恩諾沙星對馬氏珠母貝腸道微生物群落的影響

洪嘉煒　陳明強　鄧正華　李有寧　馬振華　顧志峰　王雨

摘要：【目的】明確恩諾沙星對馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii）腸道微生物群落的影響，了解其變化規(guī)律，為制定馬氏珠母貝細菌感染的最佳治療方案提供參考依據?！痉椒ā坎捎?6S rDNA測序定量評價不同恩諾沙星處理濃度（0、5和10 mg/L）下馬氏珠母貝腸道微生物群落結構的變化情況，并運用生物信息學手段在門和屬水平上比較分析各處理間馬氏珠母貝腸道微生物群落結構的相似性和差異性?！窘Y果】從9個馬氏珠母貝腸道內容物樣品（PA1、PA2、PA3、PB1、PB2、PB3、PC1、PC2和PC3）中共獲得755159個有效序列，分別歸屬于9個門48個屬。在門水平上，對照處理（PA，0 mg/L）馬氏珠母貝腸道的優(yōu)勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）和厚壁菌門（Firmicutes），相對豐度分別為40.65%、33.87%和15.75%;兩個恩諾沙星處理（PB，5 mg/L;PC，10 mg/L）的優(yōu)勢菌均為變形菌門，相對豐度分別為91.61%和85.00%。在屬水平上，PA處理馬氏珠母貝腸道的優(yōu)勢菌屬為支原體屬（Mycoplasma）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、檸檬酸細菌屬（Citrobacter）和埃希氏菌—志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella），相對豐度分別為26.33%、12.22%、10.62%和9.66%;PB處理的優(yōu)勢菌屬為弧菌屬（Vibrio），相對豐度為52.10%;PC處理的優(yōu)勢菌屬為弧菌屬和發(fā)光桿菌屬（Photobacterium），相對豐度分別為40.24%和23.43%。操作分類單元（OTU）聚類分析結果表明，3個處理（PA、PB和PC）的共有OUTs為138個，占OTUs總數的54.76%;PB和PC處理的共有OUTs達176個，即這兩個處理間具有更高的相似性?！窘Y論】恩諾沙星處理濃度達5 mg/L時即對馬氏珠母貝腸道微生物群落產生影響，并使其暴露于弧菌等致病菌的威脅下，因此在馬氏珠母貝養(yǎng)殖生產中須謹慎使用恩諾沙星。

關鍵詞： 馬氏珠母貝;恩諾沙星;腸道微生物;α多樣性;相對豐度;高通量測序

中圖分類號： S968.316 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）05-1104-07

Abstract：【Objective】The aim of the study was to investigate the possible impact of enrofloxacin on Pinctada fucata martensii， find out the changing rule and provide a reference for the optimal treatment of bacterial infection in P. fucata martensii. 【Method】The microbial shifts in the intestine of P. fucata martensii in response to enrofloxacin treatments at di-fferent dosages（0， 5， and 10 mg/L） were quantitatively evaluated using 16S rDNA gene sequencing， and the similarities and differences of intestinal microbial community structure among different treatments were compared and analyzed by bioinformatics at the phylum and genus levels. 【Result】A total of 755159 effective sequences were obtained from 9 intestinal contents samples of P. fucata martensii（PA1， PA2， PA3， PB1， PB2， PB3， PC1， PC2 and PC3），belonging to ? 48 genera and 9 phyla. At the phylum level， the dominant genera of the control （PA， 0 mg/L） was Proteobacteria， Tenericutes and Firmicutes， whose relative abundances were 40.65%，33.87% and 15.75%， respectively. Nevertheless， the dominant phylum in two enrofloxacin treatment groups（PB， 5 mg/L; PC， 10 mg/L） were Proteobacteria， the relative abundance of which have reached 91.61% and 85.00% respectively. At the genus level， the dominant phylum of PA treatment were Mycoplasma， Exiguobacterium， Citrobacter， Escherichia-Shigella， the relative abundance of which were 26.33%， 12.22%，10.62% and 9.66%，respectively. Vibrio held the dominant position of PB， and its relative abundance was 52.10%. Vibrio and Photobacterium made up the most share of microbial community of PC， which collectively accounted for 40.24% and 23.43% respectively. OTU cluster analysis showed that there were 138 OTUs in three treatments（PA， PB and PC）， accounting for 54.76% of the total OTUs. 176 OUTs were shared by PB and PC， which meaned that there was a higher similarity between the two treatments. 【Conclusion】Overall， enrofloxacin alters the microbial community diversity of P. fucata martensii as the dosage reaches 5 mg/L， and exposes them to the threat of pathogenic bacteria such as Vibrio. Therefore， the use of enrofloxacin should be carefully considered in the culture of P. fucata martensii.

Key words： Pinctada fucata martensii; enrofloxacin; intestinal microorganisms; α diversity; relative abundance; high-throughput sequencing

0 引言

【研究意義】動物腸道寄宿有大量微生物，在腸道中維持著一種動態(tài)和穩(wěn)定平衡，并在宿主的消化、營養(yǎng)吸收和免疫等方面發(fā)揮重要作用（Burgents et al.，2004;Pérez et al.，2010;米海峰等，2015;Yamashiro，2017）。當腸道菌群結構遭受破壞時，微生物相互間的動態(tài)平衡被打破，而增加宿主患病的風險，致使宿主健康受到極大威脅（Ring et al.，2003;Round and Mazmanian，2009），即維持腸道菌群結構穩(wěn)定十分重要。馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii）是我國南方地區(qū)主要養(yǎng)殖的珍珠貝類之一，具有重要的經濟價值（王大鵬等，2011;楊創(chuàng)業(yè)等，2015;李俊輝等，2017），但作為無脊椎動物其缺乏特殊的免疫系統(tǒng)以抵抗各種病原體的侵染和減緩環(huán)境壓力的影響（吳寧等，2017），因此，明確馬氏珠母貝的腸道微生物結構及其功能顯得尤為重要?！厩叭搜芯窟M展】近年來，由于養(yǎng)殖海區(qū)水體環(huán)境的不斷惡化，各種病害頻繁暴發(fā)導致珍珠貝類養(yǎng)殖生產遭受巨大損失，其中由細菌引起的疾病已受到廣泛關注。恩諾沙星（Enrofloxacin）作為一種高效的廣譜抗菌劑，對許多細菌性疾病具有顯著抑制作用，現已廣泛應用于動物細菌性疾病的防治（馬驛等，2007;郭荔等，2017），如水產常見的出血性敗血癥、爛鰓病和腸炎病等（劉開永和汪開毓，2004;劉禮輝等，2015;陸專靈等，2016），但其產生的副作用亦不容忽視。恩諾沙星與其他抗生素在水產養(yǎng)殖上所產生的副作用一樣，主要包括產生耐藥菌株、藥物殘留、抑制免疫系統(tǒng)及破壞微生態(tài)平衡（胡夢紅，2006）。其中，微生態(tài)平衡的破壞不僅對周圍水體環(huán)境有害，還會對水產動物腸道的微生態(tài)環(huán)境產生影響，尤其當不合理施用抗生素時，將嚴重破壞腸道微生態(tài)平衡而危害宿主健康（陸武等，2009）。目前，關于抗生素對動物腸道微生物群落影響的研究主要集中于人類和陸生哺乳動物（老鼠、豬和雞等），一致認為抗生素的施用可抑制腸道菌群正常定植，引起菌群紊亂，使腸道微生物的多樣性降低，導致細菌產生耐藥性而影響宿主的生理代謝及免疫等相關功能（李同洲等，1999;王俐等，2003;王愛麗等，2009;劉穎等，2017;紀明宇等，2017）?！颈狙芯壳腥朦c】至今，關于水產動物（特別是貝類）暴露于抗生素（尤其是恩諾沙星）后其腸道微生物群落變化的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】采用第三代測序技術（單分子測序技術）分析恩諾沙星對馬氏珠母貝腸道微生物多樣性的影響，以期了解其變化規(guī)律，進而為制定針對馬氏珠母貝細菌感染的最佳治療方案提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗動物

供試馬氏珠母貝（殼長59.55±0.64 mm，殼高60.40±0.27 mm，殼寬22.18±0.36 mm，體重33.63±0.71 g）購自海南省陵水新村市場，運至中國水產科學研究院南海水產研究所熱帶水產研究開發(fā)中心后，參照Chen等（2016）的方法暫養(yǎng)2周，選擇大小相近、健康無傷的個體進行試驗。

1. 2 試驗設計及樣品采集

試驗共設3個處理，分別為0、5和10 mg/L恩諾沙星。在3個體積為400 L的玻璃鋼桶中分別調制出3個恩諾沙星濃度的海水，水體中恩諾沙星濃度根據Fang等（2012）的方法進行確定，然后將30只健康的馬氏珠母貝分組吊養(yǎng)在不同玻璃鋼桶中（每桶10只）。浸泡周期24 h，試驗期間不投喂餌料。浸泡結束后，從每處理中隨機取3只馬氏珠母貝，分別記作0 mg/L（標號PA1、PA2和PA3）、5 mg/L（標號PB1、PB2和PB3）和10 mg/L（標號PC1、PC2和PC3）。對馬氏珠母貝進行解剖并取出其內臟團，以無菌生理鹽水沖洗干凈后用滅菌剪刀和鑷子取其腸道，經無菌水沖洗干凈，以75%乙醇浸泡3 min，再用無菌水反復沖洗3次，然后將腸道內容物放入1.5 mL無菌離心管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 DNA提取及擴增

參照陳明強等（2019）的方法提取馬氏珠母貝腸道微生物總DNA，采用Qubit? 3.0熒光光度計和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的含量和質量。以Illumina MiSeq平臺設計的特異引物擴增馬氏珠母貝腸道微生物16S rDNA序列V3～V4可變區(qū)，其中，上游引物為：5'-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVG AAT-3'，下游引物為：5'-GGACTACNVGGGTWTCT AATCC-3'。PCR反應體系25.0 μL：2.5 μL TransStart緩沖液，2.0 μL dNTPs，上游、下游引物各1.0 μL，20 ng模板DNA，以去離子水補足至25.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃ 5 s，57 ℃ 90 s，72 ℃ 10 s，進行24個循環(huán);72 ℃延伸5 min。每個樣品3個重復，擴增產物混合后以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，并按Quick Gel提取試劑盒（QIAGEN公司）說明對PCR產物進行分離與純化，再構建基因文庫。

1. 4 高通量測序及生物信息學分析

采用Qubit? 3.0分光光度計檢測基因文庫，并定量至10 nM，然后上樣至Illumina MiSeq設備進行高通量測序（Illumina，San Diego，CA，USA），采用PE 250/300測序策略進行測序。測序后，對所得原始序列進行質控過濾，采用Flash對通過質控的序列進行連接（Mago? and Salzberg，2011），并用Qiime對連接上的序列進行過濾，過濾原則：舍棄序列長度>200 bp、含模糊或錯配堿基且平均質量分數≥20的序列，再用Uchime Algorithm去除嵌合體后得到有效數據（Caporaso et al.，2010）。以相似性為97%為標準，運用Uparse對所得的有效序列進行操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）聚類，所得結果輸入Silva 16S rRNA數據庫，利用RDP Classifier貝葉斯算法進行物種注釋（Wang et al.，2007），得到不同組別馬氏珠母貝腸道微生物組成情況。根據OUT聚類分析結果，繪制樣品的稀釋曲線及含系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類熱圖，直觀顯示各處理間的相似性和差異性。同時，分析各處理間的共有或特有OUT，繪制韋恩圖。最后，采用Qiime計算馬氏珠母貝腸道微生物群落的α多樣性指數，包括ACE、Chao1、Shannon、Simpson和覆蓋率（Goods_coverage）等指數。

1. 5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0對試驗數據進行單因素方差分析（One-way ANOVA），分析不同恩諾沙星處理組間的差異顯著性。

2 結果與分析

2. 1 腸道微生物α多樣性

9個馬氏珠母貝腸道內容物樣品經高通量測序后，分別得到109453（PA1）、129088（PA2）、141645（PA3）、51689（PB1）、50522（PB2）、110106（PB3）、129984（PC1）、53587（PC2）和66401（PC3）條原始序列，經連接、過濾及去除嵌合體后，分別得到97606、115752、131113、43011、45565、98874、116546、45906和60786條有效序列。有效序列在相似性為97%的水平上進行OTU聚類，共得到252個OTUs，3個處理分別聚類得到196、198和198個OTUs。從9個樣品的稀釋曲線（圖1）可看出，隨測序深度的增加，OTU數量隨之增加，稀釋曲線趨于平緩，OTU數量達峰值，測序結果可靠。同時，3個處理組的Goods_coverage均為100.0%，說明各樣品的全部微生物均被檢測到。

由表1可看出，PB處理馬氏珠母貝腸道微生物的ACE指數（162.69）、Chao1指數（166.48）、Shannon指數（4.94）和Simpson指數（0.93）最高，但與PA和PC處理的差異不顯著（P>0.05），表明不同恩諾沙星濃度處理下馬氏珠母貝腸道微生物的豐度和多樣性無明顯差異。

2. 2 腸道微生物群落結構

OTU代表序列經RDP Classifier分類工具物種注釋后，共檢測到9個菌門48個菌屬。在門水平上，腸道微生物的相對豐度如圖2-A所示。數據經標準化處理后，9個被檢測到的菌門分別為：變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、藍藻門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、軟壁菌門（Tenericutes）、螺旋菌門（Spirochaetae）和異常球菌—棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）。其中，PA處理馬氏珠母貝腸道的優(yōu)勢菌門為變形菌門、軟壁菌門和厚壁菌門，相對豐度分別為40.65%、33.87%和15.75%;PB和PC處理馬氏珠母貝腸道的優(yōu)勢菌門相同，均為變形菌門，相對豐度分別達91.61%和85.00%。

在屬水平上，馬氏珠母貝腸道微生物的相對豐度如圖2-B所示。其中，PA處理馬氏珠母貝腸道的優(yōu)勢菌屬為支原體屬（Mycoplasma）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）和埃希氏菌—志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella），相對豐度分別為26.33%、12.22%、10.62%和9.66%;PB處理馬氏珠母貝腸道的優(yōu)勢菌屬為弧菌屬（Vibrio），相對豐度為52.10%;PC處理馬氏珠母貝腸道的優(yōu)勢菌屬為弧菌屬和發(fā)光桿菌屬（Photobacterium），相對豐度分別為40.24%和23.43%。

2. 3 各處理間微生物群落的相似性

根據OTU聚類分析結果，分析不同處理馬氏珠母貝腸道微生物的共有和特有OTU，結果（圖3）顯示，3個處理的共有OTUs為138個，占OTUs總數的54.76%。PA處理馬氏珠母貝腸道微生物特有的OTUs數最多，為32個，而PB和PC處理分別為8和10個。此外，PB和PC處理馬氏珠母貝腸道微生物的共有OTUs達176個，表明這兩個處理間具有更高的相似性。

按照各處理馬氏珠母貝腸道微生物在屬水平下前30個相對豐度最高的物種分布繪制其聚類熱圖，通過熱圖顏色差異可直觀顯示各物種的相似性和差異性。結果（圖4）顯示，低濃度恩諾沙星處理（PB）和高濃度恩諾沙星處理（PC）聚為一支，二者與對照處理（PA）的距離相對較遠，即聚類熱圖顯示的結果與依據韋恩圖得出的結果一致。

3 討論

腸道微生態(tài)系統(tǒng)對動物機體來說十分重要，其與宿主共同形成一個生理上的統(tǒng)一體，兩者互相依存、互相影響，在正常情況下保持著相對穩(wěn)定的平衡狀態(tài)（陶可等，2008）。當腸道菌群的微生態(tài)平衡受外界因素（環(huán)境條件、病原體和藥物等）破壞時，其生理功能（營養(yǎng)代謝和免疫力等）將受到影響，從而影響宿主的生長發(fā)育及其健康水平（尹軍霞和林德榮，2004;米海峰等，2015）?？股匾驯蛔C實可對腸道微生態(tài)產生一定負面影響（丁麗等，2009），因此，利用16S rDNA測序技術研究恩諾沙星對馬氏珠母貝腸道微生物群落的影響，對制定馬氏珠母貝細菌感染的最佳治療方案具有重要意義。本研究結果顯示，從9個樣品（PA1、PA2、PA3、PB1、PB2、PB3、PC1、PC2和PC3）中共獲得755159個有效序列，歸屬于9個門，分別為變形菌門、厚壁菌門、梭桿菌門、放線菌門、藍藻門、擬桿菌門、軟壁菌門、螺旋菌門和異常球菌—棲熱菌門。目前，關于水產動物腸道菌群結構的研究結果基本相似。在南移池塘養(yǎng)殖的仿刺身腸道中以厚壁菌門和變形菌門為主（楊求華等，2016），凡納濱對蝦腸道的優(yōu)勢菌門是變形菌門（何遠法等，2017），牙鲆初孵仔魚腸道的優(yōu)勢菌為厚壁菌門和變形菌門（劉增新等，2017），攝食全豆粕蛋白飼料的牛蛙腸道中則以變形菌門、梭桿菌門和厚壁菌門占主導地位（王健等，2018）。本研究結果也表明，門水平下的馬氏珠母貝腸道微生物群落以變形菌門、軟壁菌門和厚壁菌門為主，相對豐度分別為40.65%、33.87%和15.75%。

本研究通過對比發(fā)現，馬氏珠母貝經恩諾沙星處理后，不管是低濃度處理（PB，5 mg/L）還是高濃度處理（PC，10 mg/L）其腸道優(yōu)勢菌相對于對照處理（PA，0 mg/L）均發(fā)生明顯變化，其中，變形菌門相對豐度分別驟升到91.61%和85.00%，軟壁菌門相對豐度則大幅降至1.36%和2.41%。軟壁菌門是一類缺乏細胞壁的獨特細菌，對人類有較高的致病性（Razin et al.，1998），對水產動物是否具有致病作用尚未明確，但根據軟壁菌門對恩諾沙星具有較強的敏感性，可選用恩諾沙星作為抑菌劑以降低軟壁菌門可能存在的致病風險。此外，Shin等（2015）研究認為變形菌門在腸道中占比的增加是腸道微生態(tài)失調的重要標志，同時是一種潛在的疾病診斷標準。本研究結果表明，在恩諾沙星曝露下馬氏珠母貝腸道中變形菌門的相對豐度大幅上升，經恩諾沙星處理后均超過85.00%，暗示馬氏珠母貝腸道微生態(tài)已失去平衡。抗生素的過度使用破壞了腸道微生物群落結構，削弱對病原菌定殖的抵抗力，變形菌門乘機大量繁殖。變形菌門中很多種類為條件致病菌，如大腸桿菌和霍亂弧菌等（林養(yǎng)等，2009），用藥后變形菌門的增加可能會導致其顯現出致病性，因此，恩諾沙星導致以變形菌門大量繁殖為特征的腸道微生態(tài)紊亂應受到高度重視，臨床上須謹慎選擇合理的治療方案，以減少恩諾沙星引起的不良影響。

本研究還發(fā)現，在屬水平上，變形菌門中的弧菌屬在施藥后明顯增加，恩諾沙星低濃度處理（PB，5 mg/L）和高濃度處理（PC，10 mg/L）的弧菌屬相對豐度分別達52.10%和40.24%?；【鷱V泛流行于全國范圍內的海域環(huán)境中，作為一種條件致病菌可引起海水養(yǎng)殖魚類、貝類及甲殼類等暴發(fā)細菌性疾病，最終導致養(yǎng)殖生物大量死亡（吳后波和潘金培，2001;楊少麗等，2005）。弧菌屬在抗生素處理下不降反升的現象，與許燕等（2018）用氟苯尼考干預斑石鯛的結果存在差異，可能是弧菌對于兩種抗生素的敏感性不一致所引起。本研究中，弧菌屬大量繁殖表明馬氏珠母貝在恩諾沙星治療中會受到致病弧菌的威脅，因此在馬氏珠母貝養(yǎng)殖生產中須謹慎考慮恩諾沙星的使用。

4 結論

恩諾沙星處理濃度達5 mg/L時即對馬氏珠母貝腸道微生物群落產生影響，并使其暴露于弧菌等致病菌的威脅下，因此在馬氏珠母貝養(yǎng)殖生產中須謹慎使用恩諾沙星。

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（責任編輯 蘭宗寶）