(nèi)源激素與外源激素達(dá)到某種平衡之后才會(huì)發(fā)生，據(jù)此而論，胚狀體分化出真葉后擁有較強(qiáng)的產(chǎn)生激素的能力，所以能夠完成進(jìn)一步的分化[18]。胚狀體聚集之后提高分化率可能是因?yàn)橄嗷ミB接的胚狀體能夠共同完成激素的互通調(diào)節(jié)，優(yōu)先完成一個(gè)或幾個(gè)胚狀體的分化，而后反過(guò)來(lái)支持其他胚狀體分化，提高分化率。

本研究結(jié)果表明，楤木愈傷誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 2，4-D，誘導(dǎo)率達(dá)100%；楤木胚狀體誘導(dǎo)和增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA，胚狀體分化率達(dá)50%以上，增殖倍數(shù)達(dá)11.337倍；胚狀體分化成苗的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L ZT+0.05 mg/L IAA，分化率達(dá)4.069；壯苗生根的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.1 mg/L NAA，生根率達(dá)98.6%。

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