重組納豆激酶的研究進(jìn)展

趙福永 嚴(yán)寒 任廣旭 高夢(mèng)祥 劉虹 王靖

摘?要：納豆激酶是一種堿性絲氨酸蛋白酶，具有較強(qiáng)的直接溶解血纖維蛋白的特性，與當(dāng)前的溶栓藥物相比具有諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為新型溶栓藥物開發(fā)的焦點(diǎn)。本文首先簡(jiǎn)要介紹了納豆激酶基因及納豆激酶分子的理化特性和生物學(xué)功能，對(duì)當(dāng)前國(guó)內(nèi)外采用基因工程技術(shù)（密碼子優(yōu)化、點(diǎn)突變、高效表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建等）重組表達(dá)納豆激酶的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，分析了其中存在的主要問題和不足以及商業(yè)化生產(chǎn)重組納豆激酶的可能性，對(duì)納豆激酶在醫(yī)藥、食品等行業(yè)中的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：納豆激酶;溶栓作用;重組表達(dá)策略;應(yīng)用前景

納豆激酶（Nattokinase，NK）最早由日本學(xué)者須見洋行在大豆發(fā)酵產(chǎn)品納豆中發(fā)現(xiàn)并命名[1]。NK主要是由納豆發(fā)酵菌納豆桿菌代謝產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶，具有較強(qiáng)的纖維蛋白溶解特性，能溶解血栓。相較于目前臨床上常用的溶栓藥物尿激酶、鏈激酶和組織型纖溶酶原激活劑，NK制劑具有安全、高效、可口服、易吸收、價(jià)格低和纖溶活力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已成為新型溶栓藥物開發(fā)的焦點(diǎn)。此外，NK還被發(fā)現(xiàn)具有降膽固醇、降血脂、降血壓、抗菌和抗氧化等多方面的保健作用[2-5]。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在NK高產(chǎn)菌種選育、發(fā)酵工藝優(yōu)化、高效分離與純化技術(shù)、酶活測(cè)定、溶栓機(jī)理及產(chǎn)品開發(fā)與應(yīng)用等方面進(jìn)行了廣泛的研究，取得了一批顯著的成果。傳統(tǒng)NK的生產(chǎn)方法主要是從發(fā)酵納豆中進(jìn)行提取，由于野生型納豆桿菌的胞外分泌型蛋白過多，導(dǎo)致NK分離純化困難，且產(chǎn)量和酶活偏低，不利于NK的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展和市場(chǎng)需求。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，NK重組表達(dá)技術(shù)也日趨成熟和完善，本文對(duì)NK的重組表達(dá)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1?NK基因及其編碼蛋白特性

1992年，Nadamura 等[1]首次從納豆桿菌中克隆獲得了NK基因（aprN）全長(zhǎng)序列。其編碼多肽鏈長(zhǎng)381氨基酸（AA），其中N端29 AA為信號(hào)肽，其后的77 AA為具有分子伴侶作用的前導(dǎo)肽，成熟肽長(zhǎng)275 AA，是一種單鏈多肽酶。該酶是一種堿性絲氨酸蛋白酶，其N末端為丙氨酸，相對(duì)分子質(zhì)量約為27.7 kDa。截止2018年11月，作者從NCBI網(wǎng)站共搜索到12條NK基因全長(zhǎng)序列。對(duì)附表中NK基因核苷酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，序列KF734090、FJ376817和FJ407060均為1 089 bp，缺失信號(hào)肽區(qū)的57 bp，其余均為1 046 bp，序列間核苷酸一致性在97%～100%之間。對(duì)成熟肽序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，所有成熟肽長(zhǎng)度均為275 AA，且位于活性中心的Asp32、His64和Ser221及結(jié)合中心的Ser125、Leu126和Gly127相同，說明不同菌株來源的NK功能極為保守。NK的等電點(diǎn)為8.6，最適pH值為8.0，最適溫度為45℃，多次凍融對(duì)酶活影響不大，且分子內(nèi)無二硫鍵[6]。但是，酶活易受金屬離子影響，Hg2+和Cu2+對(duì)酶活具有明顯抑制作用，而Ca2+、Mn2+、Fe2+則對(duì)酶活有明顯的激活作用。此外，乙二胺四乙酸（EDTA）對(duì)NK有輕微的抑制作用，而蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）對(duì)NK有明顯的抑制作用，可使酶活完全喪失[6]（附表）。

2?NK的溶栓功能、機(jī)理及保健功效

NK氨基酸序列與枯草桿菌蛋白酶E、DFE和QK-2等具有很高的同源性和結(jié)構(gòu)相似性，同屬絲氨酸蛋白酶家族，但只有NK對(duì)血纖維蛋白具有水解作用，且表現(xiàn)出極高的底物特異性[1，7]。因此，NK是一種良好的血栓溶解藥物，其溶栓作用主要通過4條途徑實(shí)現(xiàn)：（1）直接水解纖維蛋白。NK不能直接水解血漿纖維蛋白原，但可以水解交聯(lián)后的纖維蛋白，將其降解為可溶性產(chǎn)物，從而溶解血栓。（2）刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生t-PA。t-PA在體內(nèi)纖溶系統(tǒng)中起著重要作用，它可激活體內(nèi)的組織纖溶酶原形成纖溶酶，進(jìn)而溶解纖維蛋白。（3）激活尿激酶原轉(zhuǎn)化為尿激酶。NK可將體內(nèi)的尿激酶原激活轉(zhuǎn)化為尿激酶，從而使內(nèi)源性纖溶酶的量和活性間接增強(qiáng)。（4）降解和失活t-PA和尿激酶的抑制劑 pAI-1[8]。此外，NK還具有預(yù)防血栓形成、抑制血小板凝集、預(yù)防高血壓、改善血流與微循環(huán)等保健功效[2-5，9]。

3?重組NK的高效表達(dá)策略、技術(shù)及主要問題

基因工程領(lǐng)域常采用密碼子優(yōu)化、選擇強(qiáng)啟動(dòng)子或特異啟動(dòng)子、增刪表達(dá)調(diào)控元件（增強(qiáng)子、信號(hào)肽、內(nèi)含子、Kozak 序列等）、分泌表達(dá)、融合表達(dá)等策略與技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)目的基因的高水平轉(zhuǎn)錄和高效翻譯，并結(jié)合適宜的表達(dá)系統(tǒng)及發(fā)酵工藝最大量提高目的蛋白的表達(dá)水平。NK基因的成功克隆，為利用基因工程技術(shù)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)重組NK奠定了基礎(chǔ)。

3.1?密碼子與表達(dá)調(diào)控元件優(yōu)化提高表達(dá)量與酶活

韓嵐等[10-12]和劉靚蕾等[13]通過密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)并人工合成了含和不含內(nèi)含子的2種NK基因。對(duì)番茄果實(shí)、煙草和甜瓜瞬時(shí)轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，在番茄果實(shí)特異啟動(dòng)子E8調(diào)控下的NK表達(dá)量明顯高于組成型啟動(dòng)子35S調(diào)控下的表達(dá)量;同時(shí)，有內(nèi)含子的NK的表達(dá)量明顯高于無內(nèi)含子的表達(dá)量，且纖溶酶活性也較高。劉朔[14]對(duì)NK成熟肽編碼區(qū)進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，用分泌表達(dá)策略在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)量相較優(yōu)化前提高了3.5倍，活性達(dá)512 IU/mL。葛春蕾等[15]通過串聯(lián)3個(gè)PHpaII啟動(dòng)子調(diào)控NK基因在枯草芽孢桿菌WB800中進(jìn)行高效分泌表達(dá)，NK產(chǎn)量最高達(dá) 213.30 FU/mL，相比單個(gè)啟動(dòng)子 PHpaII提高了92.51%。何孝天[16]比較3種不同信號(hào)肽（wapA、yncM、pre）對(duì)NK分泌表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，wapA介導(dǎo)的NK在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)量明顯高于原信號(hào)肽pre，且酶活也較高，達(dá)1 052 FU/mg。Liang等[17]利用協(xié)助胞外表達(dá)的啟動(dòng)子pel B，實(shí)現(xiàn)了NK在大腸桿菌的胞外可溶性表達(dá)，但表達(dá)量偏低。Chiang等[18]將NK與油脂蛋白融合表達(dá)，通過表達(dá)蛋白在含有甘油三酯和磷脂等成分的人工油體中復(fù)性，獲得了有活性的蛋白。Wu等[19]通過優(yōu)化啟動(dòng)子，在枯草芽孢桿菌中使NK的表達(dá)量增加了136%，酶活達(dá)1 999U/mL。

3.2?點(diǎn)突變提高熱穩(wěn)定性、酶活和pH值耐受性

對(duì)NK熱穩(wěn)定性和pH值耐受性的改善，將有助于在工藝生產(chǎn)環(huán)節(jié)中保證酶活，并延長(zhǎng)其在機(jī)體內(nèi)的作用時(shí)間。趙菡等[20]采用點(diǎn)突變技術(shù)獲得了酶活提高的NK突變體Q59E及熱穩(wěn)定性提高的突變體N218D，且雙突變體Q59E/N218D的熱穩(wěn)定性進(jìn)一步提高，使半衰期延長(zhǎng)了約2.75倍，而酶活與野生型酶相當(dāng)。P14L和N76D突變體則可使65℃下的半衰期由20min分別延長(zhǎng)至30min和50min[21]。D36G突變體可使熱穩(wěn)定性提高20%，比活力提高16.6%[22]。L31I突變體的催化效率是野生型酶的2倍，雙突變M222A/I31L和T220S/I31L的酶活明顯高于單突變，且M222A/I31L的氧化穩(wěn)定性也高于野生型酶。Wu等[23]證實(shí)，若NK第100位氨基酸為體積大的或帶正電荷的側(cè)鏈，則其底物結(jié)合和催化活性會(huì)大幅度下降，而若第101位為此類氨基酸則其酶活明顯提高;第126位的任意突變均會(huì)破壞活性中心的結(jié)構(gòu)，從而使酶活大幅度下降。Zheng等[24]對(duì)NK分子三維結(jié)構(gòu)模型分析發(fā)現(xiàn)，Ser33、Asp60、Ser62和Thr220之間形成的氫鍵對(duì)穩(wěn)定水解反應(yīng)的過渡態(tài)至關(guān)重要，任一位點(diǎn)的突變導(dǎo)致氫鍵的移除均會(huì)增加過度態(tài)的自由能，從而降低NK對(duì)底物的催化效率。周波[25]對(duì)Ser182和Leu203位點(diǎn)的點(diǎn)突變性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，NK重組酶的最適pH值的變化與氨基酸替換呈現(xiàn)出相關(guān)性：酸性氨基酸有利于酶在酸性范圍內(nèi)穩(wěn)定，而堿性氨基酸有利于酶在堿性范圍內(nèi)穩(wěn)定。此外，DNA shuffling人工分子進(jìn)化技術(shù)對(duì)于目的基因分子改性具有積極作用。Cai等[26]建立了納豆芽孢桿菌AS 1.107、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）CICC 20164和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）CICC 10092三個(gè)菌株的NK同源基因的突變子庫(kù)，篩選到催化效率比野生型提高2.3倍的NK突變體。

3.3?NK重組表達(dá)系統(tǒng)

NK已在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸乳球菌、畢赤酵母和昆蟲細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和畢赤酵母報(bào)道較多。在大腸桿菌（BL21）表達(dá)系統(tǒng)中，NK酶原基因可表達(dá)出有活性的蛋白產(chǎn)物，表達(dá)量要明顯高于枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)，但活性相對(duì)偏低[27]，且缺乏信號(hào)肽和前導(dǎo)肽序列的NK基因表達(dá)產(chǎn)物易形成包涵體，常規(guī)方法很難使其體外復(fù)性[28-29]。張淑梅等[30]在大腸桿菌（DH5α）中表達(dá)的NK蛋白占菌體蛋白的21.5%，其1 mg干粉的溶栓活性相當(dāng)于2 000 U尿激酶。童煜[31]獲得的重組NK蛋白占菌體蛋白的36%，但1 mg干粉的溶栓活性僅相當(dāng)于600 U尿激酶。郭文秀[32]對(duì)大腸桿菌HB101和BL21表達(dá)NK比較研究發(fā)現(xiàn)，前者表達(dá)量約占菌體蛋白的25%，后者略高，為31%。枯草芽孢桿菌是NK的天然表達(dá)菌種，可實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)。Chen等[33]通過發(fā)酵條件優(yōu)化，用搖床培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)表達(dá)NK，使酶活分別達(dá)到了71 500 CU/mL和77 400 CU/mL。Cui等[34]采取信號(hào)肽、啟動(dòng)子、順式調(diào)控元件逐步優(yōu)化策略，發(fā)現(xiàn)去除了5UTR端CodY結(jié)合序列的啟動(dòng)子P08和信號(hào)肽SPwapA組合，以胞外酶缺失型枯草芽孢桿菌菌株WB800作為表達(dá)宿主菌，可使NK的分泌表達(dá)水平達(dá)292 FU/mL。Wei等[35]應(yīng)用基因敲除技術(shù)構(gòu)建了地衣芽孢桿菌胞外酶缺失型基因工程表達(dá)菌株BL10，并結(jié)合信號(hào)肽優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了NK的高水平穩(wěn)定表達(dá)。相較于優(yōu)化前，發(fā)酵活性最高可達(dá)33.83 FU/mL，提高了229%。若對(duì)BL10的全合成培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，NK的純度和比活力還可進(jìn)一步提高[36]。敬俊鋒等[37]在畢赤酵母X33中表達(dá)825 bp的NK成熟肽基因，每毫升培養(yǎng)物活性相當(dāng)于195 U尿激酶。閆少華[38]對(duì)NK在畢赤酵母中重組表達(dá)的大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了探索。Liang等[39]采用分泌表達(dá)策略在食品級(jí)菌種乳酸乳球菌中成功表達(dá)了NK，每毫升培養(yǎng)物活性相當(dāng)于41.7 U尿激酶。研究結(jié)果為重組NK的直接口服應(yīng)用研究提供了新思路。此外，NK在昆蟲細(xì)胞[40]和病毒[41]中也實(shí)現(xiàn)了有活性表達(dá)。

不同的表達(dá)系統(tǒng)因自身的特性各有優(yōu)缺點(diǎn)。從上述NK的表達(dá)結(jié)果來看，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量相對(duì)較高，且易于純化，但表達(dá)產(chǎn)物無活性或活性極低，主要以包涵體形式存在，需要通過后續(xù)復(fù)性才能獲得有功能的酶;枯草芽孢桿菌作為NK產(chǎn)生的天然菌種，其表達(dá)活性最好，但是胞外分泌型雜蛋白多，純化難度大;畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的純度高，但存在活性低，表達(dá)量相對(duì)較小的缺點(diǎn)。

要實(shí)現(xiàn)NK的高效重組表達(dá)，筆者認(rèn)為可以從以下幾個(gè)方面著手，逐步實(shí)現(xiàn)。首先，在對(duì)NK蛋白分子結(jié)構(gòu)和特性認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，采用點(diǎn)突變或DNA shuffling技術(shù)等獲得能在表達(dá)宿主菌或細(xì)胞中高效轉(zhuǎn)錄和翻譯的突變基因;其次，將NK的前導(dǎo)肽和成熟肽基因同時(shí)表達(dá)。NK的前導(dǎo)肽是一種分子內(nèi)分子伴侶，在NK的正確折疊過程中發(fā)揮著重要作用。大腸桿菌中和畢赤酵母中表達(dá)無前導(dǎo)肽的蛋白的活性要遠(yuǎn)低于有前導(dǎo)肽的[42-43]。第三，優(yōu)化表達(dá)調(diào)控元件，構(gòu)建高效表達(dá)載體。如選用強(qiáng)啟動(dòng)子或特異啟動(dòng)子、選擇合適的信號(hào)肽、添加內(nèi)含子或增強(qiáng)子、加裝Kozak序列、去除CodY等負(fù)調(diào)控元件等。第四，選用蛋白酶缺失型宿主細(xì)胞，采用融合表達(dá)或分泌表達(dá)策略。宿主細(xì)胞蛋白酶缺失可以極大地降低對(duì)目的蛋白的水解風(fēng)險(xiǎn)，從而提高目的蛋白的表達(dá)量。如胞外蛋白酶缺失型枯草芽孢桿菌基因工程菌株WB400、WB600、WB800以及地衣芽孢桿菌基因工程表達(dá)菌株BL10等。高產(chǎn)、高活性重組表達(dá)產(chǎn)品的獲得，既涉及上游的基因優(yōu)化、表達(dá)載體構(gòu)建以及表達(dá)系統(tǒng)的選擇，也涉及下游的發(fā)酵條件優(yōu)化、分離純化技術(shù)等，應(yīng)同時(shí)加以綜合考慮。

4?NK重組表達(dá)產(chǎn)品的應(yīng)用與開發(fā)前景

隨著對(duì)NK研究的不斷深入，NK產(chǎn)業(yè)展現(xiàn)出了巨大的商業(yè)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。首先，NK作為輔助溶栓的保健品藥物，現(xiàn)已在發(fā)達(dá)國(guó)家廣泛使用。日本是NK產(chǎn)品的最大生產(chǎn)國(guó)家，市售產(chǎn)品名類眾多，如日研納豆激酶膠囊、ASTALIVE納豆激酶等。日本生物科學(xué)研究所已推出了第四代納豆激酶制品（3 000FU）。美國(guó)市面上也有多種NK產(chǎn)品銷售，我國(guó)納豆激酶制劑-恩開膠囊已進(jìn)入生產(chǎn)工藝中試階段。其次，NK作為一種堿性絲氨酸蛋白酶，可作為脫毛劑用于皮革行業(yè)。與傳統(tǒng)皮革脫毛方法相比，酶法脫毛不僅可以保護(hù)和軟化皮革，改良產(chǎn)品的柔軟度、可著色度、潔白度等，還環(huán)保高效。第三，NK可作為添加劑用于洗滌行業(yè)。有研究表明，NK是一種有機(jī)溶劑耐受性蛋白酶，對(duì)洗滌劑有極強(qiáng)的耐受性[44-45]。因此，可通過NK將一些大分子蛋白類污漬酶解成易溶于水的小分子片段，達(dá)到快速去污的目的。第四，可作為飼料添加劑，用以改善飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和利用率。NK作為一種蛋白酶，能將高蛋白含量的豆粕、玉米等飼料中大分子蛋白質(zhì)降解為小分子多肽，從而提高其利用率，降低養(yǎng)殖成本，實(shí)現(xiàn)增收。第五，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，實(shí)現(xiàn)NK的生物反應(yīng)器表達(dá)，開發(fā)功能性食品。如在番茄、甜瓜、生菜等生食類瓜果和蔬菜中或食品級(jí)乳酸菌中高表達(dá)NK，人類可直接吸收和利用NK，無需分離與純化等步驟，既降低了生產(chǎn)成本，還可達(dá)到藥食兩用的目的。

5?結(jié)論

NK具有廣闊的開發(fā)前景。采用基因工程技術(shù)制備重組NK，不僅具有分離純化方便、產(chǎn)量高、活性高等優(yōu)勢(shì)，還具有安全可靠、生產(chǎn)成本低廉等經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。相信不久的將來，NK將在醫(yī)藥、食品、養(yǎng)殖、化工等行業(yè)和領(lǐng)域形成新的產(chǎn)業(yè)。

參考文獻(xiàn)

[1]Nakamura，T.，Yamagata，Y.，Ichishima，E.Nucleotide sequence of the subtilisin NAT gene，aprN，of Bacillus subtilis（natto）[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，1992，56（11）：1869-1871.

[2]Weng Y.Q.，Yao J.，Sparks S.，et al.Nattokinase：an oral antithrombotic agent for the prevention of cardiovascular disease[J].International Journal of Molecular Sciences，2017，18（3）：523.

[3]Chen，H.J.，McGowan，E.M.，Ren，N.N.，et al.?Nattokinase：a promising alternative in prevention and treatment of cardiovascular diseases[J].Biomarker Insights，2017（13）：1-8.

[4]李靜，宋艷志，王夢(mèng)靜，等.納豆激酶與尿激酶的對(duì)比性研究[J].中國(guó)藥劑學(xué)雜志，2016，14（4）：125-134.

[5]Jensen，G.S.，Lenninger，M.，Ero，M.P.，et al.?Consumption of nattokinase is associated with reduced blood pressure and von Willebrand factor，a cardiovascular risk marker：results from a randomized，double-blind，placebo-controlled，multicenter North American clinical trial[J].Integrated Blood Pressure Control，2016（9）：95-104.

[6]齊少卿，李晨，盧海強(qiáng)，等.保加利亞乳桿菌異源表達(dá)納豆激酶的性質(zhì)研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2017，17（4）：51-57.

[7]Peng，Y.，Yang，X.，Zhang，Y.Microbial fibrinolytic enzymes：an overview of source，production，properties，and thrombolytic activity in vivo[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2005（69）：126-132.

[8]Urano，T.，Ihara，H.，Umemura，K.，et al.The profibrinolytic enzyme subtilisin NAT purified from Bacillus subtilis cleaves and inactivates plasminogen activator inhibitor type 1[J].Journal of Biology Chemistry，2001（276）：24690-24696.

[9]Jang，J.Y.，Kim，T.S.，Cai，J.M.，et al.Nattokinase improves blood flow by inhibiting platelet aggregation and thrombus formation[J].Laboratory Animal Research，2013，29（4）：221-225.

[10]韓嵐，王歡，王佳琪，等.密碼子優(yōu)化的納豆激酶基因在番茄果實(shí)中的瞬時(shí)表達(dá)[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，47（1）：73-79.

[11]韓嵐，鞠林芳，牛一丁，等.納豆激酶基因的優(yōu)化設(shè)計(jì)、合成及其在煙草葉片中的瞬時(shí)表達(dá)[J].中國(guó)生物工程雜志，2015，35（9）：14-20.

[12]Han，L.，Zhang，L.Q.，Liu，J.L.，et al.Transient expression of optimized and synthesized nattokinase gene in melon（Cucumis melo L.）fruit by agroinfiltration[J].Plant Biotechnology，2015，32（2）：175-180.

[13]劉靚蕾，張妍，孫曉蕾，等.人工合成的納豆激酶基因轉(zhuǎn)化煙草的研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2014（10）：94-100.

[14]劉朔.納豆激酶基因密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)與合成及在畢赤酵母中的高效表達(dá)[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[15]葛春蕾，劉中美，崔文璟，等.通過串聯(lián)啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)納豆激酶在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)[J].現(xiàn)代食品科技，2016，32（11）：72-77、15.

[16]何孝天.Bacillus natto 納豆激酶的重組表達(dá)及熱穩(wěn)定性改造[D].江蘇無錫：江南大學(xué)，2014.

[17]Liang，X.B.，et al.Secretory expression of nattokinase from Bacillus subtilis YF38 in Escherichia coli [J].Molecular Biotechnology，2007，37（3）：187-194.

[18]Chiang，C.J.，et al.?Efficient system of artificial oil bodies for functional expression and purification of recombinant nattokinase in Escherichia coli [J].Journal of Agricultural Food Chemistry，2005，53（12）：4799-4804.

[19]Wu，S.M.，F(xiàn)eng，C.F.，Zhong，J.，et al.Enhanced production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis by promoter optimization[J].World Journal of Microbiology Biotechnology，2011，27（1）：99-106.

[20]趙菡，周麗，周哲敏.通過定點(diǎn)突變提高納豆激酶的酶活及熱穩(wěn)定性[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2018（9）：36-40、47.

[21]劉中美，等.通過定點(diǎn)突變?cè)鰪?qiáng)納豆激酶的熱穩(wěn)定性[J].現(xiàn)代食品科技，2015，31（2）：37-41.

[22]劉朔，姜梅，陳曉紅，等.納豆激酶第36位氨基酸突變對(duì)其活性及熱穩(wěn)定性的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31（3）：130-136.

[23]Wu，S.，F(xiàn)eng，C.，Zhong，J.，et al.Roles of S3 site residues of nattokinase on its activity and substrate specificity[J].The Journal of Biochemistry，2007，142（3）：357-364.

[24]Zheng，Z.L.，Ye，M.Q.，Zuo，Z.Y.，et al.Probing the importance of hydrogen bonds in the active site of the subtilisin nattokinase by site-directed mutagenesis and molecular dynamics simulation[J].Biochemical Journal，2006，395（3）：509-515.

[25]周波.枯草芽孢桿菌Na-002納豆激酶基因的克隆、表達(dá)及定點(diǎn)突變研究[D].山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[26]Cai，Y.J.，et al.Directed evolution improves the fibrinolytic activity of nattokinase from Bacillus natto[J].FEMS Microbiology Letters，2011，325（2）：155-161.

[27]艾海新，張力，張新剛，等.納豆激酶的原核表達(dá)、純化及其特性分析[J].微生物雜志，2017，37（1）：20-27.

[28]李瑩，陳斌，敬俊鋒，等.納豆激酶基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)[J].重慶師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，29（1）：77-81.

[29]蔣凡.納豆激酶的表達(dá)與復(fù)性研究[D].蘭州：蘭州大學(xué)，2008.

[30]張淑梅，李晶，王玉霞，等.納豆激酶基因的表達(dá)及純化[J].生物技術(shù)，2003，13（6）：12-15.

[31]童煜，陳守春，張思仲.納豆激酶原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其活性鑒定[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2007，13（3）：369-372.

[32]郭文秀.前納豆激酶原基因的克隆與表達(dá)[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古大學(xué)，2006.

[33]Chen，P.T.，Chiang，C.J.，Chao，Y.P.Medium optimization for the production of recombinant nattokinase by Bacillus subtilis using response surface methodology[J].Biotechnology Progress，2007，23（6）：1327-1332.

[34]Cui，W.J.，et al.Stepwise modifications of genetic parts reinforce the secretory production of nattokinase in Bacillus subtilis[J].Microbial Biotechnology，2018（11）：930-942.

[35]Wei，X.T.，Zhou，Y.H.，Chen，J.B.，et al.Efficient expression of nattokinase in Bacillus licheniformis：host strain construction and signal peptide optimization[J].Journal of Industrial Microbiology Biotechnology，2015（42）：287-295.

[36]趙新宇，等.高產(chǎn)納豆激酶地衣芽孢桿菌工程菌全合成培養(yǎng)基優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2016，37（7）：140-145.

[37]敬俊鋒，等.納豆激酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)[J].生物學(xué)雜志，2011，28（5）：55-60.

[38]閆少華.重組納豆激酶在畢赤酵母中表達(dá)及大規(guī)模發(fā)酵研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2010.

[39]Liang，X.B.，et al.Secretory expression of a heterologous nattokinase in Lactococcus lactis [J].Applied Microbiology and Biotechnology，2007，75（1）：95-101.

[40]Li，X.X.，et al.?Expression and purification of recombinant nattokinase in Spodoptera frugiperda cells[J].Biotechnology Letters，2007，29（10）：1459-1464.

[41]朱立成.納豆激酶和hGM-CSF在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)純化及活性研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2005.

[42]Ikemura，H.，Takagi，H.，Inouye，M.Requirement of pro-sequence for the production of active subtilisin E in Escherichia coli [J].The Journal of Biological Chemistry，1987，262（16）：7859-7864.

[43]蔡立濤，徐祥，王婷婷，等.納豆激酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)純化及抗體制備[J].中國(guó)生化藥物雜志，2010，31（1）：10-13.

[44]舒敏.納豆激酶在畢赤酵母中的表達(dá)及在大鼠體內(nèi)的溶栓作用的研究[D].武漢：湖北大學(xué)，2016.

[45]Nguyen，T.T.，Quyen，T.D.，Le，H.T.Cloning and enhancing production of a detergent-and organic-solvent-resistant nattokinase from Bacillus subtilis VTCC-DVN-12-01 by using an eight-protease-gene-deficient Bacillus subtilis WB800[J].Microbial Cell Factories，2013（12）：79.

Research Advancement on Recombinant Nattokinase

ZHAO Fu-yong1，YAN Han1，REN Guang-xu2，GAO Meng-xiang1，LIU Hong3，WANG Jing2

（1College of Life Science，Yangtze University，Jingzhou 434025，China;2Institute of Food and Nutrition Development，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Beijing 100081，China;3 College of Life Science，South-central University for Nationalities，Wuhan 430074，China）

Abstract：Nattokinase is a kind of alkaline serine protease with a strong and direct fibrinolytic activity，has been the focus of development of new antithrombotic agent to prevent cardiovascular disease because of its advantages over conventional drugs in recent decade.The gene cloning，physicochemical properties and biological function of nattokinase were first introduced briefly，then the main studies and progress of recombinant expression of nattokinase by genetic engineering technology including codon optimization，point mutation，efficient expression system and so on were summarized，meanwhile some technical bottlenecks and obstacles to nattokinase industrial production were analyzed.Finally，the application prospect of nattokinase in medicine，food and other industries in the near future was discussed.

Keywords：nattokinase;fibrinolytic activity;recombinant expression strategy;application prospect

（責(zé)任編輯?唐建敏）