雙相障礙患者腸道菌群相對(duì)豐度與臨床癥狀及認(rèn)知功能的相關(guān)性

賈 敏，王 崴，紀(jì) 翠，董 倩，馬青艷， 馮俊芹，范雅娟，朱 峰，馬現(xiàn)倉，高成閣

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院精神心理衛(wèi)生科，陜西西安 710061；2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西西安 710061)

雙相障礙(bipolar disorder, BD)是臨床上發(fā)病率較高的精神障礙，情感呈現(xiàn)異常高漲或低落狀態(tài)是其主要臨床特征?；颊咄瑫r(shí)產(chǎn)生的認(rèn)知功能損害已被公認(rèn)為雙相障礙重要的臨床特征[1-3]。在不同年齡段、雙相障礙的不同分型中及疾病的不同時(shí)期，均普遍存在[4-12]。本課題組在前期的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，雙相障礙急性發(fā)作期患者的腸道菌群多樣性增加，腸道菌群的構(gòu)成及豐度在不同等級(jí)上均發(fā)生改變[13]。由于認(rèn)知功能損害已成為雙相障礙的重要特征，因此，為進(jìn)一步探討雙相情感障礙患者腸道菌群的變化與臨床癥狀及認(rèn)知功能之間的關(guān)系，本研究將評(píng)估雙相障礙患者不同臨床相的認(rèn)知功能，測(cè)定雙相障礙患者腸道菌群的相對(duì)豐度，分析雙相障礙患者認(rèn)知功能與腸道菌群相對(duì)豐度的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象病例組：選取2016年4-12月于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院精神心理衛(wèi)生科住院的陜西關(guān)中地區(qū)的患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)MINI評(píng)估，符合ICD-10雙相障礙(躁狂相或抑郁相)診斷標(biāo)準(zhǔn)，入院前3個(gè)月未服用精神藥物；②15歲≤年齡<65歲；③近3個(gè)月連續(xù)服用抗生素≤3 d；④體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)為17.5～30.0 kg/m2；⑤飲食結(jié)構(gòu)基本相同，無特殊飲食習(xí)慣。排除標(biāo)準(zhǔn)：①現(xiàn)患心、肝、腎或胃腸道等軀體性疾??；②符合ICD-10中除雙相情感障礙以外的其他精神障礙的診斷標(biāo)準(zhǔn)；③精神疾病陽性家族史。對(duì)照組：選取與患者組同期來自同一地區(qū)的健康志愿者。入選標(biāo)準(zhǔn)：①15歲≤年齡<65歲；②近3個(gè)月連續(xù)服用抗生素治療不超過≤3 d；③BMI為17.5～30.0 kg/m2；④飲食結(jié)構(gòu)基本相同，無特殊飲食習(xí)慣。排除標(biāo)準(zhǔn)：①現(xiàn)患心、肝、腎或胃腸道等軀體性疾?。虎诜螴CD-10中任何精神障礙的診斷標(biāo)準(zhǔn)；③精神疾病陽性家族史。

本研究經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批件號(hào)：XJTU1AF2015LSL-079。所有受試者入組前均自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1一般資料收集 所有受試者入組當(dāng)天詳細(xì)詢問病史，并進(jìn)行體格檢查及精神檢查，收集一般臨床資料，包括性別、年齡、文化程度、身高、BMI、是否吸煙、飲酒習(xí)慣、近2周是否飲用乳制品等日常飲食習(xí)慣情況(其中乳制品在飲食習(xí)慣中對(duì)腸道菌群的影響最明顯)。

1.2.2量表評(píng)估 由1名有豐富臨床經(jīng)驗(yàn)的精神科主治醫(yī)師使用蒙哥馬利抑郁量表(Montgomery Asberg Depression Rating Scale, MADRS)、楊氏躁狂量表(Young Manic Rating Scale, YMRS)和MATRICS共識(shí)認(rèn)知成套測(cè)驗(yàn)(MATRICS Consensus Cognitive Battery, MCCB)對(duì)雙相障礙患者的臨床癥狀及認(rèn)知功能進(jìn)行評(píng)估，YMRS評(píng)分≥13分且MADRS<12分入躁狂組，MADRS≥22分且YMRS<6分入抑郁組。MCCB量表共包含9項(xiàng)測(cè)試[14]，評(píng)估6個(gè)神經(jīng)認(rèn)知領(lǐng)域和社會(huì)認(rèn)知領(lǐng)域。①處理速度：包括連線測(cè)驗(yàn)、符號(hào)編碼、范疇流暢；②注意性/警覺性：即持續(xù)操作測(cè)驗(yàn)；③工作記憶：空間廣度；④言語學(xué)習(xí)和記憶：霍普金斯詞語學(xué)習(xí)；⑤視覺學(xué)習(xí)和記憶：視覺空間記憶測(cè)試；⑥推理與問題解決能力：即迷宮測(cè)驗(yàn)；⑦社會(huì)認(rèn)知：情緒管理測(cè)驗(yàn)。本研究由于測(cè)試條件受限，未對(duì)所有患者進(jìn)行持續(xù)操作測(cè)驗(yàn)；另有文獻(xiàn)報(bào)道，MCCB不適用于評(píng)估BD患者的社會(huì)認(rèn)知功能[14]：故本研究采用MCCB中的7項(xiàng)測(cè)試，包括連線測(cè)驗(yàn)、符號(hào)編碼、霍普金斯詞語學(xué)習(xí)、空間廣度、迷宮測(cè)驗(yàn)、簡(jiǎn)易視覺空間記憶測(cè)試及范疇流暢評(píng)估雙相障礙患者的神經(jīng)認(rèn)知功能。

1.2.3糞便標(biāo)本的采集 于入組后3 d內(nèi)清晨采集所有受試者新鮮糞便標(biāo)本約10 g于40 mL無菌采便盒內(nèi)，迅速置于-80 ℃冰箱保存。糞便采集過程均由1名接受過嚴(yán)格無菌操作培訓(xùn)的人員完成。

1.2.4糞便中基因組DNA的提取 糞便采集后1周內(nèi)采用EZNA. Stool DNA Kit試劑盒(上海索寶生物科技有限公司)完成基因組DNA的提取，取50～100 mg糞便樣品經(jīng)過渦旋5 min，70 ℃水浴10 min，90 ℃水浴5 min，冰上孵化2 min，渦旋2 min，冰上孵化5 min，17 000×g離心5 min，洗脫等步驟提取約200 μL含有DNA的樣品，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.5PCR技術(shù)及生物信息學(xué)分析 從糞便標(biāo)本中提取的16S rRNA基因中的V3-V4可變區(qū)域片段行PCR擴(kuò)增，模板DNA 2.5 μL，引物341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′，引物806R：5′-GGA-CTACNNGGGTATCTAAT-3′。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit試劑盒(武漢錦奧科技生物有限公司)行文庫的構(gòu)建：取樣本DNA進(jìn)行保守引物擴(kuò)增、產(chǎn)物純化定量、等量混合切膠回收，進(jìn)行末端修復(fù)、加A，接頭連接，最后純化出庫。將構(gòu)建后的文庫按照試劑盒說明書應(yīng)用Qubit和Q-PCR進(jìn)行質(zhì)量控制，文庫質(zhì)檢合格后，應(yīng)用HiSeq2500 PE250(美國Illumina公司)行文庫上機(jī)測(cè)序。根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增的引物序列將各樣品的數(shù)據(jù)從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出來，隨后對(duì)各樣品的reads給予拼接，經(jīng)過嚴(yán)格過濾處理[15]獲得高質(zhì)量Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags)。利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/)聚類，以97%的一致性將序列聚類成為運(yùn)算分類單元(operational taxonomic units, OTUs)，篩選出頻數(shù)最高的序列作為代表序列并進(jìn)行物種注釋，采用Mothur方法與SILVA(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[16]進(jìn)行物種注釋分析，設(shè)定閾值為0.8～1.0，獲得分類學(xué)信息和群落組成。應(yīng)用LEfSe軟件(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root/index)分析組間相對(duì)豐度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的菌群。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料病例組共納入樣本31例，其中躁狂組19例、抑郁組12例；對(duì)照組28例。納入的59例受試者中，因有9例未完成MCCB測(cè)試，剔除無效的病例和無效對(duì)照后，實(shí)際納入有效樣本共50例(有效率84.75%)，其中病例組27例，包含躁狂組17例，抑郁組10例；對(duì)照組23例。病例組與對(duì)照組的一般人口學(xué)特征及飲食情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。躁狂組、抑郁組與對(duì)照組在性別、年齡、受教育年限、BMI、吸煙和飲酒狀況、是否飲用乳酸制品、飲食結(jié)構(gòu)及排便習(xí)慣等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 一般人口學(xué)資料及飲食情況分析

Tab.1 Analysis of demographic data and dietary status

項(xiàng) 目對(duì)照組(n=23)病例組總樣本(n=27)躁狂組(n=17)抑郁組(n=10)t/χ2aP值aF/χ2bP值b年齡(x±s,歲)27.43±9.9225.33±6.8026.29±6.0623.70±7.97-0.880.380.690.51受教育年限(x±s,年)12.48±3.0613.04±2.7413.18±2.6012.80±3.080.680.500.280.76BMI(kg/m2, x±s)21.11±1.7021.77±2.6821.61±2.1622.03±3.521.010.320.600.55性別(男/女, 例)15/816/1110/76/40.190.670.190.91吸煙狀況(是/否,例)5/1811/167/104/62.060.152.070.36飲酒狀況(是/否,例)10/1312/156/116/40.010.951.560.46乳制品(是/否,例)12/1116/1112/54/60.250.622.640.27飲食結(jié)構(gòu)(葷/素,例)11/1216/1111/65/50.650.421.200.55主食比例(≥50%/<50%,例)14/916/1110/76/40.010.910.020.99油炸食品(是/否,例)2/213/242/151/90.080.780.100.95腌制食品(是/否,例)0/231/261/160/100.010.991.980.37排便頻率(每天≥1次/每天<1次,例)16/721/613/48/20.440.510.480.79糞便性狀(濕軟/干硬,例)22/124/315/29/10.130.720.800.67

BMI為體質(zhì)量數(shù)；飲食結(jié)構(gòu)：葷表示葷食(肉、蛋)比例≥50%，素表示葷食(肉、蛋)比例<50%；油炸/腌制食品：是表示食用油炸/腌制食品頻率每周≥3次，否表示食用油炸/腌制食品頻率每周<3次；a對(duì)照組與病例組兩組間比較的統(tǒng)計(jì)值；b對(duì)照組、躁狂組、抑郁組三組間比較的統(tǒng)計(jì)值。

2.2 認(rèn)知功能的比較病例組與對(duì)照組認(rèn)知功能比較：病例組在符號(hào)編碼(t=-2.20，P=0.03，圖1A)、霍普金斯詞語學(xué)習(xí)測(cè)驗(yàn)(t=-2.43，P=0.02，圖1B)及迷宮測(cè)試(t=-2.24，P=0.03，圖1C)三方面得分均較對(duì)照組降低。躁狂組、抑郁組、對(duì)照組認(rèn)知功能比較：3組在符號(hào)編碼(F=3.53，P=0.04，圖1A)、霍普金斯詞語學(xué)習(xí)(F=6.12，P<0.01，圖1B)及迷宮測(cè)驗(yàn)(F=3.82，P=0.03，圖1C)3項(xiàng)上總體存在差異。組間兩兩比較顯示，在符號(hào)編碼(t=2.65，P=0.01，圖1A)及迷宮測(cè)試(t=2.74，P=0.01，圖1C)兩方面，躁狂組得分均較對(duì)照組降低；在霍普金斯詞語學(xué)習(xí)上，抑郁組得分較對(duì)照組(t=3.50，P<0.01，圖1B)及躁狂組(t=2.40，P=0.02，圖1B)降低。

圖1 病例組與對(duì)照組及躁狂組、抑郁組、對(duì)照組3組組間認(rèn)知功能的比較

Fig.1 Comparison of cognitive function between BD group and control group, and among BDM group, BDD group and control group

A：符號(hào)編碼；B：霍普金斯詞語學(xué)習(xí)；C：迷宮測(cè)驗(yàn)。*P<0.05，#P<0.01。

2.3 腸道菌群相對(duì)豐度與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

2.3.1腸道菌群相對(duì)豐度與人口學(xué)特征的相關(guān)性分析 現(xiàn)分別在屬和種水平，對(duì)組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的菌群相對(duì)豐度與年齡、受教育年限及BMI進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，普通擬桿菌種的相對(duì)豐度與年齡呈正相關(guān)(r=0.40，P<0.01，圖2)。

圖2 腸道菌群相對(duì)豐度與人口學(xué)特征的相關(guān)性分析

Fig.2 Correlation between the relative abundance of gut microbiome and demographic characteristics

2.3.2腸道菌群相對(duì)豐度與臨床癥狀嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析 躁狂組患者腸道菌群相對(duì)豐度與YMRS總分的相關(guān)性分析表明，雙歧桿菌種的相對(duì)豐度與YMRS總分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.53，P<0.05，圖3)。抑郁組患者腸道菌群相對(duì)豐度與MADRS總分及各因子分的相關(guān)性分析表明，雙歧桿菌屬的相對(duì)豐度與MADRS總分(r=-0.70，P<0.05，圖4A)及MADR中的心境惡劣因子分(r=-0.64，P<0.05，圖4B)呈負(fù)相關(guān)，志賀菌屬的相對(duì)豐度與MADRS的抑制因子分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.66，P<0.05，圖4C)。大腸埃希氏菌菌種的相對(duì)豐度與MADRS的抑制因子分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.66，P<0.05，圖4D)。

圖3 腸道菌群相對(duì)豐度與YMRS總分的相關(guān)性分析

Fig.3 Correlation between relative abundance of gut microbiome and the total score of YMRS

2.3.3腸道菌群相對(duì)豐度與認(rèn)知功能間的相關(guān)性分析 躁狂組患者腸道菌群相對(duì)豐度與認(rèn)知功能的相關(guān)性分析表明，雙歧桿菌種的相對(duì)豐度與范疇流暢(r=-0.51，P<0.05，圖5)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。抑郁組患者腸道菌群相對(duì)豐度與認(rèn)知功能的相關(guān)性分析表明，抑郁組患者腸道菌群中，志賀菌屬的相對(duì)豐度與范疇流暢評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.71，P<0.05，圖6A)。雙歧桿菌種的相對(duì)豐度與連線測(cè)試(r=-0.75，P<0.05，圖6B)，符號(hào)編碼(r=-0.64，P<0.05，圖6C)、空間廣度(r=-0.87，P<0.01，圖6D)及范疇流暢(r=-0.75，P<0.05，圖6E)的評(píng)分呈負(fù)相關(guān)；大腸埃希菌菌種的相對(duì)豐度與范疇流暢評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.71，P<0.05，圖6F)。

圖4 腸道菌群相對(duì)豐度與MADRS各因子分的相關(guān)性分析

Fig.4 Correlation between relative abundance of gut microbiome and the factor scores of MADRS

A：雙歧桿菌屬相對(duì)豐度與MADRS總分；B：雙歧桿菌屬相對(duì)豐度與MADRS心境惡劣因子分；C：志賀菌屬相對(duì)豐度與MADRS抑制因子分；D：大腸埃希菌菌種相對(duì)豐度與MADRS抑制因子分。

圖5 躁狂組患者腸道菌群相對(duì)豐度與認(rèn)知功能的相關(guān)性分析

Fig.5 Correlation between relative abundance of gut microbiome and cognitive function in BDM group

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，BD患者的信息處理速度、詞語學(xué)習(xí)能力、推理能力和解決問題能力均較健康對(duì)照組降低。一項(xiàng)關(guān)于應(yīng)用MCCB評(píng)估中國雙相障礙患者的認(rèn)知功能研究發(fā)現(xiàn)，重度雙相Ⅰ型障礙患者的信息處理速度、注意力、警覺性、工作記憶、詞語學(xué)習(xí)、視覺學(xué)習(xí)、推理和問題解決能力均較健康人明顯受損[17]。本研究也發(fā)現(xiàn)，雙相抑郁患者的詞語學(xué)習(xí)較健康對(duì)照組降低。一項(xiàng)應(yīng)用MCCB評(píng)估中國雙相Ⅰ型障礙抑郁發(fā)作患者的認(rèn)知功能研究發(fā)現(xiàn)，雙相Ⅰ型障礙-抑郁發(fā)作患者的視覺學(xué)習(xí)能力及信息處理速度均較健康對(duì)照組降低[18]。這些研究均與本研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，雙相躁狂患者的信息處理速度及推理和解決問題能力均較健康對(duì)照組降低。目前尚缺乏應(yīng)用MCCB評(píng)估雙相躁狂患者認(rèn)知功能的研究。一項(xiàng)關(guān)于中國雙相躁狂患者認(rèn)知功能的研究顯示，雙相躁狂患者的詞語學(xué)習(xí)能力較健康對(duì)照組降低[19]。此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，雙相抑郁患者的詞語學(xué)習(xí)能力較雙相躁狂患者降低，這一結(jié)果也與我們臨床所觀察到的雙相抑郁和雙相躁狂患者的臨床特征相符。總之，本研究結(jié)果顯示，雙相躁狂患者與雙相抑郁患者均存在認(rèn)知損害。

圖6 抑郁組患者腸道菌群相對(duì)豐度與認(rèn)知功能的相關(guān)性分析

Fig.6 Correlation between the relative abundance of gut microbiome and cognitive function in BDD group

A：志賀菌屬相對(duì)豐度與范疇流暢；B：雙歧桿菌種相對(duì)豐度與連線測(cè)驗(yàn)；C：雙歧桿菌種相對(duì)豐度與符號(hào)編碼；D：雙歧桿菌種相對(duì)豐度與空間廣度；E：雙歧桿菌種相對(duì)豐度與范疇流暢；F：大腸埃希菌菌種相對(duì)豐度與范疇流暢。

本研究最后探討了在組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的菌群的相對(duì)豐度與人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料、認(rèn)知功能及疾病嚴(yán)重程度之間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌種的相對(duì)豐度與躁狂的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)雙歧桿菌屬的相對(duì)豐度與抑郁的嚴(yán)重程度及心境惡劣的嚴(yán)重程度也呈負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果提示，雙歧桿菌可能在負(fù)性情緒及正性情緒的平衡調(diào)節(jié)中起保護(hù)性作用，是一種有益腸道菌群。AIZAWA[20]的研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者腸道菌群中雙歧桿菌數(shù)量較健康對(duì)照組減少，雙歧桿菌數(shù)量明顯減少的抑郁癥患者更易發(fā)生腸易激綜合征。另有研究發(fā)現(xiàn)，口服含有雙歧桿菌的益生菌可改善抑郁情緒[21]，也提示人類腸道菌群中雙歧桿菌含量可能與情緒的變化存在相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，志賀菌屬及大腸埃希菌菌種的相對(duì)豐度與雙相抑郁患者的抑制癥狀呈負(fù)相關(guān)。目前尚缺乏關(guān)于此類菌群與情緒癥狀之間關(guān)系的研究，我們需擴(kuò)大樣本量對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步闡釋。

本研究還對(duì)BD患者不同臨床相的認(rèn)知功能與腸道菌群相對(duì)豐度之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)躁狂組患者腸道中雙歧桿菌種的相對(duì)豐度與信息處理速度呈負(fù)相關(guān)，抑郁組患者腸道中雙歧桿菌種的相對(duì)豐度與信息處理速度及工作記憶能力呈負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果提示，雙歧桿菌可能對(duì)雙相患者的認(rèn)知功能有保護(hù)性作用。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給小鼠喂飼長(zhǎng)雙歧桿菌1714后，小鼠在物體識(shí)別測(cè)試和Barnes迷宮測(cè)試中的表現(xiàn)提升，表明小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力提高[22]，提示雙歧桿菌對(duì)認(rèn)知功能具有改善作用。最近提出的觀念認(rèn)為，腸道菌群通過腸-腦軸影響宿主認(rèn)知功能，與神經(jīng)、免疫、生化和內(nèi)分泌等因素有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，腸道細(xì)菌可產(chǎn)生許多對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有影響的代謝產(chǎn)物，如D-乳酸鹽、氨和短鏈脂肪酸[23]。在伴有認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)性缺陷的慢性疲勞綜合征患者糞便中產(chǎn)生D-乳酸鹽的腸球菌屬和鏈球菌屬的細(xì)菌數(shù)量增加，表明D-乳酸鹽可能對(duì)認(rèn)知功能有調(diào)節(jié)作用[24]。此外，一些腸道菌株可以產(chǎn)生γ-氨基丁酸、五羥色胺、多巴胺、腎上腺素、去加腎上腺素、組胺等神經(jīng)遞質(zhì)，這些神經(jīng)遞質(zhì)可以通過腸道神經(jīng)系統(tǒng)傳入大腦，進(jìn)而對(duì)認(rèn)知功能產(chǎn)生正面或負(fù)面的影響[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑郁組患者腸道中志賀菌屬及大腸埃希菌菌種的相對(duì)豐度與患者的信息處理速度呈負(fù)相關(guān)。目前國內(nèi)外尚缺乏這兩種菌群與認(rèn)知功能之間關(guān)系的研究，本課題組計(jì)劃在未來的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證這兩種菌群與認(rèn)知功能之間的關(guān)系。

綜上所述，雙相障礙急性發(fā)作期患者存在認(rèn)知功能損害及腸道菌群多樣性變化，腸道菌群相對(duì)豐度的變化與癥狀嚴(yán)重程度及認(rèn)知功能相關(guān)。本課題組計(jì)劃在未來的研究中進(jìn)一步探討其間的因果關(guān)系。