赤芍總苷對(duì)局灶性腦梗死大鼠腦組織Notch信號(hào)通路的影響

謝兵兵，劉麗娟，盧寶全，韓富紅，蔡梅芝，王丹丹，劉志輝，張艷紅

(唐山市工人醫(yī)院，河北唐山 063000)

赤芍為芍藥科植物，主要活性成分為赤芍總苷，赤芍總苷具有多種生物活性，尤其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的藥理作用，可以鎮(zhèn)痛、改善神經(jīng)突觸可塑性損傷等。大量研究顯示赤芍總苷對(duì)腦缺血損傷有明顯的保護(hù)作用，且赤芍總苷的神經(jīng)保護(hù)作用也已在神經(jīng)病理學(xué)的動(dòng)物模型中得到證實(shí)[1-2]，但有關(guān)其作用機(jī)制的研究較少。Notch信號(hào)通路在進(jìn)化過程中是高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與神經(jīng)前體細(xì)胞自我更新能力的維持、增殖、分化與凋亡過程，局灶性腦梗死大鼠腦組織的Notch信號(hào)通路處于活化狀態(tài)，該通路的活化程度與腦梗死的預(yù)后緊密相關(guān)[3-4]。文獻(xiàn)報(bào)道赤芍總苷能夠通過下調(diào)Notch信號(hào)通路從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[5]，而赤芍總苷對(duì)局灶性腦梗死大鼠腦組織Notch信號(hào)通路是否存在干預(yù)作用進(jìn)而治療大鼠的局灶性腦梗死，目前尚鮮有報(bào)道，本課題就此進(jìn)行了研究，現(xiàn)將結(jié)果匯報(bào)如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 受試動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量(180±20)g，雄性，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011]。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器小鼠抗大鼠NICD、兔抗Hes1、兔抗Hes5和β-actin均購自美國Chemicon公司；免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司；Trizol總RNA提取試劑(武漢天源生物技術(shù)有限公司)；SpectraMax i3x 多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)；冰凍切片機(jī)(德國Leica公司)；BX53型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；手術(shù)器械；動(dòng)物手術(shù)臺(tái)；天平。

1.3 方法

1.3.1腦卒中大鼠模型的制備 戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射全麻大鼠，大鼠全麻后置于操作臺(tái)，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈。結(jié)扎頸外動(dòng)脈及右側(cè)頸總動(dòng)脈近心端。在右側(cè)頸總動(dòng)脈近分叉處插入備用魚線，將栓線送至大腦中動(dòng)脈分叉處，頸外動(dòng)脈與頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處為起點(diǎn)，進(jìn)線約18.5 mm，栓線尾端留于皮膚外，栓塞1.5 h后抽線實(shí)現(xiàn)再灌注。以動(dòng)物清醒后爬行時(shí)右轉(zhuǎn)圈，提尾時(shí)右前肢內(nèi)收屈曲為入選標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組操作同上，僅暴露各組血管，不進(jìn)行線栓插入。術(shù)后5 h采用Berderson評(píng)分評(píng)價(jià)存活大鼠的行為表現(xiàn)，評(píng)分2～4分提示造模成功。

1.3.2分組和給藥 將“1.3.1”項(xiàng)下造模成功的腦卒中大鼠分為5組，分別為模型組、赤芍總苷低劑量組、赤芍總苷中劑量組、赤芍總苷高劑量組和尼莫地平組，選擇假手術(shù)組大鼠為對(duì)照組，每組20只。對(duì)照組和模型組給予蒸餾水，赤芍總苷各劑量組分別給予灌胃赤芍總苷(由我院制劑科提供)5、10和20 mg/kg，尼莫地平組灌胃尼莫地平2 g/kg(亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：H14022821，規(guī)格20 mg/片)，連續(xù)給藥20 d。

1.3.3體質(zhì)量測(cè)定 記錄各組大鼠給藥后的體質(zhì)量變化，進(jìn)行組間比較。

1.3.4各組大鼠腦含水量及腦梗死大小的測(cè)定 給藥結(jié)束后，將大鼠安樂處死，小心取腦，每組取10只大鼠的大腦，沿冠狀位切成2 mm的切片，置于20 g/L 2，3，5-氯化三苯基四氮唑浸泡30 min，使用NIH Image J軟件測(cè)定大腦梗死面積占皮層面積的百分比，按以下公式計(jì)算腦含水量，腦含水量=(濕重-干重)/濕重。

1.3.5Western blot檢測(cè)NICD、Hes1和Hes5的蛋白表達(dá) 給藥結(jié)束，每組5只大鼠，取大鼠半暗帶腦組織，稱重置于勻漿器，以1 mL∶100 mg加入預(yù)冷的組織細(xì)胞裂解液(Lysis Buffer)、5 μL磷酸酶抑制劑、5 μL蛋白酶抑制劑和5 μL PMFS，研磨均勻，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，留上清，采用BCA法蛋白定量。加SDS loading buffer煮沸，置于-70 ℃冰箱備用。SDS-PAGE電泳每孔加樣40 μg，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉1 h。Notch1 NICD一抗(1∶800)、Hes1(1∶500)、Hes5(1∶800)與內(nèi)參β-actin(1∶200)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶4 000)室溫孵育60 min，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光行條帶灰度分析。NICD、Hes1和Hes5抗體均購自Santa Cruz公司。

1.3.6RT-PCR檢測(cè)Hes1和Hes5 mRNA表達(dá) 給藥結(jié)束，每組5只大鼠，取大腦半暗區(qū)組織，冰上勻漿。于4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取上清加等體積的異丙醇，加入乙醇離心，棄乙醇，干燥沉淀，加Rnase-free溶解，采用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度。RT-PCR采用SYSB Premix Ex TaqTM進(jìn)行。電腦自動(dòng)分析熒光信號(hào)，轉(zhuǎn)換為目的基因拷貝數(shù)與CT值，GAPDH為內(nèi)參，引物序列可見表1。

表1 各基因引物序列

Tab.1 Gene sequences of primer

基因引物序列Hes1上游:5′-AAAGACGGCCTCTGAGCAC-3′下游:5′-GGTGCTTCACAGTCATTTCCA-3′Hes5上游:5′-GAAGGCCGACATCCTGGAGA-3′下游:5′-ACCAGGAGTAGCCCTCGCTGT-3′GAPDH上游:5′-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′下游:5′-GCGCCCAATACGACCAAATCC-3′

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，符合正態(tài)分布的資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的體質(zhì)量、腦含水量及梗死面積的比較

體質(zhì)量、腦含水量及梗死面積數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。各組大鼠給藥前的體質(zhì)量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后，與對(duì)照組相比，模型組體質(zhì)量降低(P<0.05)；與模型組比，赤芍總苷各組及尼莫地平組體質(zhì)量有不同程度增高(表2)，赤芍總苷各組體質(zhì)量呈劑量依賴性趨勢(shì)。

表2 各組大鼠的體質(zhì)量、腦含水量及梗死面積的比較

Tab.2 Comparison of rat weight, brain water content and infarct size in each group

組別體質(zhì)量(g, n=20)治療前治療后腦梗死百分比(%, n=10)腦含水量(%, n=10)對(duì)照組186.50±12.59244.32±13.510.00±0.0012.81±1.61模型組189.51±15.22192.51±13.90?29.42±4.21?35.60±5.62?赤芍總苷低劑量187.54±13.42200.61±13.4221.61±3.80#30.42±4.21#赤芍總苷中劑量182.40±16.21216.82±13.83#19.52±3.81#24.60±3.82#△赤芍總苷高劑量186.53±14.52225.81±12.92#△17.30±3.41#△23.62±3.12#△尼莫地平184.91±13.50229.61±13.10#△16.82±3.00#△22.10±2.43#△F0.56640.78283.93144.354P0.726<0.001<0.001<0.001

與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與赤芍總苷低劑量組相比，△P<0.05。

2.2 各組大鼠腦組織NICD、Hes1和Hes5蛋白的表達(dá)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，NICD、Hes1和Hes5蛋白表達(dá)符合正態(tài)分布。與對(duì)照組比，模型組NICD、Hes1和Hes5蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05)；與模型組比，赤芍總苷各組及尼莫地平組NICD、Hes1和Hes5均有不同程度降低(圖1)，赤芍總苷各組NICD、Hes1和Hes5變化呈劑量依賴性趨勢(shì)。

圖1 各組大鼠腦組織NICD、Hes1和Hes5蛋白的表達(dá)與比較

Fig.1 Expressions of NICD, Hes1 and Hes5 in rat brain tissue of each group

與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與赤芍總苷低劑量組相比，△P<0.05。

2.3 各組大鼠腦組織的Hes1和Hes5 mRNA表達(dá)情況經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，Hes1和Hes5 mRNA表達(dá)符合正態(tài)分布。與對(duì)照組比，模型組Hes1和Hes5 mRNA明顯增高(P<0.05)；與模型組比，赤芍總苷各組及尼莫地平組Hes1和Hes5 mRNA均有不同程度降低(圖2)，赤芍總苷各組Hes1和Hes5 mRNA變化呈劑量依賴性趨勢(shì)。

圖2 各組大鼠腦組織的Hes1和Hes5 mRNA的表達(dá)與比較

Fig.2 Expressions of Hes1 and Hes5 mRNA in rat brain tissue of each group

模型組與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與赤芍總苷低劑量組相比，△P<0.05。

3 討 論

赤芍為毛茛科植物芍藥(Paeonia Lacti Flora Pall)或川赤芍(Paeonia Veitchii Lynch)的干燥根，是中醫(yī)常用于治療心腦血管疾病的藥物。赤芍總苷是赤芍的有效成分。研究顯示，赤芍總苷具有較強(qiáng)的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)，進(jìn)而抑制腦缺血腦水腫的發(fā)生[6]，但該效應(yīng)的機(jī)制研究較少。

大量研究顯示，Notch信號(hào)通路與腦缺血再灌注損傷過程緊密相關(guān)，成熟大腦缺血后，腦室下區(qū)(SVZ)的增殖細(xì)胞Notch信號(hào)高表達(dá)，Notch 信號(hào)通路活性增強(qiáng)可明顯增加缺血新生血管數(shù)量及血液灌注量，促進(jìn)缺血性損傷[7]，同時(shí)也可調(diào)節(jié)缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷，γ-分泌酶被激活，釋放下游分子NICD、Hes1和Hes5。NICD、Hes1和Hes5表達(dá)增高提示缺血后膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間存在細(xì)胞間通訊，誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡，通過調(diào)節(jié)NF-κB、凋亡前體蛋白并加重神經(jīng)元凋亡。即使短暫性腦缺血，急性期海馬CA1區(qū)的Notch信號(hào)通路被活化，NICD水平增高，神經(jīng)祖細(xì)胞數(shù)目增加，Notch信號(hào)通路被抑制，神經(jīng)祖細(xì)胞的分化明顯增加[8-9]。局灶性腦缺血后，通過-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號(hào)的活性可以起到神經(jīng)保護(hù)作用和抗炎作用[10-11]。本課題結(jié)果顯示，不同劑量的赤芍總苷可呈劑量依賴性地降低腦組織的NICD、Hes1和Hes5蛋白水平，同期也可以降低腦組織的Hes1和Hes5 mRNA水平。其機(jī)制有直接或間接兩種[12-13]：①含有赤芍的化濕行瘀清熱方可通過阻斷Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，機(jī)制尚不明確；②含有赤芍總苷的芍藥湯可抑制Notch1和Hes1 mRNA及蛋白表達(dá)調(diào)控Notch信號(hào)通路達(dá)到治療葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠；③赤芍總苷通過抑制NF-κB p65DNA結(jié)合活性及其下游VEGF基因的表達(dá)，抑制VEGF與其受體的作用，而Notch的失活狀態(tài)是受VEGF負(fù)反饋調(diào)節(jié)，達(dá)到降減及改善輕梗死炎癥反應(yīng)的效果。

本課題存在的不足：Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)腦缺血性腦損傷是有害還是保護(hù)仍存在爭(zhēng)議。本課題結(jié)果顯示，赤芍總苷可通過抑制局灶性腦梗死大鼠腦組織Notch信號(hào)通路而達(dá)到保護(hù)效果，但研究顯示抑制Notch1信號(hào)可降低腦室管膜下區(qū)增生的細(xì)胞，阻滯腦缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，可見Notch1信號(hào)可能在腦缺血神經(jīng)再生中起重要作用，因此，仍有必要從腦細(xì)胞神經(jīng)再生角度考察赤芍總苷對(duì)局灶性腦梗死的干預(yù)效果，為赤芍總苷的臨床應(yīng)用提供參考。

綜上所述，赤芍總苷可用于治療局灶性腦梗死，其機(jī)制可能與抑制腦組織Notch信號(hào)通路相關(guān)。