貴州苗藥方“四大血”對CIA大鼠滑膜血管增生的作用機制

袁桃花，黃宇鍵，李佳豪，曹 恒，吳昌學，吳 寧

(貴州醫(yī)科大學：1. 基礎醫(yī)學院；2. 臨床醫(yī)學院；3. 醫(yī)學分子生物學重點實驗室，貴州貴陽 550025)

類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以侵犯小關(guān)節(jié)滑膜并伴有炎癥的對稱性慢性自身免疫性疾病[1]，目前其發(fā)病機制尚不明確。多數(shù)RA患者關(guān)節(jié)組織都會形成血管翳癥狀，而血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR-2)作為促血管內(nèi)皮細胞分裂及增殖的重要因子，可介導滑膜組織中血管形成，增加微血管通透性，加重血管翳癥狀。RA作為一種炎癥性疾病，體內(nèi)促炎因子可激活磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphtidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/AKT)通路，促使VEGF、VEGFR-2表達上調(diào)[2-3]，從而加速血管形成，增加血管通透性，更利于炎癥因子釋放，造成惡性循環(huán)，加重病情。PI3K/AKT通路外蛋白人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)可使缺氧誘導因子-1α失活，同時抑制PI3K/AKT通路活化，降低 VEGF表達，延緩疾病惡化程度。

目前，臨床上對RA的治療主要靠抗風濕藥、糖皮質(zhì)激素等藥物改善病情[4]，但均存在一定的毒副作用，因此開發(fā)毒副作用小、療效較為顯著的新藥尤為必要。苗醫(yī)驗方“四大血”(SX)由苗藥黑骨藤、見血飛、五花血藤、雞血藤4種藤本藥材組成，作為貴州苗族地區(qū)治療RA的特有藥方，有治療氣血瘀阻等功效[5-6]。但目前SX仍處于經(jīng)驗用藥階段，且國內(nèi)相關(guān)研究較少。本課題組前期研究結(jié)果顯示，SX水煎液對RA的動物模型-佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠有明顯療效，可以減輕關(guān)節(jié)腫脹程度，抑制關(guān)節(jié)滑膜組織增生等臨床病理表現(xiàn)，且能下調(diào)腫瘤壞死因子-α、白細胞介素1-β等炎癥因子的表達[4-5]。膠原誘導關(guān)節(jié)炎大鼠(collagen induced arthritis in rats, CIA)在致炎后有血管翳表現(xiàn)，其發(fā)病機制與人RA極為相似，是目前研究RA的理想模型。本研究通過CIA檢測VEGF、VEGFR-2含量及PTEN/PI3K/AKT通路中相關(guān)蛋白的表達，結(jié)合病理組織切片，觀察SX對RA的療效，進一步闡述其治療機制，為SX臨床藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物與試劑 實驗動物：SD大鼠，42只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，合格證號[SCXK(渝)2007.005]。苗藥“四大血”由苗藥nangx dlob ghat(仰嗟嘎)、hsob hxangt(梭向)、ghab jongx bel sob xok(嘎龔布梭學)、vob mongb dlenb(萵蒙棱)4種藤本藥材組成，并由貴陽中醫(yī)學院苗醫(yī)藥教研室提供，并經(jīng)田振華副教授鑒定為雞血藤、五花血藤、見血飛、黑骨藤；雷公藤多苷片購自黃石飛云制藥公司，批號：20080301；不完全弗氏佐劑購自美國Sigma公司，批號：033K8933；大鼠VEGF定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑購自安徽巧伊生物技術(shù)有限公司；Pten抗體(A2B1)購自Santa Cruz公司；PI3K和AKT抗體均購自Cell Signaling公司；兔、鼠二抗購自Bioworld公司；PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.1.2主要儀器 水平電泳槽DYY-Ⅲ 31D，北京六一儀器廠；Quanity One凝膠成像分析系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司；DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗動物分組 將42只SD大鼠隨機分成“四大血”高劑量組(SX 40 g/kg組)、“四大血”中劑量組(SX 20 g/kg組)、“四大血”低劑量組(SX 10 g/kg組)，雷公藤多苷片對照組(GTW)、空白對照組(Nor)、模型組(Mod)，共6組，每組7只。

1.2.2CIA大鼠模型的構(gòu)建 取2 mg/mL牛Ⅱ型膠原適量在冰上與等量不完全弗氏佐劑混合，均勻充分乳化后，加一滴乳化劑于水中以不擴散為準，取乳化后的混合物200 μL于尾根部皮下注射免疫[7]，1周后以100 μL乳劑于尾根部皮下加強免疫1次。Nor、Mod對照組在尾根部皮下注射同量生理鹽水(NS)，總計2次免疫，通過關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index, AI)評分判定造模情況[8]。

1.2.3藥物的制備 取SX共2 000 g(五花血藤、雞血藤、見血飛、黑骨藤比例為15∶22∶15∶8)，加適量水煮3次(時間分別為1 h、30 min、30 min)，合并濃縮液500 mL為受試藥，濃度為4 kg/L(按生藥量計)，置于4 ℃冰箱備用(保存1周)。

1.2.4發(fā)病嚴重程度的觀察及檢測 ①大鼠關(guān)節(jié)癥狀表現(xiàn)。每日定期觀察大鼠情況，如紅腫、關(guān)節(jié)畸形等，拍照記錄[1]。并在初次注射乳化劑當天，觀察大鼠后足關(guān)節(jié)，之后隔7 d觀察1次，進行AI評分。AI評分標準：0分(無紅腫)；1分(關(guān)節(jié)有紅色斑點或輕度腫脹)；2分(關(guān)節(jié)病變中度紅腫)；3分(關(guān)節(jié)除中度紅腫外，伴有輕度功能障礙)；4分(關(guān)節(jié)重度紅腫，僵直甚至畸形，嚴重功能障礙)。其中達到2分及2分以上為造模成功。②關(guān)節(jié)足腫度。致炎前及自初次免疫時起，每周采用排水法測大鼠雙后足跖容積，測3次取均值，計算足趾腫脹度。腫脹度公式：ER(%)=(Va-Vb)/Vb×100%(其中Vb為造模前的容積，Va造模后的容積)。

1.2.5給藥方案 造模成功后2 d除Nor組及Mod組灌NS外，其余組藥物灌胃，GTW組和SX 40 g/kg組灌胃為40 g/kg，SX 20 g/kg組、SX 10 g/kg組分別為20 g/kg、10 g/kg(按生藥量計)，每日1次，連續(xù)21 d[6]。

1.2.6標本采集 于末次給藥次日用100 g/L水合氯醛對CIA大鼠進行麻醉，取心臟血之后麻醉處死大鼠，取各組大鼠炎性后腿，-80 ℃冰箱中備用。

1.2.7病理組織切片制備 操作流程：脫蠟→染色→水洗→分化→漂洗→脫水Ⅰ→復染→脫水Ⅱ→烤片→中性樹膠封片→顯微鏡下觀察。

1.2.8ELISA法測各組大鼠血清中VEGF的表達 操作步驟按大鼠VEGF檢測ELISA試劑盒的說明書進行，試驗結(jié)果判定以酶標儀的讀數(shù)為準。

1.2.9RT-PCR法檢測CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF及VEGFR-2 mRNA的含量 ①RT-PCR引物的設計合成。根據(jù)GenBank提供大鼠VEGF mRNA序列(AY702972)、VEGFR-2 mRNA序列(U93306.1)、GAPDH mRNA序列(NM_017008)。利用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計，所得序列用Primer-Blast驗證，確定其特異性。通過引物公司合成，設計的引物如下表(表1)。②標本制備及逆轉(zhuǎn)錄。按Trizol Reagent試劑盒提取總RNA，溶于DEPC水中(-80 ℃保存?zhèn)溆?。取上述RNA樣本1 μL于超微量紫外分光光度計上測RNA樣品A260與A280比值及其RNA濃度(ng/L)，比值為1.8～2.0，RNA無降解。之后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，將cDNA保存在-20 ℃冰箱備用。③實時熒光定量PCR。按照實時熒光定量PCR試劑盒處理反轉(zhuǎn)錄樣本后，進行樣本擴增，預變性，95 ℃ 5 min；循環(huán)反應，95 ℃ 10s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次；溶解曲線，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。用2-△△Ct計算法處理數(shù)據(jù)。

表1 各基因的引物序列

Tab.1 Oligonucleotide primers used for Real-time PCR

Gene類型ForwardReverseVEGF5′-CCTGGCTTTACTGCTGTACCT-3′5′-GCTGGTAGACGTCCATGAACT-3′VEGFR-25′-CCTTAGGTGCTTCCCCATATC-3′5′-GAGCCCGCATTCTCGTTC-3′GAPDH5′-GTGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′5′-GGTTCACACCCATCACAAACATG-3′

1.2.10Western blot檢測滑膜組織中PTEN、PI3K、AKT蛋白表達 取大鼠滑膜組織，液氮研磨，提取樣本，用BCA試劑盒測蛋白濃度。蛋白變性后取20 g進行上樣電泳，按200 mA、2 h條件進行轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂奶粉封閉過夜，孵育一抗(beta-actin；PTEN、AKT、PI3K抗體的稀釋比及孵育時間：1∶7 000，室溫2 h；1∶1 000，4 ℃過夜)，洗膜(每次10 min，洗3次)，孵育二抗(兔和鼠二抗的稀釋比分別為1∶1 000和1∶5 000，室溫脫色搖床緩慢搖動90 min)，加入洗滌液(1×TBST)進行洗膜，曝光顯影，凝膠成像儀上進行蛋白條帶檢測和灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 SX對CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹度及AI評分的影響

各組大鼠造模后，雙后肢基本全部出現(xiàn)不同程度的紅腫。根據(jù)AI評分和足腫度結(jié)果，各給藥組大鼠給藥后雙后肢膝、踝和趾間關(guān)節(jié)紅腫均逐漸減退。連續(xù)給藥2周后，相比于Mod組，SX 40 g/kg組、SX 20 g/kg足腫度下降(P<0.05)；到給藥3周后，SX組、GTW組均較Mod組減小，以SX 40 g/kg組和GTW組較為明顯(P<0.01)。給藥2周后，SX組AI評分低于Mod組(P<0.05，P<0.01)；給藥3周后，SX所有組評分均低于Mod組(P<0.01，表2、表3，圖1、圖2)。

2.2 組織病理學變化

2.2.1大鼠滑膜組織病理切片觀察 從切片中可見，Nor組足趾滑膜組織未見明顯的炎性細胞浸潤。Mod組真皮乳頭層和網(wǎng)狀層可見大量炎性細胞浸潤，纖維組織增生、水腫，偶見各層組織結(jié)構(gòu)紊亂，上皮組織破壞。GTW組炎性細胞明顯減少，浸潤程度減輕。SX 40 g/kg組織偶見極少量散在分布的炎性細胞，SX 20 g/kg組炎性細胞浸潤明顯下降，纖維組織增生水腫減輕，但SX 10 g/kg組仍可見較多炎性細胞浸潤、組織水腫(圖3)。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度

Fig.1 Degree of joint swelling in rats of each group

①Mod組；②Nor組；③ GTW組；④SX 40 g/kg組；⑤SX 20 g/kg組；⑥SX 10 g/kg組。

表2 SX對CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的影響

分組14d23d30d37dNor組0.16±0.110.11±0.080.12±0.030.14±0.11Mod組1.03±0.07#0.95±0.22#1.02±0.24#0.98±0.23#GTW組0.93±0.08#0.72±0.010.55±0.02?0.34±0.09?? SX 40g/kg組1.10±0.06#0.74±0.170.59±0.06?0.32±0.20??SX 20g/kg組1.12±0.10#0.79±0.300.71±0.110.46±0.05?SX 10g/kg組0.96±0.11#0.80±0.120.74±0.230.51±0.20?

與Nor組相比，#P<0.05；與Mod組相比，*P<0.05，**P<0.01。

表3 SX對CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分的影響

分組7d14d23d30d37dNor組0.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.00Mod組4.86±1.47##7.14±0.90##6.57±1.27##7.00±1.00##7.43±0.79##GTW組5.29±1.117.00±0.825.57±0.794.29±0.76??2.57±0.79??SX 40g/kg組4.86±0.96.86±1.006.86±0.695.29±1.11?2.71±1.60??SX 20g/kg組4.29±1.987.14±0.904.57±0.533.29±1.11??1.86±0.69??SX 10g/kg組5.42±0.987.29±0.766.14±0.695.29±0.76?3.57±1.27??

與Nor組相比，##P<0.01；與Mod組相比，*P<0.05，**P<0.01。

圖2 SX對CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹度及AI評分的影響

Fig.2 Effect of SX on joint swelling and arthritis index score of CIA rats (n=7)

與Nor組相比，##P<0.01。

圖3 各組大鼠組織病理學變化

Fig.3 Pathological tissue section of each group (×400)

①A、B、C、D、E、F依次代表Nor組、Mod組、GTW組、SX 40 g/kg組、SX 20 g/kg組、SX 10 g/kg組。

2.2.2切片炎癥細胞計數(shù) 在400倍光鏡下用高清圖像采集系統(tǒng)隨機選取5個區(qū)域進行炎性細胞計數(shù)(每組5張切片)。與Mod組比較，SX組、GTW組炎性細胞浸潤數(shù)都出現(xiàn)明顯下降(P<0.01)。Nor組炎性細胞浸潤數(shù)明顯少于SX 10 g/kg組(P<0.01)。與GTW組相比，SX 40 g/kg組、SX 20 g/kg組炎性細胞浸潤數(shù)接近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；相比于Mod組，SX組大鼠足趾組織炎癥程度均有減輕的趨勢，尤其以SX 40 g/kg組、SX 20 g/kg組最為明顯(P<0.01，表4)。

2.3 對大鼠血清中VEGF含量的影響與Nor組相比，Mod組大鼠血清中VEGF含量明顯升高(P<0.01)；SX組及GTW治療組均比Mod組低(P<0.01)；SX 20 g/kg組、SX 10 g/kg組與GTW組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；SX 40 g/kg組比GTW組明顯升高(P<0.01)；SX各劑量組中VEGF含量未呈現(xiàn)出與灌胃濃度的反比關(guān)系(表5)。

表4 各組CIA大鼠足趾炎癥腫脹組織炎性細胞浸潤計數(shù)

組別炎性細胞數(shù)Nor組7.74±4.52??Mod組189.38±14.35GTW組28.92±13.01??SX 40g/kg組9.88±3.43??SX 20g/kg組41.46±13.03??SX 10g/kg組155.93±15.39??△△

與Mod組相比，**P<0.01；與Nor組相比，△△P<0.01。

表5 各組CIA大鼠血清VEGF含量

組別VEGF含量(pg/mL)Nor組50.55±8.62Mod組159.71±5.69##GTW組764.92±5.60??SX 40g/kg組110.05±39.20??△△SX 20g/kg組88.92±10.83??SX 10g/kg組85.64±10.41??

與Nor組相比，##P<0.01；與Mod組相比，**P<0.01；與GTW組相比，△△P<0.01。

2.4 SX對CIA大鼠滑膜關(guān)節(jié)組織VEGF、VEGFR-2 mRNA表達的影響給藥21 d，與Mod組比較，SX組VEGF mRNA含量均降低，其中SX 10 g/kg和SX 40 g/kg可下調(diào)VEGF mRNA的表達(P<0.01)。與Mod組相比，SX能不同程度地降低VEGFR-2 mRNA的表達(P<0.01)。與Nor組相比，SX組、GTW組的VEGF、VEGFR-2 mRNA的含量差異不大(P>0.05，圖4)。

圖4 SX對CIA大鼠滑膜組織VEGF、VEGRR-2 mRNA表達的影響

Fig.4 Effect of SX on the expressions of VEGF and VEGFR-2 mRNA in synovial tissue of CIA rats

與Mod組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.5 SX對CIA大鼠滑膜組織PTEN/PI3K/AKT通路中相關(guān)蛋白表達的影響給藥21 d后，與Nor組相比，Mod組PTEN表達量下調(diào)(P<0.01)。與Mod組相比，SX各劑量組能明顯上調(diào)(P<0.01，P<0.05)，SX 40 g/kg組和SX 20 g/kg組作用和GTW組相當(P>0.05)。與Nor組相比，Mod組PI3K蛋白表達量明顯上調(diào)(P<0.05)；與Mod組比較，SX 40 g/kg組、SX 20 g/kg下調(diào)(P<0.05)；SX 10 g/kg組與Mod組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而SX各劑量組和GTW組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Mod組AKT磷酸化水平相比于Nor組明顯升高(P<0.01)，而與Mod組相比，SX可以抑制AKT的磷酸化水平(P<0.01)，其與GTW組相比磷酸化水平相當，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖5、圖6)。

圖5 SX對CIA大鼠滑膜組織PTEN/PI3K/AKT通路蛋白的影響

Fig. 5 Effect of SX on PTEN/PI3K/AKT pathway protein in synovial tissue of CIA rats

①SX 40 g/kg組；②SX 20 g/kg組；③SX 10 g/kg組；④GTW組；⑤Mod組；⑥Nor組。

圖6 SX對CIA大鼠滑膜組織PTEN、PI3K、AKT蛋白表達的影響

Fig.6 Effects of SX on the expressions of PTEN, PI3K, and AKT protein in synovial tissue of CIA rats

與Nor組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Mod組比較，*P<0.05，**P<0.01；與GTW組比較，△P<0.05。

3 討 論

類風濕性關(guān)節(jié)炎屬難治愈疾病，其病理反應主要是炎癥、滑膜血管增生、軟骨及骨組織破壞等，過度增生的滑膜血管及大量炎性細胞會導致血管翳的形成[9]。在血管翳微環(huán)境中，血管通透性增加，更便于炎性細胞釋放，造成惡性循環(huán)，加重病情，增加治療難度。VEGF高表達能增加血管通透性，誘導骨髓內(nèi)的內(nèi)皮細胞活化，進而促進血管新生，加重血管翳癥狀。VEGFR-2作為VEGF家族中重要的血管因子受體，可加強VEGF活性；同時，活化的VEGFR-2可以激活PI3K-AKT途徑[10]，上調(diào)VEGF表達。在典型的PI3K/AKT激活通路中，AKT及其上游的3-磷脂肌醇依賴性蛋白激酶-1(PDK1)通過其PH結(jié)構(gòu)域與磷脂酰肌醇的相互作用募集到細胞膜，由PI3K產(chǎn)生P3，再通過PDK1激活T環(huán)中Thr308啟動AKT磷酸化[8]。PTEN作為負調(diào)控因子，具有多種功能，其脂質(zhì)磷酸酶活性可通過PI3K的D3位發(fā)生去磷酸化生成PIP2，進而阻礙PI3K對AKT的磷酸化作用，負調(diào)控PI3K/AKT信號通路介導的血管內(nèi)皮細胞活動[11]，下調(diào)VEGF及VEGFR-2的表達。

SX作為苗族地區(qū)治療RA的特有藥方，通過AI評分、關(guān)節(jié)腫脹度檢測和及病理組織檢查，發(fā)現(xiàn)SX能明顯改善CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹，減輕關(guān)節(jié)滑膜組織中炎性細胞浸潤。此外，SX能活化負調(diào)控因子PTEN及抑制PI3K、AKT蛋白的表達，下調(diào)VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA的表達，且VEGF蛋白與mRNA表達均下調(diào)。CIA模型大鼠滑膜組織中PTEN表達下調(diào)，表明炎癥環(huán)境能抑制PTEN的表達，從而激活PI3K/AKT通路。SX可通過上調(diào)PTEN的表達減弱PI3K/AKT的活化，抑制下游VEGF及VEGFR-2的表達，緩解滑膜血管新生和炎癥，從而發(fā)揮治療作用。

綜上所述，SX減輕血管翳及炎性癥狀與PTEN/PI3K/AKT、VEGF/VEGFR-2通路密切相關(guān)，提示SX具有重要的藥用價值。頁