IHHNVPCR檢測(cè)方法改進(jìn)及廣西流行株基因型分析

楊慧贊　童桂香　鄭曉聰　譚紅連　黃國秋　廖永志　韋信賢　胡庭俊

摘要：【目的】建立并優(yōu)化傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）檢測(cè)及其基因分型的套式PCR，并確定IHHNV在廣西流行的基因型，為有效防控廣西對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病（IHHN）提供參考依據(jù)?！痉椒ā吭谝訮CR檢測(cè)IHHNV現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，于389F/R和309F/R兩對(duì)引物擴(kuò)增片段之外的絕對(duì)保守區(qū)域設(shè)計(jì)外引物IHHNV-WF/WR，優(yōu)化退火溫度和引物濃度后建立IHHNV檢測(cè)及基因分型的套式PCR，并通過與一步法PCR對(duì)比以驗(yàn)證其優(yōu)越性;采用建立的套式PCR對(duì)546株2010—2018年收集的IHHNV廣西流行株進(jìn)行基因型分析，確定IHHNV在廣西流行的基因型。【結(jié)果】優(yōu)化后的第一輪PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×F8 FastLong PCR MasterMix 10.0 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各0.8 μL，DNA模板2.0 μL，無核菌酶滅菌水補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：94.0 ℃預(yù)變性3 min;94.0 ℃ 10 s，59.0 ℃ 15 s，72.0 ℃ 15 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72.0 ℃延伸5 min。套式PCR檢測(cè)IHHNV的靈敏度較一步法PCR提高100倍;對(duì)100份IHHNV陽性臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果與一步法PCR的檢測(cè)結(jié)果一致，符合率達(dá)100%。從546株IHHNV廣西流行株中均能擴(kuò)增獲得309 bp的目的條帶，全部為感染型（基因1型和基因2型）?！窘Y(jié)論】在PCR檢測(cè)IHHNV現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上建立的IHHNV檢測(cè)及基因分型套式PCR，其靈敏度較一步法PCR提高100倍，尤其適用于檢測(cè)IHHNV含量低的樣品，可為疫病監(jiān)測(cè)及進(jìn)出口檢疫提供更敏感的技術(shù)手段。當(dāng)前廣西流行的IHHNV均為感染型（基因1型和基因2型）。

關(guān)鍵詞： 對(duì)蝦;傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）;套式PCR;基因型

中圖分類號(hào)： S945.46 ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）05-1127-06

Abstract：【Objective】The nested PCR detection methods were developed in order to provide technical support for detection and genotypes analysis of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus（IHHNV）， and the genotypes of IHHNV epidemic in Guangxi were investigated to offer a reference for effective prevention and control of infectious subcutaneous and hematopoietic necrosis virus（IHHN） for prawn in Guangxi. 【Method】A pair of outer primers named IHHNV-WF/WR were designed on the conserved domain which located at both ends of primers 389F/R and 309F/R used in the present standards for PCR detection of IHHNV. Then the nested PCR detection methods were developed following optimization of annealing temperature and primers concentration. The superiority of the method was evaluated by comparing with former one-step PCR. A total of 546 IHHNV strains from Guangxi during 2010-2018 were conducted genotypes analy-sis using the nested PCR. The epidemic strains of IHHNV in Guangxi were identified. 【Result】The optimized first-round PCR ampli?cation reactions 20.0 μL included 10.0 μL of 2×F8 FastLong PCR Master Mix， 0.8 μL of upstream and downstream primers（20 μmol/L），2.0 μL of the DNA template and sterile water to a ?nal volume of 20.0 μL. PCR ampli?cation was carried out as follows：3 min initial denaturation step at 94 ℃; followed by 35 cycles of 94 ℃ for 10 s， 59 ℃ for 15 s and 72 ℃ for 15 s; with a ?nal extension step of 5 min at 72 ℃. The nested PCR methods developed were 100 times more sensitive than former one-step PCR methods. The nested PCR was used to detect 100 IHHNV-positive clinical samples， the results were consistent with former one-step PCR， coincidence rate was 100%. All 546 IHHNV epidemic strains from Guangxi could amplify 309 bp target bands， and they were infectious genotypes（genotype 1 and genotype 2）. 【Conclusion】The nested PCR methods developed in this study on the current basis for detection and genotypes analysis of IHHNV are 100 times more sensitive than former one-step PCR methods， and can provide more sensitive means for detecting IHHNV in surveillance and quarantine samples which contain small amount of IHHNV. IHHNV epidemic strains in Guangxi are all infectious genotypes（genotype 1 and genotype 2） at present.

Key words： prawn; infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus（IHHNV）; nested PCR; genotypes

0 引言

【研究意義】傳染性皮下及造血組織壞死病毒（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）可感染世界各地的養(yǎng)殖及野生對(duì)蝦，感染后的危害程度因?qū)ξr種類或種群而異，感染凡納濱對(duì)蝦可引起矮小殘缺綜合癥（Runt-deformity syndrome，RDS），患病對(duì)蝦表現(xiàn)為生長緩慢、表皮畸形和產(chǎn)量下降（白麗蓉和趙志英，2012;童桂香等，2013;曾地剛等，2013）。感染IHHNV或患病后存活的對(duì)蝦終生帶毒，可通過垂直傳播和水平傳播將病毒傳給下一代及其他種群，因此生產(chǎn)上很難根除（Motte et al.，2003;韋信賢等，2011）。鑒于傳染性皮下及造血組織壞死病毒?。↖HHN）對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦危害較大，已嚴(yán)重影響對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其劃定為甲殼類其他重要疫病之一，我國動(dòng)物疫病病種名錄則將其劃為二類動(dòng)物疫病。因此，開展IHHNV檢測(cè)方法研究及其流行株基因型分析，可為IHHN監(jiān)測(cè)提供更完善的檢測(cè)技術(shù)，并在生產(chǎn)上針對(duì)不同基因型毒株采取科學(xué)的防制措施。【前人研究進(jìn)展】IHHNV是繼白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）后又一具有普遍感染性的對(duì)蝦病毒，曾在我國山東、上海、廣東和廣西等對(duì)蝦主要養(yǎng)殖地區(qū)普遍流行（童桂香等，2013）;雖然近幾年我國IHHNV陽性率整體上呈逐年下降趨勢(shì)，但除廣西的陽性率較低外（梁靜真等，2018），江蘇、遼寧和天津等地區(qū)的陽性率仍處在較高水平（鄧威等，2017;王博雅等，2017;王筱珊等，2017）。IHHNV已確定至少存在4種不同基因型（1型、2型、3A型和3B型），其中，基因1型和基因2型對(duì)對(duì)蝦有感染性，而基因3A型和基因3B型無感染性（Tang et al.，2003，2006）。國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局于2013年更新了IHHNV檢疫的進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定在入境水生動(dòng)物的IHHNV檢疫中必須進(jìn)行基因型檢測(cè)，檢出基因1型或基因2型IHHNV均不準(zhǔn)入境（SN/T 1673—2013）。目前，基于PCR的多種檢測(cè)方法已被用于IHHNV檢測(cè)及其基因分型，其中389F/R和392F/R兩對(duì)引物能檢測(cè)IHHNV的4種基因型，可用于初篩;309F/R引物只能擴(kuò)增IHHNV的基因1型和基因2型，宜用于感染型IHHNV檢測(cè);MG831F/R引物只能擴(kuò)增IHHNV的基因3A型和基因3B型，可用于非感染型IHHNV檢測(cè)（Tang et al.，2000，2007）。因此，我國IHHNV檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 25878—2010和SN/T 1673—2013）推薦，使用389F/R引物進(jìn)行IHHNV檢測(cè)及采用309F/R或MG831F/R引物區(qū)分其感染型。【本研究切入點(diǎn)】在實(shí)際檢疫工作中，采用389F/R和309F/R兩對(duì)引物進(jìn)行IHHNV檢測(cè)和基因分型時(shí)不夠敏感，尤其在應(yīng)對(duì)IHHN常規(guī)監(jiān)測(cè)及進(jìn)出口檢疫時(shí)，抽檢樣品多是采自健康無臨床癥狀的對(duì)蝦群體，其中的陽性樣品因病毒含量很低而極易造成假陰性，因此急需一種更靈敏且可靠的IHHNV檢測(cè)及其基因分型方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】建立并優(yōu)化IHHNV檢測(cè)及其基因分型的套式PCR，為IHHN監(jiān)測(cè)及基因分型提供更敏感、可靠的技術(shù)手段;同時(shí)確定IHHNV在廣西流行的基因型，為有效防控IHHN提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

546份2010—2018年收集的IHHNV陽性材料/DNA來自廣西沿海對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)，由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院水生動(dòng)物疫病監(jiān)控中心實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存。海洋動(dòng)物組織基因組DNA快速提取試劑盒、2×F8 FastLong PCR MasterMix和DL2000 DNA Marker購自北京艾德萊生物科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1. 2 引物設(shè)計(jì)與合成

從GenBank中下載不同地域IHHNV的序列（4種基因型），采用MegAlign中的ClustalW進(jìn)行同源性比對(duì)分析，在389F/R和309F/R兩對(duì)引物擴(kuò)增片段之外的絕對(duì)保守區(qū)域設(shè)計(jì)外引物IHHNV-WF/WR，各引物信息見表1，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3 病毒DNA提取

仔蝦和幼蝦取整只蝦或蝦頭（幼蝦需去眼），成蝦取鰓和肝胰腺組織。將1.0 g樣品放入2 mL滅菌勻漿試管中，經(jīng)勻漿器勻漿后取30 mg，以海洋動(dòng)物組織基因組DNA快速提取試劑盒提取總DNA，最后加50.0 μL洗脫緩沖液EB溶解DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 IHHNV套式PCR建立

參考IHHNV-WF/WR引物的退火溫度（54.2和54.7 ℃）在50.0～60.0 ℃范圍內(nèi)進(jìn)行退火溫度優(yōu)化，篩選出最適退火溫度;然后在最適退火溫度下，對(duì)不同引物終濃度（0.1～1.0 μmol/L）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定最佳引物濃度;確定IHHNV第一輪PCR的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序。以IHHNV-WF/WR為外引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增;以389F/R為內(nèi)引物，按照GB/T 25878—2010《對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）檢測(cè)PCR法》進(jìn)行IHHNV檢測(cè);同時(shí)以309F/R為內(nèi)引物，按照SN/T 1673—2013《傳染性皮下及造血組織壞死檢疫技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行IHHNV基因分型。

1. 5 套式PCR敏感性驗(yàn)證

將IHHNV陽性DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋（100～10-5），取2.0 μL各梯度DNA為模板進(jìn)行套式PCR（IHHNV-WF/WR為外引物，389F/R和309F/R分別為內(nèi)引物）和一步法PCR（389F/R引物和309F/R引物直接擴(kuò)增）檢測(cè)，對(duì)比二者的敏感性。

1. 6 套式PCR臨床檢測(cè)

采用建立的套式PCR（IHHNV-WF/WR為外引物，389F/R為內(nèi)引物）和一步法PCR（389F/R為引物）同時(shí)對(duì)100份IHHNV陽性臨床樣品（強(qiáng)陽性和弱陽性）進(jìn)行檢測(cè)，以檢驗(yàn)套式PCR的臨床實(shí)用性。

1. 7 IHHNV廣西流行株基因型分析

采用建立的套式PCR（IHHNV-WF/WR為外引物，309F/R為內(nèi)引物）對(duì)546份2010—2018年收集的IHHNV陽性DNA（389F/R引物檢測(cè)為陽性）進(jìn)行基因分型，對(duì)309F/R引物檢測(cè)為陰性的樣品用MG831F/R引物進(jìn)行檢測(cè)，以了解IHHNV廣西流行株的基因型。

2 結(jié)果與分析

2. 1 IHHNV第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

IHHNV-WF/WR引物在退火溫度為50.0～60.0 ℃的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。隨退火溫度的升高，PCR擴(kuò)增效率也逐漸提高，退火溫度低于56.4 ℃（泳道7）時(shí)，其擴(kuò)增效率較低且有非特異性條帶存在;當(dāng)退火溫度為57.4～59.7 ℃（泳道8～10）時(shí)，目的基因的擴(kuò)增效率高且不存在非特異性擴(kuò)增，故選取59.0 ℃為第一輪PCR的退火溫度。比較不同引物濃度的PCR擴(kuò)增效果，結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)引物終濃度低于0.7 μmol/L（泳道7）時(shí)，隨引物濃度的降低其擴(kuò)增效率也逐漸下降;當(dāng)引物終濃度為0.8～1.0 μmol/L（泳道8～10）時(shí)，目的基因的擴(kuò)增效率高且差異不明顯，故選取0.8 μmol/L為最佳引物終濃度。優(yōu)化后的第一輪PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×F8 FastLong PCR MasterMix 10.0 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各0.8 μL，DNA模板2.0 μL，無核酸酶滅菌水補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：94.0 ℃預(yù)變性3 min;94.0 ℃ 10 s，59.0 ℃ 15 s，72.0 ℃ 15 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72.0 ℃延伸5 min，4.0 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 2 套式PCR與一步法PCR的敏感性比較

采用套式PCR和一步法PCR同時(shí)對(duì)10倍梯度稀釋的IHHNV陽性DNA（100～10-5）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖3和圖4）顯示，套式PCR可檢測(cè)到10-4稀釋度的陽性DNA，而一步法PCR僅檢測(cè)到10-2稀釋度的陽性DNA，說明套式PCR的敏感度較一步法PCR提高100倍。

2. 3 套式PCR的臨床檢測(cè)結(jié)果

采用套式PCR和一步法PCR對(duì)100份IHHNV陽性臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果均呈陽性，符合率達(dá)100%;且一步法PCR檢測(cè)為弱陽性的樣品采用套式PCR可獲得明亮的電泳條帶（圖5），說明套式PCR較一步法PCR對(duì)目的片段的擴(kuò)增更高效。

2. 4 IHHNV廣西流行株基因型分析結(jié)果

采用建立的套式PCR（IHHNV-WF/WR為外引物、309F/R為內(nèi)引物）對(duì)546份2010—2018年收集的IHHNV陽性DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示均能擴(kuò)增獲得309 bp的目的條帶（圖6），說明546株IHHNV廣西流行株全部為感染型（基因1型和基因2型）。

3 討論

自IHHNV被發(fā)現(xiàn)以來，其檢測(cè)方法不斷發(fā)展更新，已有多種免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法可用于實(shí)際生產(chǎn)或相關(guān)研究，如ELISA、斑點(diǎn)雜交、PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和LAMP等，這些檢測(cè)方法各具優(yōu)缺點(diǎn)。國內(nèi)現(xiàn)行的IHHNV檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 25878—2010和SN/T 1673—2013）仍推薦使用PCR，但在實(shí)際檢測(cè)工作中不管是對(duì)IHHNV進(jìn)行檢測(cè)還是基因分型時(shí)，采用現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)的一步法PCR均暴露出敏感性較弱的缺陷，主要體現(xiàn)在對(duì)IHHNV含量低的樣品難以檢出或條帶很弱而無法定論，且易造成假陰性。因此，亟需對(duì)現(xiàn)行IHHNV檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的PCR進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，以滿足對(duì)低含量IHHNV檢測(cè)的需求。套式PCR是以第一輪PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，即采用兩對(duì)特異性引物對(duì)目的片段進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，其特異性和靈敏度相對(duì)于一步法PCR均得到有效提高。此外，對(duì)蝦WSSV、對(duì)蝦黃頭病毒（Yellow head disease，YHV）和鯉春病毒血癥病毒（Spring viraemia of carp virus，SVCV）等水生動(dòng)物病原的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)均已采用套式PCR（謝數(shù)濤等，2001;林婧楠等，2018），說明采用套式PCR檢測(cè)水生動(dòng)物病原具有一定優(yōu)越性。

本研究在以PCR檢測(cè)IHHNV現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)外引物IHHNV-WF/WR，并對(duì)第一輪PCR的退火溫度和引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立了適用于IHHNV檢測(cè)（IHHNV-WF/WR為外引物，389F/R為內(nèi)引物）及基因分型（IHHNV-WF/WR為外引物，309F/R為內(nèi)引物）的套式PCR，其檢測(cè)IHHNV的靈敏度較一步法PCR提高100倍;采用套式PCR（IHHNV-WF/WR為外引物，389F/R分別為內(nèi)引物）對(duì)100份IHHNV陽性臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與一步法PCR的符合率達(dá)100%，且一步法PCR檢測(cè)為弱陽性的樣品采用套式PCR可獲得明亮的電泳條帶，說明建立的套式PCR應(yīng)用于IHHNV檢測(cè)切實(shí)可靠，且較一步法PCR的擴(kuò)增更高效，即對(duì)IHHNV含量低的樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)推薦使用套式PCR。

IHHNV的基因型可分為感染型和非感染型，其中，感染型包括基因1型和基因2型，可感染凡納濱對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦等代表性對(duì)蝦;非感染型包括基因3A型和基因3B型，認(rèn)為是IHHNV的部分基因片段鑲嵌于斑節(jié)對(duì)蝦基因中（Saksmerprome et al.，2010）。本研究采用建立的套式PCR（IHHNV-WF/WR為外引物，309F/R引物為內(nèi)引物）對(duì)546份2010—2018年收集的IHHNV陽性DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示均能擴(kuò)增獲得309 bp的目的條帶，表明546株IHHNV廣西流行株全部為感染型（基因1型和基因2型）。袁顏顏等（2015）利用4對(duì)引物（389F/R、392F/R、77012F/77353R和309F/R）對(duì)2011—2012年采自國內(nèi)不同地區(qū)的對(duì)蝦樣品進(jìn)行IHHNV檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有IHHNV可分為4種PCR檢出類型，其中有48份樣品以389F/R和309F/R引物均檢出陽性（48/49），屬于感染型?，F(xiàn)有的研究資料表明，IHHNV基因1型分布于美國和東亞地區(qū)（主要是菲律賓），基因2型分布于東南亞地區(qū)，基因3A型分布于東非地區(qū)、印度和澳大利亞，基因3B型分布于印度太平洋地區(qū)包括馬達(dá)加斯加、毛里求斯和坦桑尼亞（Tang et al.，2003，2006）。綜合本研究結(jié)果可知，國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)IHHNV非感染型（基因3A型和基因3B型），是否與我國的對(duì)蝦養(yǎng)殖習(xí)慣或現(xiàn)有檢測(cè)IHHNV非感染型（基因3A型和基因3B型）的引物不理想有關(guān)，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié)論

在PCR檢測(cè)IHHNV現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上建立的IHHNV檢測(cè)及基因分型套式PCR，其靈敏度較一步法PCR提高100倍，尤其適用于檢測(cè)IHHNV含量低的樣品，可為疫病監(jiān)測(cè)及進(jìn)出口檢疫提供更敏感的技術(shù)手段。當(dāng)前廣西流行的IHHNV均為感染型（基因1型和基因2型）。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）