基于形態(tài)的無細胞百日咳疫苗純化新工藝建立研究

許曉紅 張沛佩

摘 要：為控制和穩(wěn)定無細胞百日咳疫苗（Acellular pertussis vaccine，APV）中主要成分的比例，建立了一種適合大規(guī)模生產(chǎn)的無細胞百日咳疫苗的純化新工藝。通過形態(tài)超濾對脫毒后的無細胞百日咳抗原進行純化，比較從純化樣品的純度與回收率以及效價等方面與透析法進行試驗對照。收獲前的菌液的pH值調(diào)節(jié)為5.8-6.0，疫苗的主要保護性抗原的上清液中的含量可明顯增加。采用強陽離子交換色譜的方法，可以一步完成從捕獲目的蛋白到多成分的分離純化。在無細胞百日咳抗原溶液中擁有較高的解毒劑和色素的去除效率，在采用形態(tài)超濾工藝之后，原液的回收率與效價也高于透析法。建立了一種新的色譜凈化工藝，可線性放大，適合大規(guī)模生產(chǎn)APV。通過形態(tài)超濾法對細胞百日咳抗原進行純化，可作為透析的替代方法，奠定了疫苗質(zhì)量標準的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：超濾;百日咳;發(fā)酵;純化

1 引言

百日咳是百日咳菌造成的急性呼吸道疾病之一，在嬰幼兒中發(fā)病常見，預(yù)防百日咳的有效手段是免疫接種百日咳疫苗。百日咳毒素（Pertussis toxin，PT）和絲狀血凝素（Filamentoushemagglutinin，F(xiàn)HA）2 種保護性抗原組分為無細胞百日咳疫苗（Acellular pertussis vaccine，APV）主要成分。大發(fā)酵罐培養(yǎng)細菌、硫酸銨沉淀、解毒、高鹽濃度抽取、透析和蔗糖梯度超離心等步驟構(gòu)成傳統(tǒng)的無細胞百日咳疫苗生產(chǎn)工藝。在維持無細胞百日咳疫苗免疫原性的基礎(chǔ)上顯著減少副作用的發(fā)生。實驗基于中空纖維膜過濾系統(tǒng)，通過設(shè)定某些超過濾條件，純化脫毒后無細胞百日咳疫苗原液，實驗取得了令人滿意的結(jié)果。

2 材料與方法

2.1樣品

脫毒后的精制無細胞百日咳抗原溶液（以下簡稱脫毒后的抗原溶液）由菌苗室提供。生物指標、生長特性和毒性生產(chǎn)與目前所使用的菌種是相同的。

2.2主要試劑及儀器

培養(yǎng)基室提供注射用水;從國藥集團北京生物制品研究所有限責任公司化學(xué)試劑有限公司購氯化鈉，為藥用級;透析袋購自美國Viskase公司;綿羊抗人PT血清和綿羊抗人FHA血清購自NIBSC公司;HRP標記的兔抗羊IgG購自KPL公司;層析填料S Sepharose Fast Flow（裝填體積為500ml）購自GE公司。

2.3無細胞百日咳疫苗原液的超濾純化

先將脫毒后的抗原溶液用 10 kD 形態(tài)超濾柱超濾濃縮 5 倍左右，然后開始洗濾，在濾出體積為4 ～ 5 倍時停止洗濾，用 1 倍濾體積的生理鹽水對整個系統(tǒng)進行淋洗回收。精制抗原PBS打入脫毒罐，攪拌10分中，加入2.5%戊二醛，作用4小時后，加入10%賴氨酸，作用2小時（作為化學(xué)終止劑），在這兩小時中把罐中原液平均分到透析袋里，再入透析槽，透析6天后，收集抗原，打入靜置罐，再靜置15天后，超聲勻化，最后是無細胞百日咳疫苗原液。

2.4無細胞百日咳疫苗原液的透析純化

透析袋具有一定的阻斷分子量功能，比該分子量高的分子物質(zhì)例如蛋白質(zhì)不能通過，而某些較小的分子物質(zhì)，如無機鹽，則可以通過半滲透膜進行，該膜可以分離分子中的蛋白質(zhì)分子。將無病毒抗原溶液包裹在透析袋中并置于0。5%。在85%無菌氯化鈉溶液中，將抗原在2～8℃下透析，直至抗原為淺粉色。進行 10 倍體積脫鹽預(yù)處理使用 0. 01 mol / L PB 緩沖液（pH 5. 8），確保低于 0. 65 mS / cm樣品的電導(dǎo)值（25 ℃時的 0. 05 mol / LNaCl 溶液的電導(dǎo)率），離子交換層析上樣液被制備成，并對超濾廢液進行收集。透析時把待純化的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸餾水或緩沖液）中進行的，透析液可以更換，直至透析袋內(nèi)無機鹽等小分子物質(zhì)逐漸降低到最小值為止。

2.5 純化原液的鑒定

將超濾后和透析后的原液按比例還原至純化前體積，對照樣品為脫毒后的抗原溶液，分析樣品的純度使用12% SDS-PAGE。將各樣品 10 000 × g 離心15 min，稱量溶液中的固含量，計算回收率;測定透析后及超濾后原液的效價依照《中國藥典》三部（2010 版）附錄 2 。判定各洗脫組分的熱原是否合格的標準采用《中國藥典》三部（2005 版）附錄“熱原檢測法”進行判定;電泳圖譜中目的蛋白的純度的分析使用 GelAnalyzer 軟件。

3 結(jié)果

3.1 形態(tài)超濾濃縮和洗濾

70min內(nèi)濾出4800ml料液由超濾濃縮過程產(chǎn)生，濃縮了5倍，濾速衰減平穩(wěn)，平均濾速為42LMH（69.6ml/min）;在洗濾過程中，90min內(nèi)濾出5300ml料液，洗濾倍數(shù)為4.4倍，濾速衰減基本平穩(wěn)，平均濾速為36LMH（59.5ml/min）;隨著發(fā)酵的增加，F(xiàn)HA的蛋白質(zhì)含量逐步增加，在細菌中的濃度較低，變化不明顯。調(diào)節(jié)菌液p H值至7.3和6.3時，菌液上清液中PT和FHA含量略有升高。將各純化成分樣品的Westernblot結(jié)果進行比較，pH為5.8的加樣溶液經(jīng)色譜柱吸附后，目標蛋白全部被完全捕獲且無流動損失。并混合淋洗液與之前的洗濾液（1200ml），2.5倍為原液的最終濃縮倍數(shù)。透析法需要更換5次透析液，全過程約為6d。原液的顏色均為淺粉色，在兩種方法純化之后，標準符合《中國藥典》三部（2010版）的規(guī)定。

3.2 純化原液的鑒定

依據(jù)SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，無細胞百日咳疫苗原液的純度改變不明顯，在經(jīng)過形態(tài)超濾和透析法純化之后。具有良好的重復(fù)性對于建立的純化新工藝，可達90%以上的目的蛋白回收率，熱原均合格經(jīng)過動物試驗檢測后。透析純化略高于超濾純化的回收率，見表1;超濾純化的原液效價（11.166IU/ml）高于透析純化的原液效價（9.211IU/ml），二者均達到《中國藥典》三部（2010版）規(guī)定的標準（>8.0IU/ml）。

4 討論

作為用于大分子物質(zhì)的分離、濃縮和提純的一種膜分離技術(shù)，形態(tài)超濾在食品、發(fā)酵、醫(yī)藥、環(huán)保、化工等行業(yè)都有廣泛運用。在收獲后的濃縮和脫鹽作業(yè)中，由于膜包的固定大小，對蛋白質(zhì)的吸附不那么恒定，如果發(fā)酵擴大，這一步驟的損失可以明顯減少。本文對脫毒后的無細胞百日咳抗原溶液進行純化使用形態(tài)超濾技術(shù)，在純化效果、回收率、效價等方面與以往的透析方法進行了比較。結(jié)果表明，去除解毒劑和色譜法效果較好，收率較高，產(chǎn)率高于透析。在實際生產(chǎn)過程中，對不同的電源和液體組件的切向熱過濾膜的非專用鏈路程度不同。在超過濾階段，目標蛋白質(zhì)的損失率低于20%。

通過高相色譜法純化完成了從捕獲和濃縮目標蛋白到分離和純化多個成分的一步，有效縮短了整個下游過程的時間。切向過濾產(chǎn)生了一定的內(nèi)聚蛋白作用，這對于減少粗心劑的形成是有用的，而透析和超過濾后的創(chuàng)新則是有益的。后者的絮凝蛋白更細膩，且沉降速度更緩慢，因此形態(tài)超濾可以提高后期超聲波勻化效率，從而間接提高產(chǎn)品的效價。從超濾的外液中未檢測到有效抗原，從物料平衡的角度考慮，抗原損失的原因不在于“泄漏”，很可能在于該組分“沉淀”在流體通道及與膜材質(zhì)表面之間的黏附。下一步將嘗試通過增加淋洗次數(shù)和增大溶液的離子強度等方法來提高抗原的回收率。

5 結(jié)論

由于具有流暢的纖維通道，中空纖維超濾膜柱允許高固含量的混濁物材料自由通脫，因而不發(fā)生通道阻塞的情況。臨床觀察顯示，APV和DTAP的免疫效果與百日咳疫苗的免疫效果相似，副作用大大減少。在本實驗中，建立了一種可線性放大工藝、以適應(yīng)大規(guī)模的APV生產(chǎn)。應(yīng)用形態(tài)超濾技術(shù)純化無細胞百日咳抗原可替代透析工藝。為疫苗質(zhì)量標準的提高奠定了基礎(chǔ)。

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