安徽烏菜游離小孢子培養(yǎng)及植株再生體系建立

秦艷梅+王明霞+江海坤+嚴(yán)從生+王艷+田紅梅+張其安+方凌

摘 要：以6份安徽烏菜為試材，研究基因型、6-BA、AG對烏菜小孢子胚狀體發(fā)生的影響及6-BA對植株再生的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同基因型烏菜的小孢子胚誘導(dǎo)率具有明顯差異，6份烏菜材料中有3份誘導(dǎo)出胚狀體，H-4出胚率最高，平均每花蕾誘導(dǎo)8.76個胚；NLN-13培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L 6-BA和AG 10 mg/L均能促進(jìn)胚狀體發(fā)生，后者促進(jìn)作用更明顯；MS培養(yǎng)基中添加1 mg/L 6-BA可提高烏菜胚狀體成苗率。

關(guān)鍵詞：烏菜；小孢子培養(yǎng)；誘導(dǎo)率；胚狀體；植株再生

中圖分類號：S634.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-3547（2017）06-0029-04

安徽烏菜是安徽省名優(yōu)特產(chǎn)，是十字花科蕓薹屬白菜亞種的一個變種，雜種優(yōu)勢明顯，常規(guī)雜交法育種年限較長，結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行烏菜育種對提高育種水平和效率至關(guān)重要。

游離小孢子培養(yǎng)是育種中最有效的生物技術(shù)之一，在大白菜、不結(jié)球白菜、菜薹等十字花科蔬菜作物上多有報(bào)道[1～4]，而對于烏菜的小孢子培養(yǎng)研究較少，存在胚狀體誘導(dǎo)率低的問題。本試驗(yàn)選用6份不同基因型的安徽烏菜為試材，進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，探討6-BA（6-芐氨基嘌呤）和AG（阿拉伯半乳聚糖）對烏菜游離小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率的影響及6-BA對胚狀體植株再生的影響，為建立優(yōu)化烏菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用安徽地方烏菜材料6份，材料編號1403、1404、1408、1416、1418、H-4。

試驗(yàn)材料于2015年9月6日播種，10月4日定植，露地栽培，常規(guī)管理。2015年12月，每份材料選取10株移植到塑料大棚。2016年3～4月初花期至盛花期選取適宜大小的花蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

①胚誘導(dǎo)培養(yǎng) 小孢子培養(yǎng)基本操作流程參照申書興等[5]大白菜游離小孢子培養(yǎng)方法。在初花期至盛花期，于晴天8：00～10：00，選取健壯、大小適宜的花蕾（花瓣與花藥長度比例1∶2～3∶4，多數(shù)小孢子處于單核靠邊期），以主枝和一級側(cè)枝上的花蕾為宜。放入25 mL無菌小燒杯中，首先用70%酒精消毒30 s，其次用2.5% NaClO溶液消毒5 min，然后用無菌水沖洗3次；加入B5無菌液體培養(yǎng)基，用玻璃棒輕輕擠壓使小孢子游離出來，經(jīng)350目濾網(wǎng)過濾，收集濾液于15 mL旋蓋離心管中，于1 000 r/min離心3 min，棄上清，重復(fù)2次，得游離純化的小

孢子。

將分離純化后的小孢子分別附加0、0.2、

0.4 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）或0、5、10、20 mg/L阿拉伯半乳聚糖（AG）的 NLN-13 培養(yǎng)基制成懸浮液，添加活性炭0.1 mg/mL，調(diào)整小孢子密度約1×105個/L，分裝于直徑60 mm的無菌培養(yǎng)皿中，以Parafilm膜封口，每份材料取花蕾25個，分裝于4 皿培養(yǎng)，重復(fù) 3 次。33℃黑暗熱激培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)入25℃黑暗條件下培養(yǎng)，有肉眼可見的胚出現(xiàn)時，轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)速60 r/min的搖床上繼續(xù)暗培養(yǎng)至形成子葉型胚狀體，3周后統(tǒng)計(jì)胚狀體數(shù)目。②胚狀體植株再生 利用附加濃度為0、1 mg/L 6-BA，10 g/L瓊脂，30 g/L蔗糖的MS固體無菌培養(yǎng)基作為胚狀體成苗培養(yǎng)基，將獲得的烏菜成熟胚狀體轉(zhuǎn)接入成苗培養(yǎng)基中，3周后統(tǒng)計(jì)成苗率。

2 結(jié)果與分析

2.1 供體基因型的影響

在6份烏菜材料游離小孢子培養(yǎng)中，有3份誘導(dǎo)出胚狀體（H-4、1404、1408），占參試材料的50%。

其中H-4產(chǎn)胚能力較強(qiáng)，在添加10 mg/L AG的 NLN-13培養(yǎng)基中，平均每花蕾可誘導(dǎo)8.76個胚；1408次之，平均每花蕾可誘導(dǎo)2.91個胚；1404平均每花蕾可誘導(dǎo)1.16個胚。而1403、1416、1418則沒有胚狀體產(chǎn)生。可見，不同基因型烏菜材料的小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率存在差異。

2.2 6-BA對烏菜小孢子胚狀體誘導(dǎo)的影響

在NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入不同濃度的6-BA，胚狀體誘導(dǎo)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖1。對于能誘導(dǎo)出胚的3份材料，6-BA濃度對胚狀體誘導(dǎo)率的影響均呈單峰變化，低濃度的6-BA對烏菜小孢子胚誘導(dǎo)有一定的促進(jìn)作用。當(dāng)6-BA濃度為0.2 mg/L時，胚誘導(dǎo)率達(dá)到最高，烏菜1404、1408、H-4平均每花蕾誘導(dǎo)胚狀體數(shù)目依次為3.64、1.16、0.68個。

2.3 AG對胚狀體誘導(dǎo)的影響

在NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入不同濃度AG，25℃暗培養(yǎng)20 d，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明（圖2），低濃度的AG對烏菜小孢子胚誘導(dǎo)有一定的促進(jìn)作用，高濃度的AG則有抑制作用。當(dāng)AG濃度為10 mg/L時，胚誘導(dǎo)率達(dá)到最高，3份供試烏菜的胚狀體誘導(dǎo)率隨濃度變化趨勢表現(xiàn)一致。

2.4 6-BA對胚狀體成苗的影響

選擇成熟的烏菜胚狀體轉(zhuǎn)接入成苗培養(yǎng)基（圖3），表1中結(jié)果表明，在MS培養(yǎng)基中加入1 mg/L 6-BA可提高烏菜試材1408和H-4的胚狀體成苗率，且促進(jìn)作用顯著，但1404的胚狀體并未形成雙單倍體植株，說明在培養(yǎng)基中添加6-BA并不是對所有基因型的烏菜胚狀體成苗具有促進(jìn)作用。

3 結(jié)論與討論

小孢子胚胎發(fā)生能力受基因調(diào)控。在白菜小孢子培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，不同基因型間小孢子胚狀體誘導(dǎo)率差異很大[1，6，7]。本試驗(yàn)中6份供試烏菜有3份可誘導(dǎo)出胚狀體，成功率為50%，不同基因型烏菜出胚率差異較大，與前人在其他作物上相關(guān)研究結(jié)果一致。

適量的6-BA 可顯著提高白菜小孢子胚狀體或愈傷組織誘導(dǎo)率[2～4]；蔣武生等[8]則認(rèn)為加入 6-BA和NAA抑制大白菜小孢子胚發(fā)生。AG對小麥、大白菜和普通白菜小孢子培養(yǎng)胚發(fā)生和直接成苗有促進(jìn)作用[9，10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在NLN-13培養(yǎng)基中分別添加6-BA和 AG可大大提高烏菜小孢子胚狀體誘導(dǎo)率，促進(jìn)小孢子細(xì)胞發(fā)育由配子體途徑向孢子體途徑轉(zhuǎn)變。在一定程度上解決烏菜胚狀體誘導(dǎo)率低的問題，但是本試驗(yàn)中6份供試材料僅3份誘導(dǎo)出胚，并不能解決所有烏菜難誘導(dǎo)出胚的問題，所以針對其他烏菜材料胚誘導(dǎo)條件以及胚胎發(fā)生機(jī)理還需要進(jìn)一步試驗(yàn)摸索，以優(yōu)化烏菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系。