山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC特征圖譜研究

郝磊 孫福仁 高晗 李雪利 田方 李振江 李軍山

摘 要：為了進(jìn)一步研究山楂配方顆粒的質(zhì)量控制方法，以山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑為研究對象，采用高效液相色譜儀與GL science C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）色譜柱，以乙腈-0.4%磷酸為流動相，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長為254 nm，應(yīng)用特征圖譜技術(shù)以及中藥指紋圖譜相似度評價軟件提取山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜中的特征成分。研究表明，15批山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑中共確定了7個特征峰，分離度較好，且峰面積較大，易于識別，使用參照物標(biāo)定了3個特征峰成分，各共有峰相對保留時間的RSD值小于2.5%。所建立的山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC特征圖譜方法可靠、穩(wěn)定，為山楂配方顆粒質(zhì)量控制提供了一定的參考。

關(guān)鍵詞：中藥化學(xué);山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑;特征圖譜;綠原酸;金絲桃苷;異槲皮苷

中圖分類號：R284.1?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi： 10.7535/hbgykj.2019yx06009

文章編號：1008-1534（2019）06-0422-07

Abstract：In order to study the quality control method of Crataegi fructus formula granules， the standard decoction of Crata-egi fructus is taken as the research object，the GL science C18（4.6 mm×250 mm， 5.0 μm） chromatograms column are used. Acetonitrile-0.4% phosphoric acid is mobile phase， the column temperature is 30 ℃， the flow rate is 1.0 mL/min， and the detection wavelength is 254 nm. The characteristic components in the characteristic of the standard decoction of?Crataegi fructus are extracted by using characteristic atlas technology and similarity evaluation software of traditional Chinese medicine fingerprint. The results show that there are 7 characteristic peaks in 15 batches of Crataegi fructus standard decoction. The separation degree is good， and the peak area is large and easy to identify. Three characteristic peaks are calibrated with reference substance. RSD value of relative retention time of each common peak is less than 2.5%. The established characteristic chromatographic method of Crataegi fructus standard decoction is reliable and stable， which provides a reference for the quality control of Crataegi fructus formula granules.

Keywords：chemistry of Chinese material medica; the standard dection of Crataegi fructurs; feature chromatograms; chlorogenic acid; hypericin; isoquercetin

山楂為薔薇科植物山里紅Cralaegus pinnatifida.Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果[1]。山楂中含有多種黃酮類成分，如牡荊素鼠李糖苷、槲皮素、金絲桃苷、槲皮素-3-O-β-D-6-乙?；拎咸烟擒铡㈤纹に?3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷及槲皮素-3-O-β-D-6-乙?；拎⒙逄擒?還含有枸櫞酸、牡荊素、熊果酸、綠原酸等有機(jī)酸類[2-3]。山楂為常用中藥，臨床應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，山楂具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血壓等功效，山楂中的總黃酮對動物心肌缺血具有治療作用，所含的有機(jī)酸具有促進(jìn)消化等功效[4-5]。

已有研究表明，使用HPLC建立指紋圖譜方法可用于對不同植物來源山楂藥材的鑒別[6-7]。彭燦等[8]采用乙腈-冰乙酸緩沖溶液，對山楂中的有機(jī)酸類成分進(jìn)行了指紋圖譜分析，建立的指紋圖譜方法符合相關(guān)要求;鄒錄惠等[9]利用固相萃取SPE技術(shù)，結(jié)合HPLC指紋圖譜方法，對山楂藥材中的總黃酮類成分進(jìn)行分析，確定了10個共有峰成分，并指認(rèn)了4個共有峰;李曉亮等[10]對不同產(chǎn)地的山楂葉進(jìn)行了指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)山西晉城山楂葉的色譜峰較多。目前，未見山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜的相關(guān)文獻(xiàn)。本文以由不同產(chǎn)地山楂飲片制備而成的標(biāo)準(zhǔn)湯劑為研究對象，通過建立特征圖譜方法，對不同產(chǎn)地的山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行分析，以期為山楂配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

1?主要儀器與試劑

1.1?儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津株式會社提供;GL science C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）;CP225D型電子分析天平，賽多利斯公司提供;KH3200E型超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司提供;電加熱套，北京科偉永興儀器有限公司提供;真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申科生物技術(shù)有限公司提供;LGJ-12壓蓋型真空冷凍干燥機(jī)，河南兄弟儀器設(shè)備有限公司提供;圓底燒瓶，量筒，燒杯。

1.2?試劑

綠原酸對照品，批號為110737-201516，購自中國藥品生物制品檢定所;金絲桃苷對照品，批號為111521-201005，購自中國藥品生物制品檢定所;異槲皮苷對照品，批號為111809-201105，購自中國藥品生物制品檢定所;磷酸，分析純，批號為20170309，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供;甲醇，色譜純，批號為20170313，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供;乙腈，色譜純，批號為20171213，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供;水為自制純化水。

1.3?15批山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

1.3.1?山楂飲片來源

15批山楂飲片采購于山西、河北、山東產(chǎn)地的市場，經(jīng)企業(yè)質(zhì)控中心檢驗，15批飲片均符合《中華人民共和國藥典》2015版“山楂”項下的相關(guān)要求[1]。詳見表1。

1.3.2?山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法

分別取15批山楂飲片約100.0 g，除去可見異物（石頭、塵土等），轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加入飲片量8倍的水，浸泡30 min。大火加熱至沸騰，改小火煎煮30 min，過0.074 mm濾網(wǎng)，將濾液快速冷卻。在藥渣中加入飲片量6倍的水，大火加熱至沸騰，改小火煎煮20 min，過0.074 mm濾網(wǎng)，將濾液快速冷卻。合并2次煎液。將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于60 ℃濃縮，濃縮至生藥量與濃縮液體積比約為1∶3時為宜。將濃縮液使用冷凍干燥機(jī)干燥。

2?方法與結(jié)果

2.1?色譜條件

島津LC-20AT高效液相色譜儀，色譜柱為 GL science C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為254 nm，進(jìn)樣量為10 μL，流動相為乙腈（A）-0.4%磷酸（B）。梯度洗脫程序見表2。

2.2?對照品溶液的制備

取綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷對照品，精密稱定4，4.5，2 mg，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中。加入50%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的甲醇制成每1 mL含80 μg的綠原酸溶液，加甲醇制成每1 mL含90 μg的金絲桃苷溶液，加甲醇制成每1 mL含40 μg的異槲皮苷溶液，作為對照品溶液。

2.3?供試品溶液的制備

取標(biāo)準(zhǔn)湯劑0.40 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中。精密加入70%甲醇25 mL，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）30 min，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，即得。

2.4?方法學(xué)考察

2.4.1?精密度考察

取山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品（S9）0.40 g，按供試品溶液制備項下所述方法制備供試品溶液，依照“2.1”項所述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測定5次。將所得色譜圖導(dǎo)入2008版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》，并以共有色譜峰5為參照，計算各特征峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值。特征峰相對保留時間的RSD值為0.00%～0.27%，相對峰面積的RSD值為0.00%～2.35%，均小于5.00%。說明該儀器的精密度符合分析方法的要求，詳見表3和表4。

2.4.2?重復(fù)性考察

取山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑（S9）0.40 g，按供試品溶液制備所述方法，平行制備5個樣品溶液，依照“2.1”項所述色譜條件進(jìn)行測定。將所得色譜圖導(dǎo)入2008版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》，以共有色譜峰5為參照，計算各特征峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值。特征峰相對保留時間的RSD值為0.00%～0.86%，相對峰面積的RSD值為0.00%～3.05%，均小于5.00%，說明該方法的重復(fù)性符合分析方法要求，詳見表5和表6。

2.4.3?穩(wěn)定性考察

取山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑（S9）0.40 g，按供試品溶液制備所述方法，制備樣品溶液，依照“2.1”項所述色譜條件，對同一樣品溶液分別于0，2，4，6，8 h測定。將所得色譜圖導(dǎo)入2008版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》，并以色譜峰5為參照，計算各特征峰相對保留時間與相對峰面積的RSD值。特征峰相對保留時間的RSD值為0.00%～0.89%，相對峰面積的RSD值為0.00%～2.95%，均小于5.00%，說明樣品在8 h以內(nèi)測定，穩(wěn)定性符合分析方法的要求。詳見表7和表8。

2.5?15批山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜的測定

對15批山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑按照“2.1”項所述色譜條件進(jìn)行樣品處理及測定，結(jié)果見圖1。通過對15批山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜進(jìn)行分析，確定了7個特征峰。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]，并與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間及紫外最大吸收比對，指認(rèn)了7個特征峰中的3個成分：5號峰為綠原酸，6號峰為金絲桃苷，7號峰為異槲皮苷。詳見圖2。

2.6?數(shù)據(jù)分析

采用《中藥色譜指紋圖譜和相似度評價系統(tǒng)》，選取時間窗寬度為0.1 min，以中位數(shù)生成對照色譜圖，經(jīng)過多點校正后自動匹配，生成山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC特征圖譜對照圖譜。15批山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑7個特征峰中5號特征峰（綠原酸）峰面積穩(wěn)定，分離度良好，故選其作為參比峰。各共有峰的相對保留時間（RRT）和相對峰面積（RPA）分別見表9和表10。

各共有峰相對保留時間的RSD值小于2.5%，說明各產(chǎn)地山楂的化學(xué)成分差異較小;相對峰面積的RSD值較大，范圍為0.00%～44.38%，說明不同產(chǎn)地山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑所含化學(xué)成分的相對含量相差較大。

15批山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑中共有7個特征峰，分離度較好，且峰面積較大，易于識別。因此，以上述7個共有峰作為特征峰，以5號共有峰作為S峰，相對保留時間值±8%為控制范圍，規(guī)定值如下：0.27（峰1）、0.50（峰2）、0.55（峰3）、0.59（峰4）、1.00（峰S）、1.45（峰6）、1.47（峰7）。

3?討?論

3.1?色譜條件的考察

通過實驗分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.4%磷酸3個流動相體系[11]。結(jié)果表明，采用乙腈-0.4%磷酸時，特征圖譜中的主要色譜峰分離較好，基線波動小，因此，確定采用乙腈-0.4%磷酸作為流動相。

3.2?提取溶劑的比較

通過對50%，70%甲醇水與100%甲醇進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)以70%甲醇提取的樣品中色譜峰的個數(shù)較多，峰形較好，故選擇70%甲醇作為提取溶劑。對比超聲與回流提取方式，兩種處理方式色譜峰的數(shù)量、峰面積差異較小，而超聲提取法簡便、快捷，因此選用超聲提取方法。

3.3?山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑成分考察

考察了山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑中所含的有機(jī)酸、黃酮兩類成分。有機(jī)酸以綠原酸為代表，黃酮類成分以金絲桃苷、異槲皮苷為代表。由于蘆丁成分在山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的含量較低，響應(yīng)值較弱，故未檢測到該成分。而在相關(guān)文獻(xiàn)中，可從山楂飲片中檢測出蘆丁成分[9]，說明山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑與山楂飲片在成分種類方面有一定的差異。河北產(chǎn)地的山楂中，S5樣品中的3號特征峰相對峰面積低于15批樣品的平均相對峰面積值，而相同產(chǎn)地S4和S6樣品3號特征峰的相對峰面積高于15批樣品的平均相對峰面積值，說明產(chǎn)地因素對山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的特征峰相對峰面積有較大的影響。但7個特征峰為15批山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品共有，說明產(chǎn)地因素對特征峰種類的影響較小。故只應(yīng)以7個特征峰的相對保留時間為規(guī)定值，根據(jù)相對峰面積無法制定出合理的規(guī)定值范圍。

4?結(jié)?語

1）2015版《中華人民共和國藥典》中規(guī)定，山楂飲片含量測定時以枸櫞酸為指標(biāo)，采用的是酸堿滴定法。通過查閱文獻(xiàn)可知，枸櫞酸極性較大，在反相色譜中的保留值較弱[12]，故將山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜初始梯度設(shè)置為φ（乙腈）∶φ（0.4%磷酸）=5∶95。但該成分在特征圖譜中仍無保留行為，存在于特征圖譜前5 min的色譜峰群中。而山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑中綠原酸有較好的保留行為，且含量適中，故選取綠原酸峰作為特征圖譜的參比峰，同時，標(biāo)定山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的黃酮類成分[13]。

2）山楂標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以不同產(chǎn)地的山楂飲片為原料，經(jīng)提取、濃縮、干燥制備而成。通過HPLC特征圖譜分析[14-15]可知，3個主產(chǎn)地的15批山楂樣品的峰個數(shù)差異較小，7個特征峰均出現(xiàn)在15批樣品中，但峰面積差異較大，相對峰面積的RSD值為0.00%～44.38%。

3）本研究的特征圖譜中只對3個特征峰進(jìn)行了指認(rèn)，其余特征峰還需進(jìn)一步應(yīng)用質(zhì)譜等儀器進(jìn)行分析，這也是今后需要加以改進(jìn)的方面。

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