• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    超濾法結(jié)合納升液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析漏出性胸腔積液中多肽組分

    2017-03-02 19:28陳世范楊靜波張敏李曉鷗劉曉峰
    分析化學(xué) 2017年2期

    陳世范 楊靜波 張敏 李曉鷗 劉曉峰 郭宏華 何成彥 高洪文

    摘要漏出性胸腔積液中的多肽和蛋白質(zhì)等生物分子直接或間接地與機體特定的生理、病理狀態(tài)相關(guān),反映了肺部或者全身其它部位疾病的信息。本研究利用超濾法將漏出性胸腔積液中的多肽組分進行分離,經(jīng)脫鹽富集后,進行納升液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。結(jié)果表明,在漏出性胸腔積液中共鑒定到來源于52種蛋白的314條多肽,超過一半的肽段來源于纖維蛋白原,并且許多肽段具有階梯序列的特征。此外,在來源于膠原蛋白和纖維蛋白原的多肽中還發(fā)現(xiàn)了大量的脯氨酸氧化修飾?;虮倔w論富集分析顯示,漏出性胸腔積液多肽組分所屬蛋白均具有胞外分泌的屬性。本研究給出了漏出性胸腔積液中多肽組的序列、等電點、分子量、翻譯后修飾等理化參數(shù)的分布特征,為進一步尋找肺部疾病相關(guān)的多肽標志物提供了可借鑒的參考數(shù)據(jù)和分析方法。

    關(guān)鍵詞多肽組; 超濾; 納升液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜; 漏出性胸腔積液

    1引 言

    胸膜腔是位于肺和胸壁之間的一個潛在的腔隙,正常情況下含有少量起潤滑作用的液體。胸腔積液是胸膜腔內(nèi)液體的產(chǎn)生和吸收失衡,致使過多的液體聚積形成[1],包含多種由血漿濾過及炎癥或上皮細胞釋放的蛋白。胸腔積液是臨床上常見的征象,既可由胸膜疾病引起,也可由其它臟器病變產(chǎn)生。根據(jù)其生化特性,胸腔積液分為漏出液和滲出液[2]。漏出性胸腔積液常見于胸膜毛細血管內(nèi)靜水壓增高, 如心力衰竭、縮窄性心包炎、血容量增加、上腔靜脈或奇靜脈受阻等,或者胸膜毛細血管內(nèi)膠體滲透壓降低, 如低蛋白血癥、肝硬化、腎病綜合征、急性腎小球腎炎、粘液性水腫等。多是由于靜脈回流受阻,使得毛細血管內(nèi)壓增加, 從而生成的大量組織液。而滲出性胸腔積液多由炎癥或惡性腫瘤引起。

    胸腔積液中的多肽、蛋白質(zhì)等生物分子直接或間接地與機體特定的生理、病理狀態(tài)相關(guān),反映了肺部或者全身其它部位疾病的信息[3~5]。相對于胸腔鏡引導(dǎo)下的組織活檢,獲取胸腔積液對患者的損傷很小,屬于微創(chuàng)的方法。因此,越來越多的研究將胸腔積液作為尋找與肺部疾病相關(guān)生物標志物的理想來源。隨著現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中的主要工具,在尋找特定疾病相關(guān)的蛋白、多肽、小分子代謝物等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用[6~8]。目前,大多數(shù)的相關(guān)研究都是針對滲出性胸腔積液(滲出液)中與特定生理病理相關(guān)的生物分子[9~11],鮮有針對漏出性胸腔積液(漏出液)的研究報道,而對其中多肽組分的分析更是缺乏系統(tǒng)研究。

    超濾技術(shù)是一種壓力驅(qū)動的膜分離技術(shù),其優(yōu)點是操作簡單,分離效率高,不涉及到相轉(zhuǎn)移,無需添加其它化學(xué)試劑,能夠最大限度地保持生物活性物質(zhì)的天然狀態(tài)[12]。在本研究中,利用超濾技術(shù)將漏出性胸腔積液中的多肽組分進行分離,脫鹽富集后, 進行納升液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。本研究可以為進一步尋找肺部疾病相關(guān)的多肽標志物提供可借鑒的參考數(shù)據(jù)和分析方法。

    2實驗部分

    2.1儀器與試劑

    納升高效液相色譜儀(美國Eksigent Technologies公司); TripleTOF 5600質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystems公司); 真空冷凍干燥機; Allegra TM X22R離心機(美國Beckman Coulter公司); 超濾離心管(MWCO 10 kDa,美國Pall公司); C18反相色譜捕獲柱 (100 μm × 30 mm, 3 μm,美國Eksigent Technologies公司); C18反相毛細管色譜分析柱(75 μm × 150 mm, 3 μm, 美國Eksigent Technologies公司); Pierce C18吸頭(100 μL, 美國Thermo Scientific公司)。

    甲酸、乙腈(HPLC級,美國Sigma Aldrich公司); Bradford蛋白定量試劑(美國BioRad公司); 實驗用水為經(jīng)MilliQ純水儀(美國Millipore公司)制備的超純水。

    2.2胸腔積液的采集和理化指標檢測

    所有胸腔積液標本的留取均在超聲引導(dǎo)下嚴格按照胸腔穿刺術(shù)操作規(guī)范進行,收集的樣本經(jīng)離心10 min (4℃,12000 r/min)去除組織碎片和懸浮細胞,留取適量進行胸水常規(guī)生化檢測,其余置于 80℃保存。每個樣本均按照Light標準判斷為漏出液[13],即蛋白總量<25 g/L,乳酸脫氫酶(LDH)<200 U/L,胸腔積液/血清蛋白比值<0.5,胸腔積液/血清LDH比值<0.6,且Rivalta實驗結(jié)果均為陰性。

    2.4.2質(zhì)譜條件使用配備納升噴霧離子源的TripleTOF 5600質(zhì)譜系統(tǒng)對多肽組分進行分析。使用信息依賴采集方式(Information dependent acquisition, IDA)進行二級質(zhì)譜掃描,每次IDA循環(huán)最多采集35個二級質(zhì)譜,每張二級質(zhì)譜的累積時間為80 ms,每次循環(huán)時間為2.5 s。

    2.5數(shù)據(jù)分析

    將采集到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)傳輸?shù)綌?shù)據(jù)處理工作站,并使用ProteinPilot 5.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件在SwissProt數(shù)據(jù)庫中進行檢索,所選蛋白數(shù)據(jù)庫物種為人。檢索參數(shù)設(shè)置為非酶切、磷酸化強調(diào)和生物學(xué)修飾。將得到的多肽所屬的蛋白質(zhì)列表上傳到基因本體論(http://geneontology.org/)網(wǎng)站,按照不同的細胞組分(Cell Components)進行富集分類。

    3結(jié)果與討論

    3.1胸腔漏出液多肽組分的質(zhì)譜分析

    將采集的胸腔積液標本進行胸水常規(guī)生化檢測,按照Light標準判斷為漏出液的樣本作為本研究分析的對象[13]。首先采用超濾法將漏出性胸腔積液樣本中的小分子物質(zhì)分離出來,再利用反相C18層析材料將其進一步富集,同時也將樣品進行了脫鹽處理。再利用納升液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對樣品進行分析,所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)在uniprot 庫中的人種(Homo sapiens)蛋白庫中檢索,共得到314 條序列特異性多肽,質(zhì)譜中檢測到的肽段電荷數(shù)2~6。這些肽段的分子量分布在828~6071 Da(圖1A),其中大部分分布在1000~3000 Da之間。肽段等電點分布在3.32~12.01(圖1B),其中弱酸性的肽段(pI 4.0~5.0)分布較多。結(jié)合分子量因素,看出314條肽段的分布并不平均,分別主要集中分布在4個不同等電點區(qū)域3.3~4.8,5.2~6.2,6.5~7.1和8.2~11.0(圖1C)。

    與其它臨床樣本來源的多肽組學(xué)研究[7,14]類似,在漏出性胸腔積液中也發(fā)現(xiàn)了許多具有階梯序列特征的多種肽段。其中,既有在N端遞增的多肽,也有在C端遞增的多肽。如來源于骨橋蛋白的3個肽段RISHELDSASSEVN,ISHELDSASSEVN,SHELDSASSEVN(圖2A); 以及來源于血清白蛋白的4個肽段DAHKSEVAHRFKDLGEENFKA,DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVL,DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAF,DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQY(圖2B)。 這些階梯多肽普遍存在于各種天然體液等臨床樣本中,常由于體內(nèi)特定環(huán)境下的內(nèi)源性酶解作用產(chǎn)生,其含量、分布、斷裂方式等特征可能與機體特定的生理、病理活動密切相關(guān)。例如,Bedin等[15]發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸腫瘤患者血液中存在大量由特定蛋白酶產(chǎn)生的階梯多肽,這些階梯多肽的斷裂模式和分布特點具有顯著的病理特異性,因此有望作為結(jié)直腸腫瘤的新穎特異的標志物。Tian等[16]使用多空二氧化硅納米顆粒對健康人血漿中的多肽組進行了富集,質(zhì)譜分析結(jié)果顯示其中含有階梯多肽,并指出Chymosin 和Cathepsin D可能是產(chǎn)生這些階梯多肽的主要內(nèi)源性蛋白酶。

    3.2漏出性胸腔積液多肽的脯氨酸氧化修飾

    從數(shù)據(jù)庫檢索的結(jié)果中還可以發(fā)現(xiàn),在漏出性胸腔積液中的部分多肽發(fā)生了多種翻譯后修飾的情況,包括磷酸化、脫氨基化、N端焦谷氨酸化、N端乙酰化、甲硫氨酸氧化、雙氧化、脯氨酸氧化、絲氨酸脫水化等(圖3)。其中,最多的修飾類型為脯氨酸氧化。值得注意的是,所有的脯氨酸修飾都發(fā)生在纖維蛋白原和膠原蛋白中,以膠原蛋白為多(表1)。膠原蛋白是肺臟間質(zhì)組織的主要組成成分之一,膠原蛋白容易被氧化,導(dǎo)致膠原蛋白分子內(nèi)的結(jié)構(gòu)和生化性質(zhì)改變,是衰老和許多疾病的病理生理機制的一個關(guān)鍵性決定因素[17,18]。

    有研究表明,膠原蛋白等胞外基質(zhì)成分的降解產(chǎn)物多肽向外周體液中的分泌與肺臟的組織重塑密切相關(guān),因而可以作為許多肺部疾病預(yù)后的特異性生物標志物[19]。本研究除了在漏出性胸腔積液中發(fā)現(xiàn)大量膠原蛋白降解產(chǎn)物外,還發(fā)現(xiàn)了其降解產(chǎn)物中脯氨酸的氧化修飾狀態(tài),這為進一步研究將脯氨酸氧化的膠原蛋白等胞外基質(zhì)成分的降解產(chǎn)物多肽作為特定疾病、生理病理狀態(tài)的生物標志物提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參照。

    3.3漏出性胸腔積液多肽所歸屬的蛋白質(zhì)

    在漏出性胸腔積液中鑒定到的314條多肽來源于52種蛋白。其中,分別有136、30和9條肽段來源于α纖維蛋白原、β纖維蛋白原和γ纖維蛋白原(圖4)。即有超過一半的肽段來源于纖維蛋白原,這與漏出性胸腔積液所處的組織內(nèi)環(huán)境的特異性密切相關(guān)。眾所周知,纖維蛋白原是一種由肝臟合成的具有凝血功能的蛋白質(zhì),是纖維蛋白的前體分子。經(jīng)凝血酶等因子作用后可以轉(zhuǎn)化為纖維蛋白而發(fā)揮各種生理和病理作用,人體內(nèi)源性的組織型纖溶酶原激活因子(uPA)和尿激酶(uPA)是降解纖維蛋白的主要因素。在臨床研究發(fā)現(xiàn)中,惡性胸腔積液中uPA和uPA的含量顯著升高,導(dǎo)致纖維蛋白原降解產(chǎn)物明顯高于其它非惡性疾病如結(jié)核性或心肌梗死患者的積液[20]。

    基因本體論(Gene ontology,GO)是一種在生物信息領(lǐng)域中極為重要的方法和工具,可以對海量的生物數(shù)據(jù)進行整合和重新利用,正逐步成為系統(tǒng)生物學(xué)領(lǐng)域中最具代表性的規(guī)范化的基因和基因產(chǎn)物特性的術(shù)語描繪或詞義解釋的工作平臺[20]。利用基因本體論對漏出性胸腔積液中的多肽組分所屬蛋白進行分析(圖5),發(fā)現(xiàn)均具有胞外分泌的屬性, 這與胸腔積液中含有的大量胞外基質(zhì)類的蛋白成分相吻合。

    4結(jié) 論

    本研究利用超濾法將漏出性胸腔積液中的多肽組分進行分離,經(jīng)脫鹽富集后,再進行納升液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。結(jié)果表明,在漏出性胸腔積液中共鑒定到來源于52種蛋白的314條多肽,超過一半的肽段來源于纖維蛋白原,并且許多肽段具有階梯序列的特征。此外,在來源于膠原蛋白和纖維蛋白原的多肽中還發(fā)現(xiàn)了大量的脯氨酸氧化修飾?;虮倔w論富集分析顯示,胸腔漏出液多肽組分所屬蛋白均具有胞外分泌的屬性。本研究詳細描述了漏出性胸腔積液中多肽組的序列、等電點、分子量、翻譯后修飾等理化參數(shù)的分布特征,為進一步尋找肺部疾病相關(guān)的多肽標志物提供了參考數(shù)據(jù)和分析方法。

    AbstractThe peptides, proteins and other biological molecules in transudative pleural effusion correlate directly or indirectly with specific physiological and pathological state, reflecting the information regarding the lungs or other parts of the body. In the present study, the peptide fraction in transudative pleural effusion was isolated by ultrafiltration. After desalted and enriched by C18 tips, the peptide mixture was analyzed by nano LCMS/MS. The results showed that 314 peptides, which were originated from 52 proteins, in pleural transudate were identified. More than half of the peptides were derived from fibrinogen. Many peptides were characterized as displaying ladder sequences. In addition, a large number of proline oxidation modifications were detected in the peptides derived from collagen and fibrinogen. Gene ontology enrichment analysis showed that the most of the proteins extracellular properties of pleural transudate polypeptide components were protein with exocytosis. The study provided a rapid and efficient separation and analysis methods for lung disease markers related peptide compounds in pleural fluid leakage. Also this research provided a rapid and effective method for screening peptide biomarkers related to lung diseases from transudative pleural effusion.

    KeywordsPeptidome; Ultrafiltration; Nanoliquid chromatographytandem mass spectrometry; Transudative pleural effusion

    亚洲精品一二三| 国产亚洲av高清不卡| 最新美女视频免费是黄的| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久99一区二区三区| 欧美日本中文国产一区发布| 在线观看免费视频网站a站| 日韩成人在线观看一区二区三区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 99精品久久久久人妻精品| av有码第一页| 国产精品九九99| 国产高清激情床上av| av在线播放免费不卡| 男女午夜视频在线观看| 老熟女久久久| 自线自在国产av| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲精品中文字幕在线视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 日韩免费av在线播放| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产亚洲欧美在线一区二区| 999久久久国产精品视频| 亚洲国产欧美网| 国产成人影院久久av| 亚洲七黄色美女视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 老司机影院毛片| 欧美日本中文国产一区发布| 捣出白浆h1v1| 亚洲av成人av| 亚洲,欧美精品.| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久久国产欧美日韩av| 国产亚洲一区二区精品| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲一区高清亚洲精品| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲精品国产一区二区精华液| aaaaa片日本免费| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产精华一区二区三区| 免费看十八禁软件| а√天堂www在线а√下载 | 人成视频在线观看免费观看| 一夜夜www| 国产精品 国内视频| 免费看十八禁软件| 男人的好看免费观看在线视频 | 美国免费a级毛片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 午夜免费鲁丝| 久久影院123| 搡老乐熟女国产| 国产高清国产精品国产三级| 老司机福利观看| 久久这里只有精品19| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久精品亚洲av国产电影网| 又大又爽又粗| 欧美成狂野欧美在线观看| 欧美色视频一区免费| 国产精品 国内视频| 一区二区三区精品91| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产国语露脸激情在线看| bbb黄色大片| 99久久精品国产亚洲精品| 中文字幕色久视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 欧美国产精品一级二级三级| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 精品久久久久久久久久免费视频 | 久久99一区二区三区| 亚洲av第一区精品v没综合| 天堂中文最新版在线下载| 又大又爽又粗| 99香蕉大伊视频| 免费观看a级毛片全部| 99香蕉大伊视频| 精品久久久久久电影网| 十分钟在线观看高清视频www| 中文字幕色久视频| 欧美成人免费av一区二区三区 | 一级毛片女人18水好多| 美女福利国产在线| 国产精品电影一区二区三区 | 国产一区二区激情短视频| 成人免费观看视频高清| 俄罗斯特黄特色一大片| 中文字幕人妻丝袜制服| 香蕉丝袜av| 黑丝袜美女国产一区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 真人做人爱边吃奶动态| 怎么达到女性高潮| 9191精品国产免费久久| 国产亚洲精品一区二区www | 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲九九香蕉| 一夜夜www| 日韩大码丰满熟妇| 欧美精品一区二区免费开放| 青草久久国产| 国产成人av教育| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久影院123| 午夜免费鲁丝| 国产亚洲精品一区二区www | 天天操日日干夜夜撸| 久久久久久久久久久久大奶| 免费看十八禁软件| 午夜老司机福利片| 很黄的视频免费| av网站在线播放免费| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久热在线av| 美女扒开内裤让男人捅视频| 黄色怎么调成土黄色| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲在线自拍视频| 真人做人爱边吃奶动态| 岛国在线观看网站| 美女国产高潮福利片在线看| 国产精品久久久久久精品古装| 丝瓜视频免费看黄片| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品 国内视频| 欧美色视频一区免费| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 色尼玛亚洲综合影院| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 又黄又粗又硬又大视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 中文字幕制服av| avwww免费| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 久久久久久久午夜电影 | 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品久久视频播放| 在线观看日韩欧美| 亚洲avbb在线观看| 黄色a级毛片大全视频| 91九色精品人成在线观看| 激情在线观看视频在线高清 | 免费观看人在逋| 国产色视频综合| 99香蕉大伊视频| 首页视频小说图片口味搜索| 在线播放国产精品三级| 高潮久久久久久久久久久不卡| 咕卡用的链子| 757午夜福利合集在线观看| 不卡一级毛片| 国产一区有黄有色的免费视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美激情高清一区二区三区| 午夜福利在线观看吧| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 黄片播放在线免费| 咕卡用的链子| 亚洲专区国产一区二区| 黄色 视频免费看| 亚洲伊人色综图| 日韩欧美一区视频在线观看| 老司机影院毛片| 欧美日韩成人在线一区二区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 黄色怎么调成土黄色| 欧美精品亚洲一区二区| av中文乱码字幕在线| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 久久中文看片网| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 色94色欧美一区二区| 一级,二级,三级黄色视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 校园春色视频在线观看| 欧美大码av| 91九色精品人成在线观看| 悠悠久久av| 精品国产美女av久久久久小说| 最近最新中文字幕大全免费视频| x7x7x7水蜜桃| 午夜免费鲁丝| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 91成年电影在线观看| av福利片在线| 男女高潮啪啪啪动态图| 香蕉久久夜色| 亚洲全国av大片| 国产精品二区激情视频| 亚洲黑人精品在线| 精品国产一区二区久久| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 下体分泌物呈黄色| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产又色又爽无遮挡免费看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 老熟女久久久| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产91精品成人一区二区三区| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 大香蕉久久网| 日韩欧美免费精品| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 欧美激情高清一区二区三区| 91精品三级在线观看| 男女免费视频国产| a在线观看视频网站| 十分钟在线观看高清视频www| 一级毛片精品| 麻豆成人av在线观看| 国产成人系列免费观看| 精品乱码久久久久久99久播| 天天添夜夜摸| videosex国产| 日韩有码中文字幕| 女人被狂操c到高潮| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产高清videossex| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品高清国产在线一区| 成人精品一区二区免费| 成人影院久久| 黄色丝袜av网址大全| 成人黄色视频免费在线看| 久久这里只有精品19| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 丝袜在线中文字幕| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲 国产 在线| 国产在线观看jvid| 欧美日本中文国产一区发布| 叶爱在线成人免费视频播放| 一区二区三区精品91| x7x7x7水蜜桃| 国产99久久九九免费精品| 韩国av一区二区三区四区| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美 日韩 精品 国产| 国产精品久久久av美女十八| 老汉色av国产亚洲站长工具| 日韩视频一区二区在线观看| 1024视频免费在线观看| 国产单亲对白刺激| 一级毛片女人18水好多| 亚洲专区字幕在线| 亚洲三区欧美一区| 久久久国产欧美日韩av| 成年动漫av网址| 国产精品九九99| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 激情在线观看视频在线高清 | 久久久久久久精品吃奶| 一级片免费观看大全| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 啦啦啦在线免费观看视频4| 九色亚洲精品在线播放| 久久久精品免费免费高清| 国产免费现黄频在线看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 午夜福利视频在线观看免费| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 女人被狂操c到高潮| 国产高清国产精品国产三级| 精品国产国语对白av| 欧美日韩av久久| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 宅男免费午夜| 男女下面插进去视频免费观看| 女警被强在线播放| 国产亚洲欧美98| 窝窝影院91人妻| 激情在线观看视频在线高清 | 精品人妻在线不人妻| 一a级毛片在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 男女免费视频国产| 极品人妻少妇av视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 午夜免费成人在线视频| 亚洲男人天堂网一区| 51午夜福利影视在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 午夜老司机福利片| 精品久久久久久久久久免费视频 | 又大又爽又粗| 国产精品亚洲av一区麻豆| 看片在线看免费视频| 麻豆乱淫一区二区| 午夜影院日韩av| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 99久久综合精品五月天人人| 欧美久久黑人一区二区| 欧美精品亚洲一区二区| 国产精品影院久久| 日韩欧美三级三区| 久久久久久久久久久久大奶| 国产亚洲欧美98| 国产99久久九九免费精品| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久久久久久精品吃奶| 国产欧美日韩一区二区精品| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 脱女人内裤的视频| 757午夜福利合集在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 午夜免费成人在线视频| 久热这里只有精品99| 五月开心婷婷网| 十八禁人妻一区二区| 99久久综合精品五月天人人| 午夜福利影视在线免费观看| 久久久久久久国产电影| 丁香欧美五月| 丝袜美腿诱惑在线| 欧美日韩一级在线毛片| 国产男女内射视频| 精品久久久精品久久久| 激情视频va一区二区三区| 99re在线观看精品视频| 国产成人精品在线电影| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 多毛熟女@视频| 香蕉久久夜色| ponron亚洲| 免费在线观看完整版高清| 免费观看人在逋| 后天国语完整版免费观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 丰满迷人的少妇在线观看| 老司机在亚洲福利影院| 老熟妇仑乱视频hdxx| 两个人免费观看高清视频| 久久久久久久午夜电影 | 国产精品久久久av美女十八| 精品人妻在线不人妻| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲成国产人片在线观看| 国产1区2区3区精品| 国产视频一区二区在线看| www.自偷自拍.com| 亚洲精品美女久久av网站| 久久九九热精品免费| av天堂久久9| 麻豆成人av在线观看| 欧美黑人精品巨大| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产精品一区二区精品视频观看| 国产深夜福利视频在线观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产男女内射视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 两人在一起打扑克的视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美日韩瑟瑟在线播放| videos熟女内射| 99国产综合亚洲精品| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲午夜理论影院| 老司机亚洲免费影院| 乱人伦中国视频| a级片在线免费高清观看视频| av网站免费在线观看视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 99国产精品一区二区三区| 亚洲中文字幕日韩| 欧美在线黄色| 叶爱在线成人免费视频播放| 在线观看免费午夜福利视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 91九色精品人成在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 午夜福利,免费看| 这个男人来自地球电影免费观看| 欧美精品一区二区免费开放| 多毛熟女@视频| 亚洲av片天天在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 精品人妻在线不人妻| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 中文字幕精品免费在线观看视频| 午夜视频精品福利| 男女床上黄色一级片免费看| 69精品国产乱码久久久| 看免费av毛片| 国产一区二区三区视频了| 1024香蕉在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 久久久久久久国产电影| 欧美日本中文国产一区发布| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲精品av麻豆狂野| 老汉色∧v一级毛片| 十八禁网站免费在线| 一区在线观看完整版| 黄色怎么调成土黄色| 大型黄色视频在线免费观看| 美女高潮到喷水免费观看| 免费观看a级毛片全部| www.熟女人妻精品国产| 美女国产高潮福利片在线看| 大香蕉久久网| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲国产精品合色在线| 欧美大码av| 久热爱精品视频在线9| 男女床上黄色一级片免费看| 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美人与性动交α欧美软件| 日本精品一区二区三区蜜桃| 女警被强在线播放| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 丝袜美腿诱惑在线| 午夜免费鲁丝| 精品亚洲成国产av| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 淫妇啪啪啪对白视频| 波多野结衣av一区二区av| a在线观看视频网站| 成年人午夜在线观看视频| www.精华液| 久久久久久人人人人人| 国产男靠女视频免费网站| 国产欧美亚洲国产| 午夜老司机福利片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲一区中文字幕在线| 99在线人妻在线中文字幕 | 我的亚洲天堂| 午夜两性在线视频| 国产一区二区激情短视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 久久ye,这里只有精品| 热re99久久精品国产66热6| 天天添夜夜摸| e午夜精品久久久久久久| 97人妻天天添夜夜摸| 99久久人妻综合| 色94色欧美一区二区| 欧美丝袜亚洲另类 | 成在线人永久免费视频| 精品福利观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美性长视频在线观看| 精品电影一区二区在线| 亚洲av电影在线进入| 久久午夜亚洲精品久久| 丁香六月欧美| 亚洲精品中文字幕在线视频| 日本黄色日本黄色录像| 很黄的视频免费| 亚洲一区二区三区不卡视频| 午夜福利欧美成人| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产精品一区二区在线不卡| 麻豆成人av在线观看| 91精品三级在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 母亲3免费完整高清在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产一卡二卡三卡精品| 一级片免费观看大全| 看黄色毛片网站| 18禁观看日本| а√天堂www在线а√下载 | 亚洲av片天天在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 高清黄色对白视频在线免费看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久热在线av| 国产日韩欧美亚洲二区| 黄频高清免费视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 99国产精品免费福利视频| 成人国语在线视频| 国产精品免费视频内射| 成人免费观看视频高清| 成人18禁在线播放| 精品电影一区二区在线| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久久久精品国产欧美久久久| 少妇粗大呻吟视频| 国产成人精品久久二区二区91| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 飞空精品影院首页| 成在线人永久免费视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产精品久久久av美女十八| 久99久视频精品免费| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产不卡一卡二| 欧美色视频一区免费| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲成a人片在线一区二区| 九色亚洲精品在线播放| 国产高清激情床上av| 欧美日韩一级在线毛片| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久国产精品大桥未久av| 黄色丝袜av网址大全| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 免费人成视频x8x8入口观看| 在线观看免费高清a一片| 18禁观看日本| 夫妻午夜视频| 啦啦啦免费观看视频1| 热99re8久久精品国产| 一边摸一边做爽爽视频免费| 91av网站免费观看| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产免费av片在线观看野外av| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲三区欧美一区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 91麻豆av在线| 午夜两性在线视频| 99热只有精品国产| 国产激情久久老熟女| 亚洲成人免费电影在线观看| av网站免费在线观看视频| 91老司机精品| 婷婷成人精品国产| 久久香蕉激情| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 午夜激情av网站| 久久亚洲精品不卡| 国产伦人伦偷精品视频| 99精品在免费线老司机午夜| 波多野结衣av一区二区av| 大型av网站在线播放| 亚洲 欧美一区二区三区| 乱人伦中国视频| 一区在线观看完整版| 在线国产一区二区在线| 欧美激情极品国产一区二区三区| 午夜老司机福利片| 9色porny在线观看| 91九色精品人成在线观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 美女视频免费永久观看网站| 成年人黄色毛片网站| 国产亚洲精品一区二区www | 天堂√8在线中文| 大香蕉久久成人网| 多毛熟女@视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 中文字幕色久视频| 亚洲 国产 在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 丝袜美足系列| 国产一区二区激情短视频| 国产人伦9x9x在线观看| 国产在线观看jvid| 亚洲五月天丁香| 在线国产一区二区在线| 午夜福利一区二区在线看| 精品久久蜜臀av无| 色老头精品视频在线观看| 在线免费观看的www视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 大型av网站在线播放| xxxhd国产人妻xxx| 午夜免费观看网址| 亚洲成国产人片在线观看| 飞空精品影院首页| bbb黄色大片| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久人妻av系列| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 精品国产一区二区久久| 亚洲成人免费av在线播放| 大香蕉久久成人网| 丝袜在线中文字幕| 91av网站免费观看| 最新美女视频免费是黄的| videos熟女内射| 大码成人一级视频| 久久久久久久国产电影| 在线观看免费日韩欧美大片| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲情色 制服丝袜| 午夜福利视频在线观看免费| bbb黄色大片| 国产亚洲精品久久久久久毛片 |