上調(diào)miR-24對(duì)急性肺損傷幼齡大鼠炎癥反應(yīng)的影響及作用機(jī)制

趙 瑜，岳彩虹，曹海麗，劉瑞敏

(1. 開(kāi)封市兒童醫(yī)院呼吸科，河南開(kāi)封 475000；2. 河南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，河南開(kāi)封 475004)

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)指由膿毒癥、再灌注損傷、失血性休克、煙霧及有毒氣體吸入等因素引起的急性進(jìn)行性呼吸衰竭[1]，是幼兒出現(xiàn)急性呼吸衰竭癥狀的主要原因[2]。由于缺乏自我保護(hù)能力及意識(shí)，幼兒ALI發(fā)病率較高，而ALI可進(jìn)一步發(fā)展成為急性呼吸窘迫綜合征，患兒病死率接近50%[3]。現(xiàn)階段，臨床治療ALI多用呼吸支持療法配合鎮(zhèn)靜止痛藥，但不能從致病機(jī)理上阻止ALI的惡化。據(jù)報(bào)道，抑制ALI炎癥反應(yīng)可顯著減輕肺部病理?yè)p傷，阻止ALI的進(jìn)一步惡化[4]。研究表明，微小型RNA-24(microRNA-24, miR-24)可作為一類抗炎因子，顯著抑制炎癥因子產(chǎn)生并阻礙NF-κB信號(hào)通路的激活，從而減輕炎癥反應(yīng)引起的病理組織損傷[5-8]。由于目前還沒(méi)有關(guān)于miR-24對(duì)ALI作用機(jī)制的報(bào)道，因此，本文通過(guò)上調(diào)miR-24，對(duì)其在ALI中的作用及機(jī)制進(jìn)行了深入探究。

1 材料與方法

1.1 試劑脂多糖(LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher；HE染色試劑盒、Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒及BCA試劑盒購(gòu)自上海碧云天；磷酸化核因子κB p65(nuclear factor κB p65, NF-κB p65)、磷酸化核因子κB抑制蛋白(phosphorylation inhibitor of NF-κB, p-IκBα)及IκBα激酶(IκBα kinase, p-IKK)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz，實(shí)驗(yàn)二抗購(gòu)自北京中杉金橋；PCR引物利用Primer 3網(wǎng)站設(shè)計(jì)，購(gòu)自北京六合華大；胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Corning；青霉素、鏈霉素購(gòu)自美國(guó)BI；DMEM/F-12+GlutaMAX培養(yǎng)基、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor, TNF-α)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、IL-1α和IL-1β ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invirtrogen。

1.2 幼齡大鼠分組及模型建立將幼齡大鼠(新生3～8 d)分為Control、ALI、ALI+miR-24 mimic mock及ALI+miR-24 mimic組，每組20只。ALI組大鼠腹腔注射LPS(3 mg/kg)建立ALI模型，ALI+miR-24 mimic mock及ALI+miR-24 mimic組大鼠建立ALI模型后，分別從尾靜脈注射miR-24 mimic mock及miR-24 mimic。miR-24 mimic mock是將miR-24 mimic基因隨機(jī)打亂后的序列，不與任何基因同源。Control組為空白對(duì)照，以等量生理鹽水替代LPS及miRNA進(jìn)行處理。將各組大鼠飼養(yǎng)7 d后處死，并收集大鼠外周血及肺組織。稱量右肺干濕重，并對(duì)肺干濕重比進(jìn)行計(jì)算。石蠟包埋肺組織，用于后期檢測(cè)。

1.3 HE染色石蠟切片脫蠟，用蘇木精染色10 min，PBS洗滌3次，伊紅復(fù)染2 min，切片脫水后封片。于顯微鏡下觀察，細(xì)胞核為藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)為紅色。

1.4 Tunel檢測(cè)石蠟切片脫蠟修復(fù)，用內(nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉5 min，PBS洗滌3次，Tunel檢測(cè)液37 ℃避光孵育1 h。PBS洗滌3次，DAB顯色液避光顯色，蘇木精復(fù)染。于暗室顯微鏡觀察，凋亡細(xì)胞為棕色，正常細(xì)胞為藍(lán)色。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)1.2中各組大鼠肺組織研磨勻漿后，加入RIPA裂解，提取組織蛋白。BCA試劑盒對(duì)組織蛋白定量并調(diào)平濃度。取各組蛋白30 μg，SDS-PAGE分離蛋白，半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封膜2 h，1.1中一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗37 ℃孵育1 h，曝光顯色，GAPDH為內(nèi)參。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)及分組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)提供。用含有150 mL/L FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM/F-12+GlutaMAX培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)箱條件為37 ℃、50 mL/L CO2，次日換液，細(xì)胞融合率達(dá)到85%以上時(shí)，以1×104/mL的濃度進(jìn)行傳代。

NR8383細(xì)胞分為Control、LPS、LPS+miR-24 mimic、LPS+pcDNA-IL-1α(pc-IL-1α)及LPS+miR-24 mimic+pc-IL-1α組。LPS組巨噬細(xì)胞利用1 μg/mL的LPS處理，LPS+miR-24 mimic、LPS+pc-IL-1α及LPS+miR-24 mimic+pc-IL-1α組細(xì)胞經(jīng)LPS處理后，分別或同時(shí)用miR-24 mimic及pc-IL-1α轉(zhuǎn)染，Control組細(xì)胞則加入等量空載。轉(zhuǎn)染步驟參考轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)，6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)生物信息學(xué)分析miR-24與IL-1α的連續(xù)結(jié)合片段，PCR擴(kuò)增將片段插入熒光素酶報(bào)告載體，構(gòu)建野生型IL-1α質(zhì)粒(IL-1α wt)。突變連續(xù)結(jié)合片段的核苷酸位點(diǎn)，構(gòu)建突變型IL-1α質(zhì)粒(IL-1α mut)。將miR-24 mimic與IL-1α wt或IL-1α mut共同轉(zhuǎn)染到NR8383細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.8 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)1.2中各組大鼠肺組織勻漿及1.6中各組細(xì)胞用Trizol進(jìn)行裂解，于通風(fēng)櫥中進(jìn)行總RNA抽提。定量分析后，取等量RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行定量并分析結(jié)果。結(jié)果計(jì)算方法：對(duì)照組2ΔCt平均值設(shè)為基準(zhǔn)1，實(shí)驗(yàn)組2ΔCt平均值與對(duì)照組2ΔCt平均值相比得到的2ΔΔCt值為mRNA的相對(duì)變化倍數(shù)。

1.9 ELISA檢測(cè)1.2中各組大鼠外周血清及1.6中各組細(xì)胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β濃度測(cè)定步驟參考Invirtrogen ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)。避光顯色后，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組樣品A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品曲線公式計(jì)算各樣品A值對(duì)應(yīng)的蛋白濃度。

2 結(jié) 果

2.1 ALI及miR-24 mimic對(duì)幼齡大鼠肺組織中miR-24的影響與Control組比較，miR-24在ALI幼齡大鼠肺組織中的mRNA降低(P<0.01)。與ALI組比較，ALI+miR-24 mimic mock組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ALI+miR-24 mimic組中miR-24的mRNA表達(dá)升高(P<0.01，圖1)。

圖1 各組中miR-24的mRNA水平

Fig.1 The mRNA level of miR-24 in each group (n=6)

與Control組比較，**P<0.01；與ALI組比較，##P<0.01。

2.2 miR-24 mimic對(duì)ALI幼齡大鼠肺病理?yè)p傷的影響HE染色可見(jiàn)Control組幼齡大鼠肺泡形態(tài)規(guī)則、清晰且結(jié)構(gòu)完整。與Control組比較，ALI組幼齡大鼠肺泡結(jié)構(gòu)雜亂，大量炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞充滿肺泡腔中。與ALI組比較，ALI+miR-24 mimic mock組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ALI+miR-24 mimic組中肺泡形態(tài)較為規(guī)則，炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞減少(圖2)。

圖2 各組幼齡大鼠肺病理變化

Fig.2 The pathologic change of lung tissue in the infant rats of each group (×200,n=6)

2.3 miR-24 mimic對(duì)ALI幼齡大鼠肺水腫的作用與Control組比較，ALI組幼齡大鼠肺干濕重比值增大(P<0.01)。與ALI組比較，ALI+miR-24 mimic mock組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ALI+miR-24 mimic組肺干濕重比值減小(P<0.01，圖3)。

圖3 各組幼齡大鼠肺干濕重比值

Fig.3 The ratio of lung wet/dry weight in the infant rats of each group (n=6)

與Control組比較，**P<0.01；與ALI組比較，##P<0.01。

2.4 miR-24 mimic對(duì)ALI幼齡大鼠肺組織細(xì)胞凋亡的影響與Control組比較，ALI組幼齡大鼠肺組織凋亡細(xì)胞百分比升高(P<0.01)。與ALI組比較，ALI+miR-24 mimic mock組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ALI+miR-24 mimic組凋亡細(xì)胞百分比降低(P<0.01，圖4)。

2.5 miR-24 mimic對(duì)ALI幼齡大鼠炎癥反應(yīng)的作用與Control組比較，ALI組幼齡大鼠外周血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的水平升高(P<0.01)。與ALI組比較，ALI+miR-24 mimic mock組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ALI+miR-24 mimic組中TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的水平降低(P<0.01，圖5)。

2.6 miR-24 mimic對(duì)ALI幼齡大鼠肺組織中NF-κB信號(hào)通路的影響與Control組比較，ALI組幼齡大鼠肺組織中p-IKK、p-IκBα及NF-κB p65的表達(dá)增多(P<0.01)。與ALI組比較，ALI+miR-24 mimic mock組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ALI+miR-24 mimic組中p-IKK、p-IκBα及NF-κB p65的表達(dá)減少(P<0.01，圖6)。

圖4 各組幼齡大鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況Fig.4 The apoptosis level of lung tissue in the infant rats of each group (n=6, ×400)與Control組比較,??P<0.01;與ALI組比較,##P<0.01。

圖5 各組幼齡大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的水平比較

Fig.5 The serum concentrations of TNF-α, IL-6, IL-1α and IL-1β in the infant rats of each group (n=6)

與Control組比較，**P<0.01；與ALI組比較，##P<0.01。

2.7 LPS及miR-24 mimic對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中miR-24的影響與Control組比較，miR-24在經(jīng)LPS處理大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中的mRNA水平降低(P<0.01)。與LPS組比較，LPS+miR-24 mimic mock組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，LPS+miR-24 mimic組中miR-24的mRNA水平升高(P<0.01，圖7)。

2.8 miR-24與IL-1α的靶向關(guān)系生物信息預(yù)測(cè)miR-24與IL-1α之間存在連續(xù)結(jié)合片段，同時(shí)，miR-24 mimic可降低IL-1α wt的熒光素酶活性(P<0.01，圖8)，而對(duì)連續(xù)結(jié)合片段位點(diǎn)突變后的IL-1α mut沒(méi)有影響。

2.9 miR-24 mimic及pc-IL-1α對(duì)經(jīng)LPS處理大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中炎癥反應(yīng)的作用與Control組比較，LPS組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的水平升高(P<0.01)。與LPS組比較，LPS+miR-24 mimic組中TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的水平降低，LPS+pc-IL-1α組中TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的水平升高(P<0.01，圖9)。與LPS+miR-24 mimic組比較，LPS+miR-24 mimic+pc-IL-1α組中TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的水平升高。

圖6 各組幼齡大鼠肺組織中p-IKK、p-IκBα及NF-κB p65的表達(dá)

Fig.6 The expression of p-IKK, p-IκBα and NF-κB p65 in lung tissue of the infant rats in each group (n=6)

與Control組比較，**P<0.01；與ALI組比較，##P<0.01。

圖7 各組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中miR-24的mRNA水平比較

Fig.7 The mRNA level of miR-24 in the rat alveolar macrophages of each group (n=6)

與Control組比較，**P<0.01；與LPS組比較，##P<0.01。

3 討 論

miR-24是一類多功能調(diào)節(jié)因子。據(jù)報(bào)道，miR-24具有抗凋亡作用，可在急性肝衰竭中抑制肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生[9]；具有抑癌作用，可在骨肉瘤中顯著抑制癌細(xì)胞侵襲及遷移[10]；具有抗炎作用，如在血管平滑肌細(xì)胞中，miR-24可通過(guò)阻礙NF-κB信號(hào)通路及降低炎癥因子TNF-α及IL-6表達(dá)水平，減輕糖尿病患者的血管病變[5]；在軟骨組織中，miR-24可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)改善模型大鼠骨關(guān)節(jié)炎組織損傷[6]；在巨噬細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miR-24可抑制金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生[8]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，ALI可引起肺組織產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，減輕炎癥反應(yīng)可改善ALI造成的肺部病理?yè)p傷[4]。在ALI中，miR-24是否具有抗炎作用還有待進(jìn)一步的研究。因此，本文通過(guò)上調(diào)miR-24，對(duì)其在ALI中的作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究。本研究首先檢測(cè)了miR-24在正常肺組織和ALI幼齡大鼠肺組織、正常大鼠肺泡巨噬細(xì)胞和經(jīng)LPS處理大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中的mRNA水平。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的重要組分，常被用于ALI模型的建立，可誘導(dǎo)肺組織及細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-24在ALI幼齡大鼠肺組織及LPS處理大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中的mRNA水平降低，提示miR-24下調(diào)與ALI發(fā)生有關(guān)。

圖8 miR-24與IL-1α的靶向關(guān)系

Fig.8 The target relationship between miR-24 and IL-1α (n=6)

與IL-1α wt組相比，**P<0.01。

圖9 各組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞上清中的TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β水平比較

Fig.9 The concentrations of TNF-α, IL-6, IL-1α and IL-1β in the rat alveolar macrophage supernatant of each group (n=6)

與Control組相比，**P<0.01；與LPS組相比，##P<0.01；與LPS+miR-24 mimic組相比，&&P<0.01。

ALI可引起肺泡水腫、肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及組織細(xì)胞大量凋亡，抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及抵抗細(xì)胞凋亡可減輕ALI引起的組織損傷[12]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-24具有抗炎作用，如在糖尿病患者血管病變中，miR-24可通過(guò)阻礙血管平滑肌細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的激活及抑制炎癥因子產(chǎn)生，減輕血管組織炎性浸潤(rùn)現(xiàn)象[5]；同時(shí)，miR-24具有抗凋亡作用，如在急性肝衰竭中，提高miR-24表達(dá)水平可降低肝細(xì)胞凋亡[9]；在胃癌細(xì)胞中，miR-24可通過(guò)抑制促凋亡蛋白表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖并阻礙細(xì)胞凋亡的發(fā)生[13]。本研究利用miR-24 mimic上調(diào)miR-24后發(fā)現(xiàn)，miR-24可減少ALI模型幼齡大鼠肺泡內(nèi)的炎性細(xì)胞，降低肺干濕重比值及肺組織凋亡細(xì)胞百分比。同時(shí)，miR-24 mimic還可降低ALI幼齡大鼠血清及經(jīng)LPS處理大鼠肺泡巨噬細(xì)胞上清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的濃度。TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β均為炎癥因子，可誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞及呼吸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎性趨化因子，刺激白細(xì)胞及薄壁細(xì)胞分泌黏附分子，促進(jìn)肺組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生及發(fā)展[14]。同時(shí)，TNF-α和IL-1β可刺激其他細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路過(guò)度激活，進(jìn)一步推進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)展進(jìn)程[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，miR-24可減輕ALI導(dǎo)致的肺泡水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肺組織細(xì)胞凋亡。

NF-κB信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在ALI中，NF-κB信號(hào)通路被高度激活，并促進(jìn)肺部組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生[16]。有報(bào)道表明，miR-24有阻礙NF-κB核位移及其與DNA結(jié)合的作用[5]。在NF-κB信號(hào)通路激活過(guò)程中，需要由細(xì)胞外信號(hào)刺激IκBα激酶IKK活化為p-IKK，p-IKK磷酸化IκBα，使NF-κB p65從無(wú)活性的復(fù)合體中分離出來(lái)，位移至細(xì)胞核，從而誘導(dǎo)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[17-18]。本文研究發(fā)現(xiàn)，miR-24可減少ALI幼齡大鼠肺組織中p-IKK、p-IκBα及NF-κB p65的表達(dá)，說(shuō)明miR-24可抑制ALI中NF-κB信號(hào)通路的激活，提示miR-24可能通過(guò)此途徑抑制ALI幼齡大鼠肺組織炎癥反應(yīng)。

IL-1α是IL-1存在形式之一，在組織炎癥反應(yīng)及宿主早期固有免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[19]。IL-1α具有雙重作用，除了通過(guò)與細(xì)胞表面受體結(jié)合發(fā)揮功能外，因其本身N段具有核定位位點(diǎn)，IL-1α還能直接調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[20]。研究表明，IL-1α可促進(jìn)IL-1R1依賴性促炎性因子的轉(zhuǎn)錄[21]。在肺組織中，IL-1α可在機(jī)體受到細(xì)菌病毒感染、吸入性損傷及氧化應(yīng)激的條件下被應(yīng)激及壞死細(xì)胞釋放，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的發(fā)生[22-25]。本研究利用生物信息預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-24-3p與IL-1α之間存在連續(xù)結(jié)合片段，通過(guò)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明，miR-24-3p可靶向下調(diào)IL-1α。此外，研究結(jié)果表明，miR-24 mimic可降低經(jīng)LPS處理大鼠肺泡巨噬細(xì)胞上清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的濃度，而pc-IL-1α可升高這些炎癥因子，并減弱miR-24 mimic對(duì)炎癥因子的抑制作用，這提示miR-24可通過(guò)靶向下調(diào)IL-1α抑制ALI引起的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，miR-24在ALI幼齡大鼠肺組織及LPS處理大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中的mRNA水平降低，miR-24 mimic可上調(diào)miR-24，并減輕ALI導(dǎo)致的肺泡水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥因子高度表達(dá)及肺組織細(xì)胞凋亡。miR-24可抑制ALI中NF-κB信號(hào)通路的過(guò)度激活，同時(shí)靶向下調(diào)IL-1α。研究結(jié)果提示，miR-24可通過(guò)這兩種機(jī)制抑制ALI引起的炎癥反應(yīng)，為ALI治療提供新的思路。