一株野生粗毛纖孔菌的分類鑒定及其發(fā)酵上清液的抗腫瘤活性

唐少軍 陳定安 邵晨霞 許雋 楊祎 靳磊 吳勝蓮

摘要：【目的】對(duì)一株野生粗毛纖孔菌進(jìn)行分類學(xué)鑒定，并分析其發(fā)酵上清液抗腫瘤活性，為粗毛纖孔菌的開發(fā)利用及抗腫瘤活性機(jī)制研究提供理論依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^(guò)形態(tài)特性觀察、ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建等方法對(duì)一株野生粗毛纖孔菌（簡(jiǎn)稱IH3菌株）進(jìn)行分類學(xué)鑒定，并利用B16、Hep-3B、Hela、MCF-7、HCT-116和4T1 6種腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞HUVEC分析該菌株發(fā)酵上清液的抗腫瘤譜。從石油醚、乙酸乙酯和正丁醇中篩選出萃取抗腫瘤活性物質(zhì)的最佳有機(jī)溶劑，利用液相色譜分離技術(shù)分離抗腫瘤活性組分，并利用MTT（四唑鹽）法分析活性組分對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的半致死濃度（IC50）?！窘Y(jié)果】IH3菌株的形態(tài)特性與粗毛纖孔菌相似，且其ITS序列與粗毛纖孔菌（MF183947.1）的相似度最高，為98%，鑒定為粗毛纖孔菌。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果也顯示，IH3菌株屬于纖層孔菌屬類群，與3個(gè)粗毛纖孔菌菌株的親緣關(guān)系較近。IH3菌株的發(fā)酵上清液對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制活性排序?yàn)椋築16>Hep-3B>Hela>MCF-7>4T1=HCT-116。正丁醇萃取的IH3菌株發(fā)酵上清液抗腫瘤活性組分對(duì)B16腫瘤細(xì)胞的抑制率最高，達(dá)80%，說(shuō)明正丁醇對(duì)發(fā)酵上清液中抗腫瘤活性組分的萃取效果最佳。利用液相色譜分離方法可有效獲得純度較高的單一抗腫瘤活性組分（WIH3），該活性組分對(duì)B16、Hep-3B、Hela和MCF-7腫瘤細(xì)胞的半致死濃度（IC50）分別為29.322、37.387、47.029和58.009 μg/mL?！窘Y(jié)論】IH3菌株被鑒定為粗毛纖孔菌，與已發(fā)表的粗毛纖孔菌菌株存在遺傳差異，可能為粗毛纖孔菌的新亞種，其發(fā)酵上清液具有廣譜的抗腫瘤活性。

關(guān)鍵詞： 粗毛纖孔菌;鑒定;抗腫瘤活性;液相色譜分離;半致死濃度（IC50）

中圖分類號(hào)： S718.81? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）08-1671-09

Classification and identification of a wild Inonotus hispidus and the antitumor activity of the fermentation supernatant

TANG Shao-jun1， CHEN Ding-an2， SHAO Chen-xia1， XU Jun1， YANG Yi1，

JIN Lei1， WU Sheng-lian1*

（1Hunan Microbiology Institute， Changsha? 410009， China; 2 Agricultural Science Research Institute of Dingcheng District， Changde， Hunan? 415102， China）

Abstract：【Objective】The wild Inonotus hispidus was classified and identified，and the antitumor activity of its fermentation supernatant was analyzed，which provided a basis for the development and utilization of this strain as well as research of antitumor activity mechanism. 【Method】A wild I. hispidus（IH3 fungi） was classified and identified through the morphology observation，ITS sequence and phylogenetic tree. The antitumor spectrum of the fermentation supernatant was analyzed by six kinds of tumor cells including B16， Hep-3B， Hela， MCF-7， HCT-116 and 4T1 and normal cell HUVEC. The optimal organic reagent was selected from petroleum ether，? acetic ether and normal butanol. The antitumor active component was isolated by liquid chromatography， and medial lethal concentration（IC50） of different tumor cells was ana-lyzed by MTT（tetrazolium salt）. 【Result】IH3 fungi was similar to I. hispidus in morphology，its ITS sequence was the closest to the I. hispidus strain MF183947.1 with the similarity of 98%. It was preliminarily identified as I. hispidus.The phylogenetic tree analysis indicated that IH3 fungi belonged to Inonotus， and had close relationship with three I. hispidus strains. Inhibition activity of IH3 fungi fermentation supernatant to the tumor cells was： B16>Hep-3B>Hela>MCF-7>4T1=HCT-116. The inhibition rate of antitumor active component of IH3 strain fermentation supernatant extracted from normal butanol to B16 tumoe cell was the highest（80%），indicating that normal butanol had the best extraction effect on antitumor active substances in fermentation supernatant. A single antitumor active component（WIH3） with high purity was obtained by liquid chromatography. Its IC50 to tumor cells B16，Hep-3B，Hela and MCF-7 were 29.322，37.387，47.029，58.009 μg/mL， respectively. 【Conclusion】The IH3 strain was identified as I. hispidus，which is different from the published I. hispidus strains genetically，it may be a new subspecies of I. hispidus，and its fermentation supernatant has a broad spectrum of antitumor activity.

Key words： Inonotus hispidus; identification; antitumor activity; liquid chromatography; medial lethal concentration

0 引言

【研究意義】粗毛纖孔菌（Inonotus hispidus）主要生長(zhǎng)在水曲柳、桑樹、榆樹、楊樹和日本槐等樹種的活立木上，偶爾生長(zhǎng)在其倒木上（王婷等，2016;Markakis et al.，2017）。該菌是一種重要的藥用真菌，在我國(guó)東北地區(qū)常用于治療消化不良等胃病，新疆南部等地區(qū)常用于治療癌癥、糖尿病等疑難疾?。ù迣殑P等，2009;甄占萱等，2013），但其菌種資源較少，主要采集野生的子實(shí)體入藥。因此，豐富粗毛纖孔菌的菌種資源，篩選分離出藥效成分含量高、活性強(qiáng)的新菌株，對(duì)粗毛纖孔菌的開發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，有關(guān)粗毛纖孔菌的研究主要集中在藥用價(jià)值方面（Awadh et al.，2003;Gründemann et al.，2016;Liu et al.，2019a）。陳志娜等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，粗毛纖孔菌甲醇提取物中的總多酚和總黃酮含量最高，抗氧化活性和抑菌活性最強(qiáng)，是天然抗氧化劑的良好來(lái)源。Liu等（2019b）研究發(fā)現(xiàn)，粗毛纖孔菌子實(shí)體和菌絲體中的多糖成分能顯著延長(zhǎng)小鼠的醉酒時(shí)間及縮短醒酒時(shí)間，并減緩由酒精引起的肝指數(shù)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性和丙二醛（MDA）含量的升高，提高乙醇脫氫酶（ADH）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，對(duì)急性酒精肝損傷小鼠具有一定的保護(hù)作用。此外，粗毛纖孔菌子實(shí)體中含有多種抗腫瘤活性成分，如inonotusin A對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、inoscavin C對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2和卵巢癌細(xì)胞skov3均具有一定的抑制作用（Zan et al.，2011;昝立峰等，2013）;子實(shí)體多糖成分具有抗腫瘤活性，可抑制H22荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)（張媛和包海鷹，2014）;丁炔二醇丙氧基化合物（BMP）對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞有明顯的抑制作用，且誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡（楊樹東等，2019）;HDE[（4S，5S）-4-羥基-3，5-二甲氧基環(huán)己烯-2-烯酮]可通過(guò)增強(qiáng)caspase-3和caspase-8蛋白的表達(dá)而抑制小鼠肝癌細(xì)胞H22增長(zhǎng)（Yang et al.，2019）;Hispolon可通過(guò)阻礙細(xì)胞形成NF-κβ復(fù)合體而抑制腫瘤生長(zhǎng)（Paul et al.，2019）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然已有大量研究證實(shí)粗毛纖孔菌子實(shí)體具有良好的抗氧化、抗病毒和提高免疫力的作用，應(yīng)用潛力巨大，但其菌種資源匱乏，鮮見鑒定野生粗毛纖孔菌菌株并測(cè)定其發(fā)酵液抗腫瘤活性的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)形態(tài)特性觀察、ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建等方法對(duì)一株野生粗毛纖孔菌進(jìn)行分類學(xué)鑒定;利用B16、Hep-3B、Hela、MCF-7、HCT-116和4T1 6種腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞HUVEC分析該菌株發(fā)酵上清液的抗腫瘤譜;利用液相色譜分離技術(shù)分離抗腫瘤活性組分;利用MTT（四唑鹽）法分析活性組分的半致死濃度（IC50），通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析活性組分的藥用價(jià)值，為粗毛纖孔菌的藥用開發(fā)提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16、肝癌腫瘤細(xì)胞Hep-3B、人宮頸癌腫瘤細(xì)胞Hela、人乳腺癌腫瘤細(xì)胞MCF-7、小鼠乳腺癌腫瘤細(xì)胞4T1、人結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞HCT-116和人臍靜脈血管內(nèi)皮正常細(xì)胞HUVEC均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。供試的野生粗毛纖孔菌采摘于湖南省桑植縣的活楊樹主干上，由湖南省微生物研究院實(shí)驗(yàn)室保藏（保藏編號(hào)IH3，NCBI登錄號(hào)MK583675.1），以下簡(jiǎn)稱為IH3菌株。rTaq DNA聚合酶、T載體和連接酶均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。色譜甲醇購(gòu)自美國(guó)FISHER公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自北京化工廠。胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司。

主要儀器設(shè)備：N-1000v-W型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Büchi公司）、XDS-3型倒置生物顯微鏡（意大利Optika公司）、C18反相色譜柱、酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）和Agilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 菌株分離純化 將采集的子實(shí)體用75%酒精消毒表面，以無(wú)菌手術(shù)刀縱切，從縱切面的中心位置切取黃豆大小的菌塊，置于PDA固體培養(yǎng)基表面，26 ℃培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)，待菌絲萌發(fā)后，挑取菌絲至新的PDA培養(yǎng)基，反復(fù)3次后，將菌絲轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基進(jìn)行留種。

1. 2. 2 形態(tài)學(xué)鑒定 采用插片法觀察分離菌株的菌絲形態(tài)：將純化菌絲接種于PDA固體培養(yǎng)基，在離接種點(diǎn)2 cm處45o斜插蓋玻片，26 ℃培養(yǎng)7 d后，取出布有菌絲的蓋玻片，置于載玻片上，在XDS-3型倒置生物顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1. 2. 3 ITS序列擴(kuò)增 供試菌株接種至PDA固體培養(yǎng)基上，待菌絲長(zhǎng)滿后取適量菌絲，利用真菌基因組提取試劑盒提取其DNA，參照吳勝蓮等（2018）的方法，采用ITS1和ITS4通用引物PCR擴(kuò)增其ITS序列，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1. 2. 4 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建 將ITS序列測(cè)序結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，從中獲取與供試菌株親源關(guān)系較近的模式菌株ITS序列，并選取在分類上易與粗毛纖孔菌混淆的桑黃菌屬和針層孔菌屬的ITS序列，運(yùn)用ClustalX 1.81進(jìn)行多重序列比對(duì)。最后，利用MEGA 3.1的鄰接法（N-J）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（Replications=1000，Bootstrap值取百分比）。

1. 2. 5 菌株發(fā)酵上清液的抗腫瘤譜分析 將PDA固體培養(yǎng)基上的菌絲用打孔法接種到PDA液體培養(yǎng)基中，每100 mL液體培養(yǎng)基接種4個(gè)菌絲塊，置于26 ℃搖床培養(yǎng)箱（130 r/min）中培養(yǎng)10 d，用無(wú)菌紗布過(guò)濾出菌絲球后即可獲得發(fā)酵上清液。將發(fā)酵上清液用2 μm濾膜過(guò)濾除菌后4 ℃保存。用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，在96孔板中接種B16、Hep-3B、Hela、MCF-7、HCT-116和4T1腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞HVUEC，每孔1×103 cells/100 μL，置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)12 h，分別加入5、10、15、20、30和35 μL發(fā)酵上清液作為藥物組，以加入同體積的無(wú)菌水作為對(duì)照，調(diào)零組只加細(xì)胞培養(yǎng)基不加細(xì)胞和樣品，以上均設(shè)4個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)48 h后，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，每孔加5 mg/mL MTT 10 μL，培養(yǎng)3 h后，吸除MTT和培養(yǎng)基，每孔加入100 μL Formazan溶解液，振蕩15 min后，490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD，從而計(jì)算出發(fā)酵上清液對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率：細(xì)胞抑制率（%）=（藥物組-對(duì)照組）/（調(diào)零組-對(duì)照組）×100（張連茹等，2010）。

1. 2. 6 抗腫瘤活性成分萃取分離 收集6 L菌株發(fā)酵上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮體積至600 mL，再分裝成3份，各200 mL，分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇3種有機(jī)溶劑對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行萃?。w積比為有機(jī)溶劑∶發(fā)酵上清液=3∶1），分別萃取3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除有機(jī)溶劑后，分別用10 mL無(wú)菌水復(fù)溶。在96孔板中接種B16腫瘤細(xì)胞，分別加入30 μL的萃取樣品，培養(yǎng)48 h后計(jì)算發(fā)酵上清液對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率，跟蹤檢測(cè)活性成分，以篩選出萃取抗腫瘤活性物質(zhì)的最佳有機(jī)溶劑。

1. 2. 7 液相色譜分離 首先對(duì)正丁醇萃取的抗腫瘤活性成分進(jìn)行分子篩色譜分離（色譜柱Sephadex LH-20，流動(dòng)相0.08 mol/L NaH2PO4溶液，流速1.0 mL/min，檢出波長(zhǎng)250 nm，洗脫時(shí)間30 min），收集色譜主峰洗脫液，對(duì)其進(jìn)行抗腫瘤活性檢測(cè)，檢出活性峰。然后對(duì)收集的活性峰進(jìn)行反相色譜分離（C18反相色譜柱，流動(dòng)相A為無(wú)菌水，流動(dòng)相B為乙腈，流速0.5 mL/min，5%～95%無(wú)菌水進(jìn)行梯度洗脫，洗脫時(shí)間25 min，檢出波長(zhǎng)250 nm），收集每個(gè)峰洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除有機(jī)溶劑后，用10 mL無(wú)菌水復(fù)溶，對(duì)其進(jìn)行抗腫瘤活性檢測(cè)，檢出活性峰。

1. 2. 8 MTT法分析活性組分 將液相色譜分離得到的活性組分配制成不同濃度梯度溶液（10、20、30、40、50、60、70和80 μg/mL）。在96孔板中接種B16、Hela、Hep-3B和MCF-7腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞HUVEC，每孔1×103 cells/100 μL，分別加入30 μL不同濃度梯度的活性組分溶液，以30 μL無(wú)菌水為對(duì)照，5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48和60 h后，每孔加5 mg/mL MTT 10 μL，培養(yǎng)3 h后，吸除MTT和培養(yǎng)基，每孔加入100 μL Formanzan溶解液，振蕩15 min，490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD，計(jì)算活性組分對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率及半致死濃度（IC50）。

1. 3 數(shù)據(jù)分析

腫瘤細(xì)胞的抑制率采用GraphPad Prism 5進(jìn)行分析并制圖，IC50采用SPSS 13.0進(jìn)行分析并制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 IH3菌株的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

IH3菌株的子實(shí)體呈平伏狀，木栓質(zhì)，長(zhǎng)13 cm，寬8 cm，厚3 cm，上部分為青色褶皺狀，無(wú)粗毛，邊緣有褐色粗毛，下部分為金黃色并生長(zhǎng)有粗毛，粗毛間有孔隙（圖1-A）。該菌株菌絲在PDA固體培養(yǎng)基上以接種塊為中心呈輻射狀擴(kuò)張生長(zhǎng)，呈絨毛狀，生長(zhǎng)前期為白色，后期變?yōu)榻瘘S色，在棉藍(lán)試劑中不變色，在PDA液體培養(yǎng)基中菌絲呈黃色球型，可貼壁生長(zhǎng)，菌絲直徑約5 μm，極少分枝，有不明顯的分隔（圖1-B、圖1-C和圖1-D）。擔(dān)孢子呈橢圓形，表面光滑，平均長(zhǎng)度為8.8 μm，寬6.1 μm，形態(tài)特征與《中國(guó)真菌志》（張小青和戴玉成，2005）粗毛纖孔菌相似。

2. 2 IH3菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

對(duì)IH3菌株ITS序列的PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序后，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，發(fā)現(xiàn)ITS序列的長(zhǎng)度為810 bp，將其提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其與粗毛纖孔菌（MF183947.1）ITS序列的相似度為98%。結(jié)合該菌株的形態(tài)學(xué)特征，最終確定IH3菌株為粗毛纖孔菌（I. hispidus）。

從NCBI選取與IH3菌株同源性較高的3個(gè)粗毛纖孔菌菌株、纖孔菌屬5個(gè)模式菌種及在分類上易與粗毛纖孔菌混淆的針層孔菌屬和桑黃菌屬模式菌種的ITS序列，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2所示。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹明顯分為三大類群，Group 1為桑黃孔菌屬（Sanghuangporus），Group 2為針層孔菌屬（Phellinus），Group 3為纖層孔菌屬（Inonotus）。IH3菌株屬于Group 3（纖孔菌屬），與3個(gè)粗毛纖孔菌菌株的親緣關(guān)系較近，尤其是與粗毛纖孔菌（MF183947.1）的親緣關(guān)系最近，進(jìn)一步證實(shí)IH3菌株為粗毛纖孔菌。但該菌株在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹上形成獨(dú)立分支，且與親緣關(guān)系最近的菌株ITS相似度僅為98%，說(shuō)明IH3菌株與已發(fā)表的粗毛纖孔菌存在遺傳差異，可能是粗毛纖孔菌的新亞種。雖然粗毛纖孔菌的形態(tài)與桑黃菌屬和針層孔菌屬菌株類似，但三者分別屬于不同類群，存在明顯的遺傳差異。將IH3菌株的ITS序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為MK583675.1。

2. 3 IH3菌株發(fā)酵上清液的抗腫瘤譜分析結(jié)果

由圖3可知，對(duì)照組的腫瘤細(xì)胞形態(tài)規(guī)則且致密貼壁生長(zhǎng)，藥物組的腫瘤細(xì)胞明顯變形，細(xì)胞變圓稀疏，甚至漂浮。正常細(xì)胞HUVEC的對(duì)照組與藥物組幾乎沒有差別。由圖4可知，隨著發(fā)酵上清液體積的增加，B16、Hela、MCF-7和Hep-3B腫瘤細(xì)胞的抑制率明顯增加，但4T1和HCT腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞HUVEC的抑制率增加不明顯;IH3菌株發(fā)酵上清液對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制活性排序?yàn)椋築16>Hep-3B>Hela>MCF-7>4T1=HCT-116，說(shuō)明IH3菌株的發(fā)酵上清液具有廣譜的抗腫瘤活性。

2. 4 發(fā)酵上清液中腫瘤活性成分的萃取分離結(jié)果

分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對(duì)濃縮后的發(fā)酵上清液進(jìn)行萃取，以篩選出萃取抗腫瘤活性物質(zhì)的最佳有機(jī)試劑，結(jié)果如圖5所示。正丁醇萃取抗腫瘤活性成分對(duì)B16腫瘤細(xì)胞的抑制率最高，達(dá)80%，說(shuō)明正丁醇對(duì)發(fā)酵上清液中抗腫瘤活性成分的萃取效果最佳。

2. 5 液相色譜分離活性物質(zhì)

對(duì)正丁醇萃取的抗腫瘤活性成分進(jìn)行分子篩色譜分離，結(jié)果如圖6-A所示。共得到3個(gè)色譜主峰，分別對(duì)3個(gè)主峰的收集液進(jìn)行抗腫瘤活性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)19～23 min的色譜峰為活性峰。對(duì)分子篩收集到的活性峰進(jìn)行反相色譜分離，結(jié)果如圖6-B所示。7.6 min的色譜峰為活性峰，收集該活性峰的洗脫液，蒸發(fā)濃縮后用10 mL無(wú)菌水復(fù)溶，再用C18反相色譜柱進(jìn)行重復(fù)上樣檢測(cè)，結(jié)果如圖6-C所示。僅獲得單一活性峰，峰度較高，峰型對(duì)稱，純度達(dá)90%。可見，利用上述液相色譜分離方法可有效獲得純度較高的單一抗腫瘤活性組分，將該單一組分命名為WIH3。

2. 6 WIH3活性組分的IC50測(cè)定結(jié)果

將WIH3活性組分配制成不同濃度梯度的溶液，用于檢測(cè)其對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制活性，結(jié)果如圖7所示。隨著WIH3活性組分濃度的增加，對(duì)B16、Hep-3B、Hela和MCF-7腫瘤細(xì)胞的抑制率均逐漸增大，說(shuō)明該活性組分對(duì)這4種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制活性;當(dāng)WIH3活性組分濃度相同情況下，隨著作用時(shí)間的增加，腫瘤細(xì)胞的抑制率也相應(yīng)增大。

利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析WIH3活性組分對(duì)不同腫瘤細(xì)胞作用48 h的IC50，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該活性組分對(duì)腫瘤細(xì)胞B16、Hep-3B、Hela和MCF-7的IC50分別為29.322、37.387、47.029和58.009 μg/mL（表1），說(shuō)明WIH3活性組分具有廣譜高效的抗腫瘤活性。

3 討論

對(duì)大型真菌的鑒定主要依據(jù)形態(tài)特征，包括子實(shí)體、菌絲和孢子的形態(tài)。本研究結(jié)果表明，從野外采摘的IH3菌株在子實(shí)體形態(tài)上與粗毛纖孔菌和桑黃相似，但大型真菌子實(shí)體形態(tài)易受生長(zhǎng)環(huán)境和生長(zhǎng)時(shí)期等客觀因素的影響，且形態(tài)性狀的判斷易受主觀因素的影響，因此，僅從子實(shí)體形態(tài)無(wú)法對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。利用分子生物學(xué)手段如ITS序列分析等對(duì)大型真菌進(jìn)行鑒定，準(zhǔn)確度和靈敏度更高，且能更簡(jiǎn)便、快速、客觀地揭示其遺傳關(guān)系（Li et al.，2008;Alaei et al.，2009）。因此，本研究對(duì)IH3菌株進(jìn)行ITS序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與粗毛纖孔菌（MF183947.1）的ITS序列相似度最高，為98%，結(jié)合該菌株的形態(tài)學(xué)特征，最終確定IH3菌株為粗毛纖孔菌（I. hispidus）。但該菌株在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹上形成獨(dú)立分支，且與親緣關(guān)系最近的菌株相似度僅為98%，推測(cè)IH3菌株是粗毛纖孔菌的新亞種。

由于粗毛纖孔菌的子實(shí)體形態(tài)和生長(zhǎng)環(huán)境與藥用真菌桑黃類似，在新疆南部等地區(qū)將其作為桑黃入藥（崔寶凱等，2009;甄占萱等，2013）。目前，仍有大量學(xué)者對(duì)粗毛纖孔菌和桑黃的分類學(xué)地位產(chǎn)生爭(zhēng)議。崔寶凱等（2009）研究認(rèn)為，粗毛纖孔菌不是桑黃，二者子實(shí)體存在差異，粗毛纖孔菌較明顯的特征表現(xiàn)為子實(shí)體表面有大量褐色粗毛。Wu等（2012）通過(guò)研究分析桑黃的子實(shí)體形態(tài)和ITS序列得出桑黃為一個(gè)新種的結(jié)論，并命名為Inonotus sanghuang。Zhou等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，針層孔菌屬中與桑黃相關(guān)種不屬于同一類群，將相關(guān)種類組合成新的屬——桑黃孔菌屬（Sanghuangporus），且粗毛纖孔菌不屬于該屬。包海鷹等（2017）從生長(zhǎng)環(huán)境、形態(tài)特征和藥用功效等方面對(duì)現(xiàn)代藥用真菌粗毛纖孔菌和桑黃進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，古代中藥所指的“桑黃”不是單一的一個(gè)物種，而是包括來(lái)自針層孔菌屬（Phellinus）、纖層孔菌屬（Inonotus）和嗜藍(lán)孢孔菌屬（Fomitiporia）等菌種的木腐菌子實(shí)體。綜上所述，更多的學(xué)者認(rèn)為粗毛纖孔菌不是桑黃。本研究也發(fā)現(xiàn)，桑黃孔菌屬、針層孔菌屬和纖層孔菌屬分屬于不同的三大類群，IH3菌株屬于纖層孔菌屬類群，而不屬于桑黃孔菌屬類群。

粗毛纖孔菌是一種珍貴的藥用真菌，其子實(shí)體富含多種活性成分，主要為多糖和三萜類等抗腫瘤活性物質(zhì)，應(yīng)用潛力巨大，但野生粗毛纖孔菌資源缺乏，且受季節(jié)限制。已有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)液體發(fā)酵可得到大量粗毛纖孔菌菌絲，菌絲體也同樣含抗腫瘤活性物質(zhì)（李德海等，2018;劉鑫等，2018b）。且從發(fā)酵液中分離胞外次級(jí)代謝產(chǎn)物具有重復(fù)性好、樣本量大等優(yōu)點(diǎn)，是發(fā)現(xiàn)抗腫瘤新藥前導(dǎo)分子的重要手段。本研究從IH3菌株的發(fā)酵上清液中萃取獲得抗腫瘤活性成分后，利用Sephadex LH-20色譜柱對(duì)其進(jìn)行分子篩色譜分離，發(fā)現(xiàn)活性峰出現(xiàn)時(shí)間較晚，說(shuō)明活性成分分子量偏小，再用C18反相色譜柱將收集到的活性峰洗脫液進(jìn)行反相色譜分離，即可得到純度較高的單一組分WIH3，具有廣譜高效的抗腫瘤活性。劉鑫等（2018a）從粗毛纖孔菌的發(fā)酵液粗提物中檢測(cè)到2種新物質(zhì)，其中一種活性物質(zhì)為鳥苷，具有抗乳腺癌活性，與本研究發(fā)現(xiàn)WIH3活性組分能抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的結(jié)論相似。因此，后續(xù)應(yīng)對(duì)WIH3活性組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定及抗腫瘤機(jī)制分析。

4 結(jié)論

IH3菌株被鑒定為粗毛纖孔菌，與已發(fā)表的粗毛纖孔菌菌株存在遺傳差異，可能為粗毛纖孔菌的新亞種，其發(fā)酵上清液具有廣譜的抗腫瘤活性。

參考文獻(xiàn)：

包海鷹，楊爍，李慶杰，圖力古爾，李玉. 2017. “桑黃”的本草補(bǔ)充考證[J]. 菌物研究，15（4）：265-270. [Bao H Y，Yang S，Li Q J，Bau T，Li Y. 2017. Supplementary textual research on “Sanghuang”[J]. Journal of Fungal Research，15（4）：265-270.]

陳志娜，許嘉敏，葉韜，周江雯，孫雨晨，解昕媛，余璟，劉宇. 2018. 粗毛纖孔菌（Inonotus hispidus）的鑒定及其子實(shí)體不同溶劑提取物的抗氧化活性與抑菌活性研究[J]. 食品工業(yè)科技，39（23）：99-104. [Chen Z N，Xu J M，Ye T，Zhou J W，Sun Y C，Xie X Y，Yu J，Liu Y. 2018. Identification of Inonotus hispidus and antioxidant and antimicrobial activities of different solvent extracts from its fruiting bodies[J]. Science and Technology of Food Industry，39（23）：99-104.]

崔寶凱，戴玉成，楊宏. 2009. 藥用真菌粗毛纖孔菌概述[J]. 中國(guó)食用菌，28（4）：6-7. [Cui B K，Dai Y C，Yang H. 2009. Notes on the medicinal fungus of Inonotus hispidus[J]. Edible Fungi of China，28（4）：6-7.]

戴玉成，楊祝良. 2008. 中國(guó)藥用真菌名錄及部分名稱的修訂[J]. 菌物學(xué)報(bào)，27（6）：801-824. [Dai Y C，Yang Z L. 2008. A revised checklist of medicinal fungin China[J]. Mycosystema，27（6）：801-824.]

李德海，杜令娟，康寧，顧嘉林，王占斌. 2018. 提取技術(shù)對(duì)粗毛纖孔菌三萜類化合物制備及體外降血脂作用的影響[J]. 食品科學(xué)，39（10）：291-297. [Li D H，Du L J，Kang N，Gu J L，Wang Z B. 2018. Effect of extraction techniques on the extraction and hypolipidemic activity in vitro of triterpenoids from Inonotus hispidus[J]. Food Science，39（10）：291-297.]

劉鑫，侯若琳，金珊珊，戚夢(mèng)，胡開輝，鄭明鋒，傅俊生. 2018a. 藥用真菌粗毛纖孔菌的分子甄別及其發(fā)酵液抗乳腺癌活性研究[J]. 菌物學(xué)報(bào)，37（2）：215-225. [Liu X，Hou R L，Jin S S，Qi M，Hu K H，Zheng M F，F(xiàn)u J S. 2018a. Molecular screening of medicinal fungus Inonotus hispidus and antibreastcancer activities of its submerged fermentation broth[J]. Mycosystema，37（2）：215-225.]

劉鑫，侯若琳，麥夢(mèng)賢，吳小平，林文雄，鄭明鋒，傅俊生. 2018b. 粗毛纖孔菌子實(shí)體與菌絲體粗多糖改善小鼠急性酒精肝損傷的比較研究[J]. 菌物學(xué)報(bào)，37（11）：1532-1539. [Liu X，Hou R L，Mai M X，Wu X P，Lin W X，Zheng M F，F(xiàn)u J S. 2018b. Comparison of effects of crude polysaccharide from fruiting body and mycelia of Inonotus hispidus on acute alcoholic liver injury in mice[J]. Mycosystema，37（11）：1532-1539.]

王婷，包海鷹，圖力古爾，李玉. 2016. 寄生于蒙古黃榆上的粗毛纖孔菌生物學(xué)特性及馴化栽培[J]. 菌物學(xué)報(bào)，35（6）：694-704. [Wang T，Bao H Y，Bau T，Li Y. 2016. Biological characteristics and cultivation of Inonotus hispidus parasitizing on Ulmus macrocarpa var. Mongolica[J]. Mycosystema，35（6）：694-704.]

吳勝蓮，唐少軍，靳磊，邵晨霞，楊祎，賀月林. 2018. 不同茯苓菌株的質(zhì)量評(píng)價(jià)及遺傳關(guān)系鑒定[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，49（1）：8-13. [Wu S L，Tang S J，Jin L，Shao C X，Yang Y，He Y L. 2018. Quality evaluation and genetic relation identification for different Poria cocos strains[J]. Journal of Southern Agriculture，49（1）：8-13.]

楊樹東，包海鷹，王輝. 2019. 粗毛纖孔菌的化學(xué)成分及抗腫瘤活性成分[J]. 菌物學(xué)報(bào)，38（1）：127-133. [Yang S D，Bao H Y，Wang H. 2019. Chemical components and anti-tumour compounds from Inonotus hispidus[J]. Mycosystema，38（1）：127-133.]

昝立峰，包海鷹，圖力古爾，李玉，朱艷萍. 2013. 粗毛纖孔菌子實(shí)體化學(xué)成分[J]. 菌物學(xué)報(bào)，32（1）：150-156. [Zan L F，Bao H Y，Bau T，Li Y，Zhu Y P. 2013. Chemical composition in fruiting body of Inonotus hispidus（Hymenochaetales，Basidiomycota）[J]. Mycosystema，32（1）：150-156.]

張連茹，易玉婷，陳俊杰，張偉，黃耀堅(jiān)，鄭忠輝，宋思揚(yáng)，沈月毛. 2010. 基于抗腫瘤活性化合物MED煙酸類衍生物的設(shè)計(jì)及作用靶點(diǎn)[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，31（6）：1184-1189. [Zhang L R，Yi Y T，Chen J J，Zhang W，Huang Y J，Zheng Z H，Song S Y，Shen Y M. 2010. Probing target and designing nicotinoid derivatives for antitumor leading compound MED[J]. Chemical Journal of Chinese Universities，31（6）：1184-1189.]

張小青，戴玉成. 2005. 中國(guó)真菌志（第二十九卷）銹革孔菌科[M]. 北京：科學(xué)出版社：44-45. [Zhang X Q，Dai Y C. 2005. Chinese fungi（vol. 29） Hymenochaetaceae[M]. Bei-jing：Science Press：44-45.]

張媛，包海鷹. 2014. 四種多孔菌子實(shí)體粗多糖抗腫瘤活性的比較研究[J]. 菌物學(xué)報(bào)，33（1）：114-120. [Zhang Y，Bao H Y. 2014. A comparative study on antitumor activities of polysaccharides from four species of Polyporaceae[J]. Mycosystema，33（1）：114-120.]

甄占萱，李云祥，王暉，楊貴明，宋永學(xué). 2013. 野生桑黃的生長(zhǎng)發(fā)育及環(huán)境調(diào)查[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，39（2）：333-339. [Zhen Z X，Li Y X，Wang H，Yang G M，Song Y X. 2013. An investigation on development and growth environment of wild Phellinus linteus[J]. Science of Sericulture，39（2）：333-339.]

Alaei H D，Backer M，Nuytinck J. 2009. Hylogenetic relationships of Puccinia horiana and other rust pathogens of Chrysanthemum morifolium based on rDNA ITS sequence analysis[J]. Mycological Research，113（6/7）：668-683.

Awadh A N A，Mothana R A A，Lesnau A，Pilgrim H，Linde-quist U. 2003. Antiviral activity of Inonotus hispidus[J]. Fitoterapia，74（5）：483-485.

Gründemann C，Arnhold M，Meier S，B?cker C，Garcia-K?ufer M，Grunewald F，Steinborn C，Klemd A M，Wille R，Huber R，Lindequist U. 2016. Effects of Inonotus hispidus extracts and compounds on human immunocompetent cells[J]. Planta Medica，82（15）：1359-1367.

Li Z，F(xiàn)eng X，Lu S，Zhang F，Wang F，Huang S. 2008. Mole-cular phylogeny of Pneumocystis based on 5.8S rRNA gene and the internal transcribed spacers of rRNA gene sequences[J]. Science in China Series C：Life Sciences，51（5）：445-452.

Liu X，Hou R，Xu K，Chen L，Wu X，Lin W，Zheng M，F(xiàn)u J. 2019a. Extraction，characterization and antioxidant activity analysis of the polysaccharide from the solid-state fermentation substrate of Inonotus hispidus[J]. International Journal of Biological Macromolecules，23（15）：468-476.

Liu X，Hou R，Yan J，Xu K，Wu X，Lin W，Zheng M，F(xiàn)u J. 2019b. Purification and characterization of Inonotus hispidus exopolysaccharide and its protective effect on acute alcoholic liver injury in mice[J]. International Journal of Biological Macromolecules，4（129）：41-49.

Markakis E A，Kavroulakis N，Ntougias S，Koubouris G C，Sergentani C K，Ligoxigakis E K. 2017. Characterization of fungi associated with wood decay of tree species and grapevine in Greece[J]. Plant Disease，101（11）：1929-1940

Paul M，Panda M K，Thatoi H. 2019. Developing Hispolon based novel anticancer therapeutics against human（NF-κβ） using in silico approach of modelling，docking and protein dynamics[J]. Journal of Biomolecular Structure & Dyna-mics，37（15）：3947-3967.

Wu S H，Dai Y C，Hattori T，Yu T W，Wang D M，Parmasto E，Chang H Y，Shih S Y. 2012. Species clarification for the medicinally valuable “Sanghuang” mushroom[J]. Botanical Studies，53：135-149.

Yang S，Bao H，Wang H，Li Q，2019.Anti-tumour effect and pharmacokinetics of an active ingredient isolated from Ino-notus hispidus[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin，42（1）：10-17.

Zan L F，Qin J C，Zhang Y M，Yao Y H，Bao H Y，Li X，2011.Antioxidant hispidin derivatives from medicinal mushroom Inonotus hispidus[J]. Chemical and Pharmaceutical Bulletin，59（6）：770-772.

Zhou L W，Josef? V，Cony D，Assefa A，Stenlid J，Abate D，Wu S，Dai Y C. 2015. Global diversity and taxonomy of the Inonotus linteus complex（Hymenochaetales，Basidiomycota）：Sanghuangporus gen. nov.，Tropicoporus excentrodendri and T. guanacastensis gen. et spp. nov.，and 17 new combinations[J].Fungal Diversity，77（1）：335-347.

（責(zé)任編輯 陳 燕）