金屬蛋白酶組織抑制因子在稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中的表達及其意義

王開秀 程大梅 黃曉梅 邵帥 丁濤

摘要：目的：研究基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）、血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）在稽留流產(chǎn)患者絨毛組織的表達，探討孕期高凝狀態(tài)在稽留流產(chǎn)中的作用。方法：以2018年3月～2019年10月在荊門市第二人民醫(yī)院診斷為稽留流產(chǎn)的45名患者為實驗組，以同期45例正常妊娠要求行人工流終止妊娠的早孕健康婦女作為對照組，檢測兩者外周血纖維蛋白原降解產(chǎn)物（FDP）、D二聚體含量，絨毛組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）、VEGF蛋白表達水平。結果：實驗組FDP及D二聚體均較對照組顯著升高（P < 0.001）。實驗組絨毛組織MMP-9蛋白表達量高于對照組，TIMP-1、VEGF蛋白表達量低于對照組（P < 0.05）。結論：稽留流產(chǎn)患者處于高凝狀態(tài)，可導致胚胎停育，其機制與患者絨毛膜組織MMP-9升高，TIMP-1下降，VEGF下降有關。

關鍵詞：稽留流產(chǎn);絨毛組織;基質(zhì)金屬蛋白酶;血管內(nèi)皮細胞生長因子

中圖分類號：R714.21?文獻標志碼：A?文章編號：1008-4657（2019）05-0070-04

0?引言

稽留流產(chǎn)（Missed Abortion，MA）是指胚胎死亡或胎兒死亡而仍稽留于宮腔而未排出者，發(fā)生率約1%～5%，嚴重危害婦女生育健康，可導遠期的不孕癥、宮腔粘連等，最嚴重可導致永久性無法生育等，給患者身體和精神帶來極大的痛苦[1-2]，對于社會穩(wěn)定也是不利的。早期妊娠流產(chǎn)涉及的原因多，但主要與染色體異常、生殖道解剖異常、內(nèi)分泌失調(diào)、感染性疾病、免疫等因素有關[3]。通過臨床病例分析，目前認為高凝狀態(tài)可導致子宮-胎盤循環(huán)的局部異常，其最終可引起胚胎流產(chǎn)或胚胎發(fā)育不良，但其具體的機制不明[3-4]。因此，本研究通過臨床病例標本研究，觀察孕期高凝狀態(tài)下早期妊娠稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中MMP-9、TIMP-1、VEGF蛋白表達情況，探討其在稽留流產(chǎn)中的作用。

1?對象與方法

1.1?研究對象

選取2018年3月～2019年10月在荊門市第二人民醫(yī)院就診并確診的稽留流產(chǎn)患者45例作為實驗組，同期45例正常妊娠要求行人工流產(chǎn)終止妊娠的早孕健康婦女作為對照組。實驗組患者經(jīng)陰道彩超動態(tài)監(jiān)測確診為稽留流產(chǎn)，所有納入對象均滿足入選標準：（1）無高血壓病史或家族史，無惡性腫瘤病史及家族史，無免疫性疾病史;（2）已排除急性炎癥期，如急性陰道炎、急性盆腔炎。實驗組與對照組患者的一般情況，經(jīng)差異比較，無統(tǒng)計學意義。

1.2?方法

1.2.1?絨毛組織的獲取

常規(guī)行流產(chǎn)手術時獲取患者絨毛組織，利用醫(yī)用生理鹽水洗掉粘液及血液，剔除蛻膜組織，醫(yī)用濾紙吸去水份，- 80℃冰箱保存絨毛組織。

1.2.2?凝血功能檢測

兩組婦女均于手術當天，空腹抽取外周靜脈血5 ml，送至荊門市第二人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗科常規(guī)檢測FDP以及D二聚體含量。

1.2.3?絨毛組織MMP-9、TIMP-1、VEGF蛋白表達檢測

提取組織蛋白并測其濃度。經(jīng)Bradford法測總蛋白濃度。取提取的組織蛋白50 μg進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入對應一抗，4 ℃孵育過夜。洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，孵育一個半小時，充分洗滌后，加入ECL超敏發(fā)光顯色液顯色。反應約3～5 min后，在暗室內(nèi)用X光片曝光。將最后通過顯液與定液出來的X光片利用凝膠成像系統(tǒng)軟件分析條帶積分光密度值（OD）及面積（Area）。計算相對光密度比值：相對光密度比值 =（目的蛋白光密度×面積）/（β-actin的光密度×面積）。

1.3?統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標準差（ ± s）的形式進行描述，采用SPSS16.0分析。數(shù)據(jù)采用t檢驗或Mann-Whitney U。P < 0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2?結果

2.1?患者基本資料比較

實驗組與對照組患者的一般資料比較如表1所示。

由表1可知，稽留流產(chǎn)患者年齡（27.13 ± 4.33）歲，孕齡（56.51 ± 8.08）天，正常早孕年齡（27.00 ± 4.32）歲，孕齡（53.64 ± 8.86）天，實驗組和對照組之間在懷孕年齡以及停經(jīng)天數(shù)上比較，兩組數(shù)據(jù)無顯著統(tǒng)計學差異（P > 0.05）。

2.2?外周血FDP及D二聚體含量比較

實驗組與對照組患者外周血FDP及D二聚體含量如表2所示。

由表2可知，實驗組FDP及D二聚體含量較對照組高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。

2.3?MMP-9、TIMP-1及VEGF蛋白表達水平比較

Western Blot檢測MMP-9、TIMP-1及VEGF蛋白表達量，結果如表3所示。

由表3可知，與對照組相比，稽留流產(chǎn)患者的絨毛組織中的MMP-9、VEGF蛋白表達量升高，TIMP-1蛋白表達量下降，差異均具有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。

3?結論

稽留流產(chǎn)患者外周血FDP（4.96 ± 0.77l）μg/ml、D二聚體（0.72 ± 0.24）μg/ml分別較對照FDP（3.40 ± 1.07）μg/ml、D二聚體（0.37 ± 0.12）μg/ml含量高，說明稽留流產(chǎn)患者血液相對于正常妊娠，血液是呈高凝狀態(tài)。

稽留流產(chǎn)患者絨毛組織MMP-9蛋白表達量（0.55 ± 0.12）高于對照組（0.38 ± 0.11）高;TIMP-1蛋白表達量（0.24 ± 0.12）、VEGF蛋白表達量（0.30 ± 0.08）分別較對照組TIMP-1蛋白表達量（0.30 ± 0.10）、VEGF蛋白表達量（0.43 ± 0.15）低，表明稽留流產(chǎn)患者與正常妊娠患者相比，其絨毛組織血管形成能力較低。

4?討論

妊娠期體內(nèi)雌孕激素水平升高，對肝臟的代謝、合成、分泌功能均造成影響，使孕婦機體纖溶活性逐漸減低呈高凝狀態(tài)，其本身有一定的積極作用，但嚴重的高凝狀態(tài)，易導致流產(chǎn)。相對于自然流產(chǎn)而言，稽留流產(chǎn)患者機體凝血和纖維蛋白溶解系統(tǒng)呈失衡狀態(tài)，患者更加具有血栓形成傾向。本研究的結果表明，稽留流產(chǎn)患者FDP及D二聚體水平較對照組升高，患者處于明顯高凝狀態(tài)，不僅影響胚胎著床和發(fā)育，同時患者凝血功能障礙，可影響胚胎與子宮壁間的組織機化，使妊娠組織與子宮壁間的粘連更加緊密，這樣將加大流產(chǎn)手術的難度，嚴重的可導致子宮穿孔、大出血等嚴重并發(fā)癥。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）是重要水解蛋白酶，參與細胞外基質(zhì)（ECM）的代謝[5-6]，在血管形成起著重要的作用，在人類胎盤形成過程發(fā)揮重要作用。滋養(yǎng)層入侵需要精確調(diào)節(jié)分泌特定的蛋白水解酶，其能降低子宮內(nèi)膜基底膜和細胞外基質(zhì)。胚胎侵入子宮能力和子宮內(nèi)膜蛻膜化能力是胚胎著床的關鍵，而這一過程伴隨著多種細胞外基質(zhì)降解和重構。胚胎植入母體子宮的過程中，MMP能夠參與血管生成，其為著床后的胚胎提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)。MMP通過對蛻膜ECM的降解，從而防止胚胎與蛻膜間的分離而導致流產(chǎn)[5-7]。

金屬蛋白酶類抑制劑（TIMP）是主要的內(nèi)源性MMP抑制因子，在絨毛外滋養(yǎng)細胞入侵內(nèi)膜基質(zhì)中起關鍵作用。MMP和TIMP兩者互相呈動態(tài)平衡狀態(tài)，在胚胎與胎盤間有至關重要，尤其是MMP-9和TIMP-1[8]。滋養(yǎng)細胞過度侵襲，過度的蛻膜ECM降解，可導致胚胎植入的失敗，進一步導致胎盤形成或發(fā)育不良，最終可以導致早期妊娠流產(chǎn)的發(fā)生[9]。

檢測數(shù)據(jù)表明，實驗組和對照組的流產(chǎn)絨毛組織中均有MMP-9和TIMP-1表達，且實驗組絨毛組織中MMP-9蛋白表達水平高于對照組，而對照組絨毛組織中TIMP-1蛋白表達量明顯高于實驗組。因此，間接提示稽留流產(chǎn)的發(fā)生可能與絨毛組織MMP-9及TIMP-1蛋白異常有關。

VEGF在血管生成方面具有強大的功能，不僅可以調(diào)節(jié)血管通透性，促進新生血管的形成，為新生微血管網(wǎng)的生長提供必要的基質(zhì)[10-11]，還可作用于血管內(nèi)皮細胞，促進血管內(nèi)皮細胞及滋養(yǎng)細胞的分裂和遷移，刺激微血管的生成，引起細胞外基質(zhì)改變。VEGF在胚胎的著床、植入、內(nèi)膜發(fā)育過程中起著關鍵性的作用。VEGF表達下降使得血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移的調(diào)控及促進血管形成功能異常，導致胚胎的供血出現(xiàn)異常，從而影響胚胎的正常發(fā)育;而且入侵能力的下降，導致滋養(yǎng)細胞的浸潤減少，胚胎著床不穩(wěn)定，導致流產(chǎn)的發(fā)生[12-13]。本研究實驗組VEGF蛋白表達水平低于對照組。表明高凝狀態(tài)下VEGF表達，其可能是流產(chǎn)的機制之一。

通過臨床標本的研究，妊娠早期處于高凝狀態(tài)的患者，絨毛膜組織中MMP-9蛋白高表達，以及TIMP-1蛋白和VEGF蛋白低表達，可能會導致胚胎與母體間的血管網(wǎng)形成不良、滋養(yǎng)細胞分化及浸潤異常，最終導致發(fā)生流產(chǎn)和胚胎停止發(fā)育，其具體機制目前不明確，需進一步研究。

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[責任編輯：許立群]