青蘿卜游離小孢子培養(yǎng)體系優(yōu)化

張勝雪 范偉強 王超楠 張紅 黃志銀 李梅 劉曉暉 尹婧 張斌

摘? ? 要：以12份不同基因型青蘿卜品種為供試材料，采用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)，研究基因型、培養(yǎng)基類型、激素濃度配比、4 ℃冷處理時間及32.5 ℃熱激處理時間對青蘿卜小孢子胚誘導(dǎo)的影響，為青蘿卜高頻胚誘導(dǎo)提供參考依據(jù)，從而完善青蘿卜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系。結(jié)果顯示，在相同培養(yǎng)條件下，只有SX1、SX8與SX11三份材料獲得了胚狀體，其余材料未獲得胚狀體，且不同供試材料間小孢子胚誘導(dǎo)率差異顯著，表明基因型是決定青蘿卜小孢子胚誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵因素之一;利用1/2NLN-13型培養(yǎng)基配套指定激素配比（0.2 mg·L-1? 6-BA+1 mg·L-1? NAA）培養(yǎng)時，材料SX1、SX8與SX11小孢子出胚率最高，基本確定了青蘿卜小孢子培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基類型及最佳激素濃度組合;此外，4 ℃冷處理1 d和32.5 ℃熱激處理2 d，材料SX1與SX11小孢子出胚率最高，確定了小孢子胚誘導(dǎo)最佳冷處理和熱激處理條件。

關(guān)鍵詞：青蘿卜;小孢子培養(yǎng);胚狀體;優(yōu)化

中圖分類號：S631.1 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2022）02-034-05

Optimization of isolated microspore culture system in green radish

ZHANG Shengxue1， FAN Weiqiang2， WANG Chaonan3， ZHANG Hong2， HUANG Zhiyin2， LI Mei3， LIU Xiaohui3， YIN Jing1， ZHANG Bin3

（1. College of Life Sciences， Tianjin Normal University， Tianjin 300387， China; 2. State Key Laboratory of Vegetable Germplasm Innovation/Tianjin Key Laboratory of Vegetable Genetics and Breeding Enterprises/Tianjin Kerun Vegetable Research Institute， Tianjin 300381， China; 3. Vegetable Research Institute， Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300381， China）

Abstract： Twelve genotypes of Green Radish were tested for isolating microspore culture technology. The effects of genotype， medium type， growth regulator， 4 ℃ cold treatment and 32.5 ℃ heat shock treatment on the embryo induction from microspores were studied to improve isolated microspore culture technology system for green radish. The results showed that under the same culture conditions， only three materials SX1， SX8 and SX11 produced embryos， and the embryos induction rate from microspores was different among materials tested. Genotype is one of the key factors determining the success of embryo induction from green radish microspores; When 1/2 NLN-13 medium supplemented with 0.2 mg·L-1 6-BA+1 mg·L-1 NAA genotypes SX1， SX8 and SX11 produced highest number of embryos. In addition， of 4 ℃ cold treatment for 1 d and 32.5 ℃ heat shock treatment for 2 d SX1 and SX11 had the highest embryo rate from microspores. Our research generated an optimized protocol of generating embryos from isolated microspores of green radish.

Key words： Green radish; Microspore culture; Embryoid; Optimization

蘿卜（Raphanus sativus L.）為十字花科蘿卜屬二年或一生作物，在我國蔬菜作物中占據(jù)重要地位。2017年，我國蘿卜播種面積達到130萬hm2，占蔬菜總播種面積的5.6%，總產(chǎn)量達4.501×1010 kg，位居十字花科蔬菜種植面積的第二位[1]。青蘿卜為蘿卜中的綠皮蘿卜類型，其皮薄肉細、色澤翠綠、口感脆嫩，深受大眾喜愛。

蘿卜的雜種優(yōu)勢非常明顯，市面蘿卜品種多以雜交種為主[2]。利用常規(guī)育種手段選育純合、穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)親本需要進行5～7年的多代自交，費時費力，而且材料的多代自交也可能導(dǎo)致優(yōu)良性狀的衰退。游離小孢子培養(yǎng)是快速獲得純合材料的有效手段之一[3-4]，利用小孢子培養(yǎng)可以快速獲得單倍體，加倍后就可以獲得純合且遺傳穩(wěn)定的雙單倍體（DH）植株，從而縮短育種年限，提高育種效率[5]。自從1982年Lichter[6]首次通過甘藍型油菜（Brassica napus）培育出胚狀體并建立再生植株體系以來，游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于白菜、甘藍、菜心、油菜等多種十字花科蔬菜作物單倍體育種研究中[7-9]。在十字花科作物中，蘿卜是最難成功培養(yǎng)出小孢子的作物之一[10]。Takahata等[11]對僅獲得的58個蘿卜胚狀體進行再生植株培養(yǎng)，僅成活6株;張麗[12]對20份基因型不同的蘿卜品種進行游離小孢子培養(yǎng)，僅1份品種形成胚狀體。近年來，多位學(xué)者在蘿卜小孢子培養(yǎng)方面做了大量的工作[13-14]，但出胚率和植株再生率仍舊很低。

目前，還未有針對青蘿卜小孢子培養(yǎng)的系統(tǒng)研究報道，筆者以12份基因型不同的青蘿卜品種為供試材料，對青蘿卜小孢子培養(yǎng)過程中的培養(yǎng)基類型、激素濃度配比、4 ℃冷處理時間及32.5 ℃熱激時間進行研究，為青蘿卜高頻胚誘導(dǎo)提供參考依據(jù)，以期進一步完善青蘿卜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

筆者在本研究中選取12份市場主流并具備優(yōu)良性狀的青蘿卜品種（材料）作為試材，其具體品種編號、名稱與來源如下（表1）。供試材料于2020年12月上旬播種于天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司蔬菜研究所武清試驗基地，常規(guī)田間管理，2021年3月底至6月初取花蕾進行游離小孢子培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1? ? 游離小孢子培養(yǎng)? ? 小孢子培養(yǎng)方法參考張麗等[13]的方法，進行改良。摘取無裂蕾的花序，4 ℃冷處理0、1、2、3 d;75%酒精處理35 s、10%次氯酸鈉處理12 min、無菌水處理4 min 3次;B5培養(yǎng)基（含13%蔗糖）;32.5℃熱激處理0、1、2、3 d;轉(zhuǎn)綠的胚狀體接種至B5固體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)（16 h光/8 h暗、溫度25 ℃、光照度2000 lx）。

1.2.2? ? 單因素試驗設(shè)計? ? 以基因型、激素類型及濃度配比、4℃冷處理時間和32.5℃熱激處理時間5個因素，利用單因素控制變量法設(shè)計單因素試驗，試驗設(shè)計情況如表2。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

利用Excel 2019軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用SPSS 22.0軟件進行單因素ANOVA方差分析，利用鄧肯氏新復(fù)極差法進行差異性顯著分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型對青蘿卜小孢子胚誘導(dǎo)的影響

選取的青蘿卜品種代表12種不同基因型，以1/2 NLN-13培養(yǎng)基培養(yǎng)，供試材料出胚情況如表3。

由表3可以看出，用相同的培養(yǎng)條件對12份不同基因型的青蘿卜小孢子進行培養(yǎng)，其中只有SX1、SX8與SX11三份材料獲得了胚狀體，SX2、SX3、SX4、SX5、SX6、SX7、SX9、SX10與SX12未獲得胚狀體，其中SX11獲得胚狀體最多，出胚率最高，可達0.167胚·蕾-1;而SX8獲得胚狀體最少，出胚率僅為0.042胚·蕾-1。因此可見，不同基因型的青蘿卜材料間小孢子胚誘導(dǎo)率差異較大，且在完全相同的培養(yǎng)條件下，不同材料的小孢子胚誘導(dǎo)發(fā)生能力受基因型影響較大。

2.2 培養(yǎng)基類型及激素濃度配比對青蘿卜小孢子胚誘導(dǎo)的影響

由圖1可以看出，激素濃度配比相同時，以1/2 NLN-13培養(yǎng)基培養(yǎng)時，SX1、SX8與SX11三份材料小孢子的出胚率較高，說明1/2 NLN-13培養(yǎng)基為供試青蘿卜小孢子培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基類型。由表4～5可以看出，與對照組1相比，加入適量的6-BA和NAA有利于青蘿卜小孢子胚誘導(dǎo)的發(fā)生，且6-BA和NAA的濃度不同對小孢子胚誘導(dǎo)發(fā)生能力的影響不同。其中配比7條件下SX1、SX8與SX11三份材料小孢子的出胚率最高，在1/2 NLN-13培養(yǎng)基中分別為0.181、0.083、0.222胚·蕾-1;在NLN-13培養(yǎng)基中分別為0.056、0.014、0.069胚·蕾-1。因此說明，0.2 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 NAA為供試青蘿卜小孢子培養(yǎng)的最適激素質(zhì)量濃度組合。

2.3 冷處理時間對青蘿卜小孢子胚誘導(dǎo)的影響

由圖2可以看出，4 ℃冷處理后材料SX1與SX11小孢子出胚率均有明顯的提高，且冷處理1 d時，兩份青蘿卜材料的小孢子出胚率最高，分別為0.306胚.蕾-1和0.347胚.蕾-1;隨著冷處理時間的增加，材料SX1與SX11小孢子出胚率逐漸下降，尤其冷處理3 d時，小孢子出胚率已經(jīng)接近0 d。因此，4 ℃冷處理對供試青蘿卜小孢子胚誘導(dǎo)的發(fā)生有顯著影響，且不同冷處理間小孢子出胚率差異顯著，其中最佳冷處理時間為1 d。

2.4 熱激處理時間對青蘿卜小孢子胚誘導(dǎo)的影響

由圖3可以看出，32.5 ℃熱激處理后，材料SX1與SX11小孢子出胚率均有明顯的提高，且熱激處理2 d時，兩份青蘿卜材料的小孢子出胚率最高，分別為0.278胚·蕾-1和0.347胚·蕾-1;熱激處理3 d時，小孢子出胚率明顯下降，說明熱激時間延長不利于小孢子出胚。因此可見，32.5 ℃熱激處理對供試青蘿卜小孢子胚誘導(dǎo)的發(fā)生有顯著影響，且不同熱激處理間小孢子出胚率差異顯著，其中最佳熱激處理時間為2 d。

2.5 青蘿卜小孢子胚狀體培養(yǎng)及植株再生的過程

小孢子經(jīng)過離體培養(yǎng)發(fā)育成胚狀體（圖4-A）一般需要15～26 d。胚狀體接種到分化培養(yǎng)基（B5固體培養(yǎng)基+2%蔗糖+0.8%瓊脂+0.2 mg·L-1 6-BA）上，置于光照培養(yǎng)室（16 h光/8 h暗、溫度25 ℃、光照度2000 lx）培養(yǎng)。其中子葉胚（圖4-B）1周后逐漸轉(zhuǎn)綠（圖4-C），經(jīng)過3～5周繼代培養(yǎng)后分化成苗（圖4-D）;球形胚接種后不會轉(zhuǎn)綠，逐漸發(fā)生褐化死亡（圖4-E）。獲得的苗接種至生根培養(yǎng)基（MS固體培養(yǎng)基+2 %蔗糖+0.1 g·L-1活性炭+0.8 %瓊脂+0.2 mg·L-1 NAA）培養(yǎng)1～2周后逐漸生根（圖4-F）。

3 討論與結(jié)論

蘿卜成功獲得小孢子培養(yǎng)非常困難，基因型是制約其成胚的關(guān)鍵。筆者在本試驗中以相同的培養(yǎng)條件對12份基因型不同的青蘿卜小孢子進行培養(yǎng)，只有3份成功誘導(dǎo)出胚，且不同基因型的青蘿卜材料間小孢子胚誘導(dǎo)率差異較大，表明基因型是決定青蘿卜品種小孢子胚誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵因素之一，這一結(jié)果與王春麗等[15]研究結(jié)果相一致，在白菜[16]、菜心[17]等十字花科作物中也有此結(jié)論。張鳳蘭等[18]研究表明，在甘藍型油菜小孢子培養(yǎng)中，高胚發(fā)生能力受顯性核基因控制，與胞質(zhì)無關(guān)。因此可以利用雜交手段，將胚發(fā)生能力高的品種與胚發(fā)生能力低的品種進行雜交，擴大后代基因型范圍，提高胚發(fā)生能力低的品種的胚誘導(dǎo)率[19]。

NLN和1/2NLN培養(yǎng)基是十字花科作物小孢子培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基類型。陳文輝等[20]研究了培養(yǎng)基類型對蘿卜小孢子出胚率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅1/2 NLN培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)蘿卜小孢子產(chǎn)生胚狀體;趙艷玲[21]研究發(fā)現(xiàn)NLN與1/2 NLN培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)蘿卜小孢子產(chǎn)生胚狀體。本試驗中，在培養(yǎng)基內(nèi)物質(zhì)含量完全相同下，1/2 NLN培養(yǎng)基培養(yǎng)時，SX1、SX8與SX11小孢子出胚率較高，說明1/2 NLN培養(yǎng)基更有利于提高蘿卜胚狀體的誘導(dǎo)率，這個結(jié)果與王超楠等[22]研究結(jié)果相一致。

目前，激素對不同作物小孢子胚誘導(dǎo)的影響尚未得到一致結(jié)果。王康[23]認為培養(yǎng)基內(nèi)加入0.05 mg·L-1 6-BA對蘿卜小孢子胚誘導(dǎo)有促進作用;李丹[2]對蘿卜小孢子胚誘導(dǎo)體系進行優(yōu)化，培養(yǎng)基內(nèi)最佳激素組合是0.1 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 NAA;施柳等[24]認為培養(yǎng)基內(nèi)加入0.3 mg·L-1 6-BA有利于白菜小孢子胚誘導(dǎo)的發(fā)生。本試驗中，在培養(yǎng)基內(nèi)添加0.2 mg·L-1 6-BA和1.0 mg·L-1 NAA可以顯著提高SX1、SX8與SX11小孢子的出胚率。

冷處理和熱激處理可以改變小孢子的分裂方式和發(fā)育途徑，使第2次有絲分裂進行對稱分裂，從而促進小孢子由配子體途徑向孢子體途徑發(fā)展，利于產(chǎn)生胚狀體[25]。付傳翠等[26]認為4 ℃冷處理3 d，蘿卜小孢子出胚率最高，延長冷處理時間，出胚率逐漸下降;唐兵等[27]認為4 ℃低溫預(yù)處理l d、33 ℃高溫熱激2 d有利于白菜小孢子胚的形成。本試驗結(jié)果表明，4 ℃冷處理1 d和32.5 ℃熱激處理2 d可以提高青蘿卜小孢子胚誘導(dǎo)的發(fā)生能力，但其出胚率與材料基因型及處理時間密切相關(guān)，這與李丹[2]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，筆者通過對青蘿卜游離小孢子培養(yǎng)體系的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)除了基因型是決定青蘿卜小孢子培養(yǎng)的關(guān)鍵因素外，培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)基成分以及溫度脅迫處理等同樣是影響青蘿卜小孢子培養(yǎng)的重要因素，本研究的結(jié)果可以進一步為青蘿卜小孢子培養(yǎng)提供可靠的參考依據(jù)和試驗基礎(chǔ)。

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