CBF冷信號(hào)通路基因在熱處理誘導(dǎo)的香蕉抗病性中的作用

李 璐， 張昭其， 龐學(xué)群， 王海波

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州 510642； 3.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510520)

熱處理是提高果蔬抗冷性的最有效采后處理之一，熱處理主要通過誘導(dǎo)CBF冷信號(hào)通路基因表達(dá)增強(qiáng)進(jìn)而提高香蕉果實(shí)的抗冷性[1-2]。病害是熱帶亞熱帶果蔬貯運(yùn)保鮮中存在的主要問題之一，值得注意的是，熱處理也能夠大大提高香蕉的抗病性。我們推測(cè)，熱處理在誘導(dǎo)抗冷性和抗病性方面可能具有共同的機(jī)理。因此，研究CBF冷信號(hào)通路基因在熱處理誘導(dǎo)香蕉果實(shí)抗病中的作用，將有助于進(jìn)一步了解采后香蕉果實(shí)抗病機(jī)理。研究表明，熱處理能有效提高采后果實(shí)的抗病性。例如，60 ℃ 30～60 s的熱水浸泡處理能顯著地降低加利福尼亞桃、油桃、李子等水果褐斑病發(fā)生率[3]。熱處理也可有效抑制蘋果、梨果實(shí)貯藏過程中病蟲害及腐爛的發(fā)生[4]，使其在長(zhǎng)期的低溫冷藏過程中仍然保持較好的貯藏品質(zhì)。龐學(xué)群等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將香蕉果實(shí)進(jìn)行熱處理后恢復(fù)至室溫一段時(shí)間再接種外源炭疽菌孢子，發(fā)現(xiàn)熱處理后的恢復(fù)對(duì)于誘導(dǎo)果實(shí)的抗病性具有較好效果[5]。在冷信號(hào)途徑的研究過程中發(fā)現(xiàn)，CBF類基因作為冷信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控基因在提高植物抗冷性中起重要作用。模式植物上的研究表明，低溫轉(zhuǎn)錄因子CBF調(diào)控的信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能是誘導(dǎo)植物抗冷性提高的最重要途徑，即ICE-CBF-COR通路。CBF是該途徑中基因表達(dá)的“主開關(guān)”，受ICE調(diào)控的CBF轉(zhuǎn)錄因子能夠特異結(jié)合啟動(dòng)子中含有CRT/DRE(C-repeat/dehydration responsive element)的順式元件，可以激活下游一系列冷調(diào)節(jié)基因COR的表達(dá)，從而提高擬南芥等植物的抗寒性[6-9]。Peng等研究發(fā)現(xiàn)，高溫和低溫均能誘導(dǎo)CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)基因的表達(dá)[10]。4 ℃低溫誘導(dǎo)了蝴蝶蘭PaCBF1在4 h開始表達(dá)，24 h達(dá)到最高峰。在擬南芥中過表達(dá)PaCBF1，誘導(dǎo)了AtCOR6.6和RD29a表達(dá)的增強(qiáng)?？紤]到熱處理可同時(shí)誘導(dǎo)采后香蕉果實(shí)的抗病性和抗冷性，CBF類基因在采后香蕉果實(shí)抗病誘導(dǎo)過程中是否起到一定的作用還不清楚，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。熱水處理能否通過CBF冷應(yīng)答途徑從而提高香蕉果實(shí)的抗病性，目前尚無報(bào)道。本試驗(yàn)著重在于探索CBF冷信號(hào)基因通路對(duì)病害脅迫的響應(yīng)，探討熱處理是否能通過CBF途徑途徑增強(qiáng)采后香蕉果實(shí)的抗病性，研究CBF冷信號(hào)通路的相關(guān)基因在熱水處理誘導(dǎo)香蕉抗病性中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

本試驗(yàn)所使用的試驗(yàn)材料為香蕉品種“巴西”(Musaspp. cv. Cavendish)，購(gòu)自于廣東省廣州市南沙區(qū)香蕉園，采收飽滿度及成熟度為70%～80%的青硬綠熟香蕉，在果園進(jìn)行初步落梳處理后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，挑選大小均勻、無病蟲害及機(jī)械損傷的香蕉果指。先用清水對(duì)挑選后的香蕉果指進(jìn)行清洗，再用濃度為0.1%漂白粉溶液和0.05%咪鮮胺溶液各浸泡5 min，晾干備用。

熱處理(hot water dipping，HWD)：將上述香蕉果實(shí)分為3份，其中1份浸入熱水處理機(jī)(體積為400 L)中，溫度為 52 ℃，時(shí)間為3 min，取出晾干，并接種炭疽病菌孢子，用聚乙烯薄膜袋(厚度0.03 mm)包裝后放入(20±2) ℃恒溫箱中貯藏，作為熱處理+接種處理組。另外2份香蕉果實(shí)在25 ℃水中浸泡3 min后，取出晾干，其中1份接種炭疽病菌孢子，用聚乙烯薄膜袋(厚度0.03 mm)包裝后放入(20±2) ℃恒溫箱中貯藏，作為接種處理組；將剩余的1份香蕉果實(shí)直接用聚乙烯薄膜袋(厚度0.03 mm)包裝后放入(20±2) ℃恒溫箱中作為對(duì)照組。每處理70個(gè)香蕉果指，重復(fù)3次。在0 h、3 h、5 d、8 d、12 d、14 d、16 d取樣備用。

炭疽病菌接種處理：炭疽病菌種由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院采后科學(xué)與技術(shù)系提供，菌種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基(PDA)上培養(yǎng)7 d后在超凈工作臺(tái)中用無菌水和刷子刷下粉紅色的孢子，在顯微鏡下觀察并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子濃度，然后再用無菌水將孢子液稀釋到2×105CFU/mL的濃度。將配制好濃度的炭疽病菌接種到經(jīng)過常溫自來水浸泡過3 min的香蕉果指上，用接種針在香蕉果指的側(cè)面刺3個(gè)等距離的小孔，小孔的深度約1 mm，直徑約1 mm，間距約5 cm，用吸水紙吸去果皮表面的乳液，將10 μL懸浮孢子液滴入小孔中，接種面朝上放置于塑料筐中，再用聚乙烯薄膜袋(厚度 0.03 mm)包裝。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量引物設(shè)計(jì) 從香蕉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//banana-genome.cirad.fr/)中搜索并挑選CBF冷信號(hào)通路中的6個(gè)相關(guān)基因序列(表1)，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物，驗(yàn)證后備用。

表1引物序列

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用儀器為BIO-RAD CFX9600，采用TOYOBO THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)體系(20 μL)包括10 μL SYBR-Green PCR Master Mix，0.25 μL上游(10 μmol/L)和0.25 μL下游引物(10 μmol/L)，2 μL稀釋的cDNA以及7.5 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，循環(huán)數(shù)為40。為了確認(rèn)產(chǎn)物的質(zhì)量和引物的特異性，在溶解曲線中分析了產(chǎn)物的Tm(分析溶解溫度為65～95 ℃)。利用基因Actin1[11]作為內(nèi)參基因。所有的qRT-PCR反應(yīng)根據(jù)內(nèi)參基因Actin1進(jìn)行Ct值校準(zhǔn)，目的基因的相對(duì)表達(dá)水平利用公式2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算，重復(fù)3次。

1.2.3 病斑的測(cè)定 以病斑擴(kuò)展垂直2個(gè)方向的平均寬度計(jì)算病斑大小(mm)[5]。

1.2.4 脯氨酸的測(cè)定 測(cè)定方法主要參照Demiral等的實(shí)驗(yàn)方法[12]，略有改動(dòng)。

1.2.4.1 試劑 2.5%酸性茚三酮溶液、3%磺基水楊酸、冰乙酸、甲苯。

1.2.4.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別配制1～10 μg/mL之間的6個(gè)點(diǎn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，取2 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液加2 mL 3%磺基水楊酸、2 mL冰乙酸和4 mL 2.5%茚三酮，沸水浴顯色30～60 min，冷卻。加4 mL甲苯萃取，靜置后取甲苯相測(cè)定 520 nm 下的吸光度(以甲苯為空白對(duì)照；D520 nm大小在0.2～0.8之間為佳，若值太高則可以用甲苯適當(dāng)稀釋)，依據(jù)脯氨酸含量和相應(yīng)吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.3 樣品的測(cè)定 脯氨酸的提?。喝∠憬豆?.5 g，5 mL 3%磺基水楊酸提取，沸水浴10 min，冷卻。5 000 r/min離心10 min，取上清液待測(cè)。

測(cè)定：取2 mL上清液，加2 mL水，下面步驟同繪制標(biāo)曲方法一致。然后根據(jù)下式計(jì)算脯氨酸含量：

單位鮮質(zhì)量樣品中脯氨酸含量(μg/g)=2.5C/m。

式中：C為根據(jù)標(biāo)曲得出樣品溶液中脯氨酸濃度(μg/mL)，m為樣品質(zhì)量(g)，2.5表示溶液體積為2.5 mL。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Sigmaplot 12.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理對(duì)采后香蕉果實(shí)病斑發(fā)展的影響

由圖1可見，采后香蕉果實(shí)在0 d時(shí)接種炭疽病菌種，接種病斑直徑為2 mm。隨著貯藏時(shí)間的推移，無論是對(duì)照組還是熱處理+接種組，所接種的病斑直徑均呈逐漸增大的趨勢(shì)，12 d后病斑明顯增大。在0～14 d，熱水處理+接種組的病斑發(fā)展緩慢，明顯低于對(duì)照組，但在16 d時(shí)病斑發(fā)展呈現(xiàn)出暴發(fā)的癥狀。可見，與對(duì)照組相比，熱處理能較好地誘導(dǎo)采后香蕉果實(shí)的抗病性。

2.2 熱處理對(duì)采后香蕉果實(shí)脯氨酸含量的影響

由圖2可見，對(duì)照組的脯氨酸含量在3 h變化基本不大，在5 d后脯氨酸含量開始上升；與對(duì)照相比，熱處理誘導(dǎo)了香蕉果實(shí)脯氨酸含量的提高，約提高70%左右，熱處理果實(shí)接種后進(jìn)一步提高了脯氨酸含量，約是對(duì)照的3倍左右。

2.3 熱處理對(duì)香蕉果實(shí)MaICE表達(dá)的影響

由圖3可知，香蕉果實(shí)在常溫貯藏16 d，對(duì)照的MaICE基因表達(dá)逐漸升高，在5 d時(shí)出現(xiàn)峰值，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。果實(shí)接種處理和熱處理果實(shí)接種后的MaICE基因表達(dá)則一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在8 d時(shí)分別比對(duì)照組低了約90%和95%。結(jié)合病情指數(shù)(圖1)熱處理能夠明顯減輕病害暴發(fā)，但病害脅迫和熱處理誘導(dǎo)的抗病效果下調(diào)了MaICE基因的表達(dá)，推測(cè)該基因可能與病害響應(yīng)相關(guān)。

2.4 熱處理對(duì)香蕉果實(shí)DREB類基因表達(dá)的影響

由圖4可知，對(duì)照組中MaDREB1D基因在常溫貯藏5 d和16 d時(shí)有2個(gè)表達(dá)高峰，且在16 d時(shí)表達(dá)量較高；果實(shí)接種后在常溫貯藏14 d時(shí)有1個(gè)表達(dá)高峰，約為對(duì)照組的2.2倍；熱處理果實(shí)接種后在3 h、5 d處有較高的表達(dá)量，并且在后期14～16 d又有持續(xù)較高的表達(dá)量，在14 d時(shí)有1個(gè)表達(dá)高峰，約為對(duì)照組的2倍。對(duì)比MaDREB1D基因表達(dá)量可知，對(duì)照組在5～8 d表達(dá)量持續(xù)較高，同時(shí)在后期14～16 d表達(dá)量亦較高，推測(cè)與果實(shí)后熟有關(guān)；明顯病癥出現(xiàn)前，該基因在果實(shí)接種組比熱處理果實(shí)接種組表達(dá)高，后期各處理表達(dá)都提高了大約1倍?？梢酝茰y(cè)病害脅迫誘導(dǎo)了MaDREB1D基因的表達(dá)。

由圖5可知，在對(duì)照組常溫貯藏中MaDREB1E基因表達(dá)在5～8 d時(shí)達(dá)到1個(gè)高峰，之后呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)；與對(duì)照組相比，果實(shí)接種后在常溫貯藏中MaDREB1E基因表達(dá)在3 h時(shí)達(dá)到1個(gè)高峰，表達(dá)量提高了50倍左右，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；熱處理果實(shí)接種后對(duì)于MaDREB1E基因表達(dá)同樣在3 h處有1個(gè)表達(dá)高峰，表達(dá)量提高了30倍左右，之后的8 d也有1個(gè)表達(dá)高峰期，接著呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。從0～3 h基因表達(dá)可以推測(cè)病害脅迫或者接種機(jī)械傷誘導(dǎo)了MaDREB1E基因表達(dá)；從對(duì)照組在5～8 d表達(dá)量的提高分析也可能是貯藏過程中病害脅迫誘導(dǎo)了MaDREB1E基因表達(dá)。

由圖6可知，對(duì)照組在常溫貯藏5 d時(shí)有1個(gè)表達(dá)高峰；與對(duì)照組相比，果實(shí)接種后在常溫貯藏過程中表達(dá)量整體呈現(xiàn)平穩(wěn)上升趨勢(shì)，在16 d時(shí)提高了25倍左右；熱處理果實(shí)接種后3 h開始MaDREB1G基因表達(dá)處于較高的水平，并在8 d時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰，到16 d時(shí)提高了20倍左右?？芍?，果實(shí)接種組和熱處理果實(shí)接種組均誘導(dǎo)了MaDREB1G基因表達(dá)的上調(diào)，這可能與貯藏過程中香蕉的病害脅迫有關(guān)。熱處理接種組的基因表達(dá)整體上高于果實(shí)接種組，可以推測(cè)在后期的貯藏過程中病害脅迫對(duì)于MaDREB1G基因表達(dá)有很強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，同時(shí)MaDREB1G基因?qū)崽幚碚T導(dǎo)的抗病性也有一定的響應(yīng)。

由圖7可知，對(duì)照組在常溫貯藏下MaDREB3基因表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)；與對(duì)照組相比，果實(shí)接種后在常溫貯藏下MaDREB3基因表達(dá)量也呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，無明顯差異性；熱處理果實(shí)接種后在3 h有1個(gè)表達(dá)高峰，之后一直呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，也無明顯的差異性?？梢酝茰y(cè)，病害對(duì)MaDREB3基因表達(dá)沒有誘導(dǎo)作用，MaDREB3基因?qū)崽幚碚T導(dǎo)的抗病性沒有響應(yīng)。

2.4 熱處理對(duì)香蕉果實(shí)MaCOR413表達(dá)的影響

由圖8可知，對(duì)照組在常溫貯藏下MaCOR413基因表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，果實(shí)接種組和熱處理果實(shí)接種組在常溫貯藏下MaCOR413基因表達(dá)量也同樣呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。對(duì)比基因表達(dá)量的趨勢(shì)，果實(shí)接種組和熱處理果實(shí)接種組在8～14 d表達(dá)量略高于對(duì)照組，但二者整體呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，且無明顯差異性，可以推測(cè)病害和熱處理誘導(dǎo)的抗病性在8 d以后對(duì)MaCOR413基因表達(dá)有明顯的誘導(dǎo)作用。

3 討論與結(jié)論

熱處理常被用于香蕉、芒果等熱帶水果的采后處理[13-14]，可以顯著提高它們的抗冷和抗病能力[1，15]，然而，香蕉等水果的抗冷誘導(dǎo)機(jī)制是否與抗病誘導(dǎo)機(jī)制相關(guān)目前尚不清楚。本試驗(yàn)通過比較熱處理對(duì)采后香蕉果實(shí)病斑大小和脯氨酸含量的影響，并同時(shí)分析了抗病誘導(dǎo)過程中誘導(dǎo)CBF冷信號(hào)通路基因的表達(dá)規(guī)律，表明熱處理可抑制炭疽病的發(fā)生，并發(fā)現(xiàn)抗病誘導(dǎo)與冷信號(hào)通路基因具有一定的關(guān)系。由于熱處理能夠提高采后芒果果實(shí)抗冷性蛋白的含量[16]，同時(shí)也能夠誘導(dǎo)采后香蕉果實(shí)DREB/CBF類轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)產(chǎn)生抗冷性，但是在熱處理提高采后香蕉果實(shí)抗病性的同時(shí)是否也能夠誘導(dǎo)DREB/CBF類轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)目前還不清楚。

脯氨酸含量的升高可以減輕桃果實(shí)、小麥等果實(shí)的冷害脅迫[17-18]。本研究結(jié)果表明，熱處理誘導(dǎo)的香蕉果實(shí)抗病性可以明顯降低接種炭疽病菌后的病斑直徑和促進(jìn)脯氨酸含量的升高，表明熱處理提高了香蕉果實(shí)的抗病力和抗脅迫能力。DREB/CBF類轉(zhuǎn)錄因子即干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白質(zhì)/C-重復(fù)序列結(jié)合子，是AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)亞家族，擁有保守的AP2結(jié)構(gòu)域，能夠特異性地與抗逆基因啟動(dòng)子區(qū)域的DRE/CRT順式作用元件相結(jié)合，在干旱、低溫和高鹽等非生物脅迫條件下調(diào)節(jié)一系列下游逆境應(yīng)答基因的表達(dá)，是植物逆境適應(yīng)中的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子[19]。DREB/CBF類轉(zhuǎn)錄因子在識(shí)別冷誘導(dǎo)響應(yīng)元件，干旱以及植物抵抗非生物脅迫過程中具有非常重要的作用[20-21]。然而，對(duì)于DREB/CBF類轉(zhuǎn)錄因子能否通過熱處理誘導(dǎo)的冷信號(hào)途徑進(jìn)一步提高植物的抗病害能力，目前還不太清楚。有研究表明，對(duì)于DREB/CBF類轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因大豆植物，在干旱和水分正常的條件下，對(duì)生長(zhǎng)在土壤中的疫霉菌、鐮刀菌、木霉菌、自生固氮菌等土壤中的真菌菌落和菌落直徑并沒有顯著的影響[22]。在茄子抗青枯病研究中，通過研究DREB/CBF類轉(zhuǎn)錄因子表明，也沒有抗青枯病防御應(yīng)答反應(yīng)[23]。有關(guān)研究表明，熱處理可以激活香蕉果實(shí)中與抗逆性相關(guān)的酶活，誘導(dǎo)抗逆性相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而提高采后香蕉果實(shí)的抗冷性[24-25]和抗病性[5]，本試驗(yàn)的結(jié)果中熱水處理誘導(dǎo)能夠提高采后香蕉果實(shí)抗病能力與之相類似。

冷信號(hào)通路基因?qū)Σ『γ{迫時(shí)有部分基因產(chǎn)生了響應(yīng)。通過分析可知MaDREB1D、MaDREB1E、MaDREB1G基因?qū)Σ『γ{迫和熱處理后接種炭疽病菌有一定的響應(yīng)，基因表達(dá)量在3 h處有所提高，然而并不是所有冷信號(hào)通路的基因表達(dá)量都呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。MaDREB1D基因在病害脅迫貯藏3 h時(shí)有一個(gè)瞬時(shí)響應(yīng)，之后的貯藏期間都基本上是高表達(dá)的狀態(tài)。同樣，MaDREB1E基因在接種炭疽病菌后的3 h、5 d時(shí)產(chǎn)生了瞬間高表達(dá)的響應(yīng)，之后的貯藏過程中卻并沒有高表達(dá)量的響應(yīng)，推測(cè)可能是病害雖然誘導(dǎo)了冷信號(hào)通路基因MaDREB1E的前期響應(yīng)，基因表達(dá)量有所提高，但并沒持續(xù)保持基因的高表達(dá)來響應(yīng)病害的誘導(dǎo)。對(duì)于MaDREB1G基因而言，接種炭疽病菌后，并沒及時(shí)地響應(yīng)病害脅迫的誘導(dǎo)，基因表達(dá)與對(duì)照差異不大，隨著后期貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，到了12 d時(shí)，MaDREB1G基因有了持續(xù)比對(duì)照組較高的表達(dá)量?？梢酝茰y(cè)MaDREB1G基因前期不受病害脅迫的誘導(dǎo)，后期響應(yīng)了病害脅迫的誘導(dǎo)。到了貯藏后期，病害的暴發(fā)對(duì)采后香蕉果實(shí)的傷害起到了主要作用，此時(shí)熱處理誘導(dǎo)的MaDREB1G基因表達(dá)上調(diào)對(duì)病害暴發(fā)有一定的抑制作用。由此可知，病害脅迫和熱處理后接種炭疽病菌對(duì)冷信號(hào)通路基因的表達(dá)都有促進(jìn)作用。

綜上所述，熱處理可以提高采后香蕉果實(shí)的抗病能力。病害脅迫對(duì)CBF冷信號(hào)通路基因MaDREB1D、MaDREB1E、MaDREB1G、MaCOR413的表達(dá)有一定的增強(qiáng)作用，推測(cè)CBF冷信號(hào)通路基因可能在一定程度上參與了熱處理誘導(dǎo)的抗病性提高。有關(guān)冷信號(hào)相關(guān)基因在熱處理提高采后香蕉果實(shí)抗病性中的作用還需要進(jìn)一步研究探索。

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