煙草疫霉菌拮抗細(xì)菌的篩選鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

李小杰 李成軍 劉紅彥 等

摘 ?要：為了篩選對(duì)煙草疫霉菌具有拮抗作用的生防細(xì)菌菌株，本研究從煙草黑脛病病圃地采集健康煙株的根際土樣，采用對(duì)峙培養(yǎng)法篩選得到8株對(duì)煙草黑脛病具有拮抗作用的細(xì)菌菌株，其中編號(hào)為L(zhǎng)B-9的菌株對(duì)煙草疫霉菌的抑制作用最強(qiáng)且效果穩(wěn)定，抑菌率為60.6%，且抑菌譜廣，對(duì)其進(jìn)行16S rRNA基因序列分析后將該菌株鑒定為多粘芽孢桿菌。采用單因素優(yōu)化試驗(yàn)初步探究了多粘芽孢桿菌LB-9的最適發(fā)酵條件，明確了LB-9的最適發(fā)酵培養(yǎng)基、最適發(fā)酵溫度、最適發(fā)酵時(shí)間和最適發(fā)酵初始pH值，對(duì)其生防制劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用具有重要意義。

關(guān)鍵詞：煙草疫霉;拮抗細(xì)菌;篩選鑒定;發(fā)酵條件

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.72 ?????????文章編號(hào)：1007-5119（2019）01-0068-07 ?????DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.01.009

Abstract： In order to screen the bacterial strains which have antagonistic effects on Phytophthora nicotianae and provide favorable resources for the biological control of tobacco black shank disease in Henan tobacco areas， the rhizosphere soil samples of healthy tobacco plants were collected from tobacco black shank disease nursery and eight bacterial strains were screened by confrontation culture method. Among them， the strain LB-9 had the strongest and stable inhibitory effect on P. nicotianae with a bacteriostatic rate of 60.6% and a broad spectrum. The strain was identified as Paenibacillus polymyxa by 16S rRNA gene sequencing analysis. The optimum fermentation medium， temperature， time and initial pH value of LB-9 were determined by single factor optimization test which has great significance to the development and application of biocontrol agents.

Keywords： Phytophthora nicotianae; antagonistic bacteria; screening and identification; fermentation condition

煙草黑脛病是我國(guó)煙草的主要根莖部病害，最早發(fā)生于黃淮煙區(qū)[1-3]，目前各主要產(chǎn)煙區(qū)均有不同程度的發(fā)生，是煙葉毀滅性病害之一。近年來(lái)，由于連作煙田面積不斷擴(kuò)大以及連作年限不斷增加，加重了該病害的流行。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)平均每年因煙草黑脛病造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)1億元以上[1]。

目前生產(chǎn)上對(duì)于煙草黑脛病的防治，主要采用甲霜靈和錳鋅類(lèi)的復(fù)配制劑進(jìn)行防治，由于長(zhǎng)期、過(guò)量或不規(guī)范用藥，導(dǎo)致甲霜靈、代森錳鋅的降解物成為目前我國(guó)煙葉中的主要農(nóng)藥殘留成分[4-5]。與此同時(shí)，病原菌對(duì)此類(lèi)藥物的抗藥性也不斷增強(qiáng)，藥效有所降低。因此，采用高效生防菌劑對(duì)煙草黑脛病進(jìn)行生物防治，有利于減少煙葉農(nóng)藥殘留、降低環(huán)境污染，對(duì)維護(hù)農(nóng)田生態(tài)平衡和煙葉綠色生產(chǎn)具有重要意義。

制備高效生防菌劑的重要基礎(chǔ)是篩選效果突出的拮抗菌株，目前關(guān)于篩選拮抗微生物以防治煙草黑脛病的研究較多[6-10]。其中在生防細(xì)菌研究方面，較多的是芽孢桿菌，它能夠產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線等的內(nèi)生孢子和多種抗菌素以及酶類(lèi)物質(zhì)，具有極強(qiáng)的抗逆性和廣譜抗菌活性，目前已被廣泛應(yīng)用于水稻、大豆、棉花、小麥、辣椒、番茄、煙草等多種植物真菌病害的防治[7，11-14]，包括植物根、莖部病害、葉、花部病害和收獲后果品病害等[15-17]。

雖然越來(lái)越多的生防菌株被挖掘出來(lái)，且具有較好防效，但不同地域或寄主植物間防效存在巨大差異。本研究主要針對(duì)河南煙區(qū)煙草黑脛病，篩選對(duì)其具有較好拮抗效果的細(xì)菌菌株，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為其生防制劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供有利資源和基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)河南煙區(qū)煙草根莖類(lèi)病害的生物防治具有重要指導(dǎo)意義。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

供試病原真菌菌株河南煙區(qū)煙草疫霉菌優(yōu)勢(shì)生理小種1號(hào)小種、尖孢鐮刀菌、立枯病菌由本實(shí)驗(yàn)室（煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲(chóng)害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）分離保存;煙草根黑腐病菌、輪枝鐮刀菌、潰瘍病菌、炭疽病菌、灰霉病菌、菊花殼二孢、擬莖點(diǎn)霉由河南科技大學(xué)康業(yè)斌教授惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室保存。土樣采集于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙草黑脛病病圃地健康煙株的根際土壤。

拮抗細(xì)菌的分離、培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基，煙草疫

霉菌的培養(yǎng)用燕麥培養(yǎng)基（OA），供試的其他幾種病原真菌的培養(yǎng)用PDA培養(yǎng)基。拮抗細(xì)菌總DNA提取、16S rDNA片段擴(kuò)增所用試劑均購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.2 ?土壤細(xì)菌的分離與篩選

稱(chēng)取10 g土樣置于90 mL無(wú)菌水中，在28 ℃搖床上振蕩30 min。采用梯度稀釋法[1]，制備10-2、10-3、10-4稀釋液，各取0.1 mL涂布在固體LB平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h。挑取培養(yǎng)特征明顯不同的單菌落，于LB平板進(jìn)行劃線純化，將純化好的菌株保存于4 ℃冰箱備用。

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法篩選對(duì)煙草疫霉菌具有抑制作用的細(xì)菌菌株。將疫霉菌在燕麥培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d，用滅菌手術(shù)刀切取適當(dāng)大小的菌塊，接入新的燕麥平板培養(yǎng)基中央，用滅菌牙簽將待測(cè)拮抗細(xì)菌點(diǎn)接于菌塊周?chē)染嚯x處，于25 ℃培養(yǎng)5 d，觀察并記錄抑菌圈的有無(wú)以及抑菌圈的半徑。每個(gè)處理重復(fù)3次，篩選出有抑菌圈的菌株，并計(jì)算其抑菌率。抑菌率=（對(duì)照平板菌落直徑-處理平板菌落直徑）/對(duì)照平板菌落直徑×100%。復(fù)篩方法同初篩，再次篩選抑菌圈大且效果穩(wěn)定的菌株。

1.3 ?拮抗菌的16S rDNA鑒定

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取拮抗菌株的基因組DNA，并以細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物（F： 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，R： 5'-TACCTTGTTACGACTT-3'）對(duì)菌株的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由生工生物有限公司合成。PCR反應(yīng)體系（25 μL）為：Taq酶0.3 μL，10×Buffer（Mg2+）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 17.2 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min，95 ℃ 45 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，28個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，將PCR產(chǎn)物送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，并選擇同源性較高的序列用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 ?拮抗菌株LB-9的抑菌譜測(cè)定

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，分別測(cè)定拮抗菌株LB-9對(duì)煙草根黑腐病菌、尖孢鐮刀菌、輪枝鐮刀菌、立枯病菌、潰瘍病菌、炭疽病菌、灰霉病菌、菊花殼二孢、擬莖點(diǎn)霉的抑制效果，具體方法參照1.2.2。

1.5 ?拮抗菌株LB-9發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.5.1 ?最適培養(yǎng)基的確定 ?選取3種培養(yǎng)基為拮抗菌LB-9的候選培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方如下：

培養(yǎng)基一：葡萄糖15 g，玉米粉15 g，豆粕15 g，氯化鈉2 g，磷酸二氫鈉3 g，硫酸鎂0.7 g，碳酸鈣1 g/L。

培養(yǎng)基二：玉米粉25 g、葡萄糖15 g、玉米蛋白粉/豆粕15 g、NaCl 1.3 g、MgSO4 0.4 g、K2HPO4 0.8 g、CaCO3 2 g/L。

培養(yǎng)基三：葡萄糖10 g，豆粕/玉米蛋白粉10 g，MgSO4 0.2 g/L，pH 7.5～7.6。

采用涂板計(jì)數(shù)法測(cè)定拮抗菌在3種培養(yǎng)基中發(fā)酵24 h與48 h的活菌量，確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.5.2 ?最適發(fā)酵時(shí)間的確定 ?以最適候選培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。發(fā)酵基礎(chǔ)條件為：培養(yǎng)溫度28 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、發(fā)酵起始pH 7.0、接種量1%、裝液量200 mL/500 mL，監(jiān)測(cè)發(fā)酵72 h間的活菌數(shù)量和芽孢數(shù)量，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.5.3 ?最適發(fā)酵溫度的確定 ?以最適候選培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。發(fā)酵基礎(chǔ)條件為：轉(zhuǎn)速150 r/min、發(fā)酵起始pH 7.0、接種量1%、裝液量200 mL，培養(yǎng)溫度為28 ℃、30 ℃、33 ℃、37 ℃，監(jiān)測(cè)發(fā)酵72 h的活菌數(shù)量和芽孢數(shù)量，確定最佳發(fā)酵溫度。

1.5.4 ?最適初始pH值的確定 ?以最適候選培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。發(fā)酵基礎(chǔ)條件為：培養(yǎng)溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、接種量1%、裝液量200 mL，培養(yǎng)pH為5、6、7、8、9，監(jiān)測(cè)發(fā)酵72 h后的芽孢數(shù)量，以芽孢數(shù)量確定最佳發(fā)酵pH。

1.6 ?數(shù)據(jù)分析

利用DPS 7.05軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性比較。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?煙草疫霉菌拮抗細(xì)菌的分離和篩選

采用平板梯度稀釋法共分離出80株形態(tài)不同的菌株，經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩，共得到8株對(duì)疫霉菌具有拮抗效果的細(xì)菌菌株。其中菌株編號(hào)分別為L(zhǎng)B-9、LB-21、A27的抑菌效果較好，抑菌率均達(dá)到50.0%以上。尤其菌株LB-9的拮抗效果最好，抑菌圈半徑達(dá)到1.0 cm，抑菌率為60.6%（圖1）。在轉(zhuǎn)移5代后，其抑菌效果表現(xiàn)穩(wěn)定。

2.2 ?拮抗菌LB-9的16S rRNA 基因序列分析

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果表明（圖2），菌株LB-9的16S rRNA基因序列與跟其比對(duì)的芽孢桿菌屬同源相似度在99%，將該菌株歸屬為芽孢桿菌屬;同時(shí)其與多粘類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）的16S rRNA基因序列同源性為99%，且位于同一進(jìn)化分支。

2.3 ?拮抗多粘芽孢桿菌LB-9的抑菌譜分析

抑菌譜測(cè)定結(jié)果表明（圖3），多粘芽孢桿菌LB-9對(duì)煙草根黑腐病菌、尖孢鐮刀菌、輪枝鐮刀菌、立枯病菌、潰瘍病菌、炭疽病菌、灰霉病菌、菊花殼二孢、擬莖點(diǎn)霉均具有抑制作用，其中對(duì)煙草根黑腐病菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈半徑達(dá)1.8 cm。由此說(shuō)明，LB-9的抑菌譜廣，具有較好的應(yīng)用前景。

2.4 ?拮抗多粘芽孢桿菌LB-9的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 ?最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基 ?3種培養(yǎng)基對(duì)LB-9生長(zhǎng)狀況的影響差別明顯（圖4）。芽孢桿菌LB-9在培養(yǎng)基一中幾乎不生長(zhǎng);在培養(yǎng)基二中24 h與48 h的菌量變化不大;在培養(yǎng)基三中，發(fā)酵48 h時(shí)其活菌量極顯著高于發(fā)酵24 h及在其他兩種培養(yǎng)基中的活菌量。由此確定，芽孢桿菌LB-9的最適發(fā)酵培養(yǎng)基為培養(yǎng)基三。

2.4.2 ?發(fā)酵時(shí)間對(duì)拮抗菌生長(zhǎng)量的影響 ?發(fā)酵時(shí)間對(duì)芽孢桿菌LB-9活菌量與芽孢數(shù)的影響較大（圖5）。發(fā)酵48 h內(nèi)LB-9活菌量和芽孢數(shù)緩慢增長(zhǎng)，發(fā)酵72 h時(shí)活菌量與芽孢數(shù)均極顯著高于其它發(fā)酵時(shí)間的活菌量與芽孢數(shù)。因此確定最適發(fā)酵時(shí)間為72 h。

2.4.3 ?發(fā)酵溫度對(duì)拮抗菌生長(zhǎng)量的影響 ?由圖6可以看出，隨著培養(yǎng)溫度的升高，LB-9的活菌量和芽孢數(shù)先增加后降低。當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)LB-9?的活菌量與芽孢數(shù)均達(dá)到最大值，其中活菌量極顯著高于其他處理，而芽孢數(shù)與其他處理之間差異不明顯。隨后，其活菌量和芽孢數(shù)均逐漸下降。由此得出，LB-9的最適發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.4.4 ?初始pH值對(duì)拮抗菌生長(zhǎng)量的影響 ?結(jié)果表明（圖7），當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為7時(shí)LB-9的芽孢數(shù)最多，極顯著高于其他處理。隨著pH值的升高，LB-9的芽孢數(shù)逐漸減少，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為9時(shí)，其芽孢數(shù)基本與pH為5時(shí)的芽孢數(shù)相當(dāng)。由此判斷，LB-9的最適發(fā)酵初始pH值為7。

3 ?討 ?論

芽孢桿菌屬革蘭氏陽(yáng)性桿菌，生理特征豐富多樣，分布極其廣泛。目前已報(bào)道的生防芽孢桿菌種類(lèi)有枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、蠟狀芽孢桿菌（B. cereus）、多粘芽孢桿菌（P. polymyxa）、巨大芽孢桿菌（B. megaterium）、短小芽孢桿菌（B. pumilus）和解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）等[18-19]，其中多粘芽孢桿菌是一類(lèi)重要的植物生防細(xì)菌和根際有益促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR），兼具促生長(zhǎng)和病害防治的作用[20-24]，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。本研究從健康煙株的根際土中篩選出8株對(duì)煙草疫霉菌具有拮抗作用的細(xì)菌，其中多粘芽孢桿菌LB-9的拮抗效果最好且穩(wěn)定，同時(shí)對(duì)煙草其他根莖部真菌病害也具有廣譜抗性，應(yīng)用前景良好。本研究與吳秉奇等[23]的研究結(jié)果相比，多粘芽孢桿菌對(duì)煙草黑脛病的抑制效果有明顯差別，分析其原因可能在于菌株的來(lái)源不同，至于LB-9是否具有促進(jìn)煙株生長(zhǎng)的作用還需進(jìn)一步研究。

不同的拮抗菌菌株，其最適生長(zhǎng)條件不同，將影響其活菌數(shù)量、比例以及對(duì)病原菌的抑制效果。曹琦琦等[25]的研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌NB12在pH 7.0，溫度30 ℃的LB或BPY培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，其生長(zhǎng)量最大。張鏡等[26]認(rèn)為，多產(chǎn)色鏈霉菌Act0988拮抗菌的最適溫度是28 ℃，最適pH為7.0，對(duì)其生長(zhǎng)和繁殖影響較大。趙德立等[27]的研究表明，應(yīng)用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，初始pH 9.0，30 ℃，通氣量100 mL，接種量為10%，140 r/min振蕩培養(yǎng)72 h時(shí)的多粘芽孢桿菌JW-725發(fā)酵液對(duì)柑橘青霉具有很強(qiáng)的拮抗作用。本研究采用單因素優(yōu)化試驗(yàn)，確定多粘芽孢桿菌LB-9的最適發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖10 g，豆粕/玉米蛋白粉10 g，MgSO4 0.2 g/L;最適發(fā)酵溫度為30℃;最適發(fā)酵時(shí)間為72 h;最適發(fā)酵初始pH值為7。結(jié)果表明，發(fā)酵條件的不同導(dǎo)致多粘芽孢桿菌LB-9的生長(zhǎng)量具有顯著差異。下一步將對(duì)LB-9發(fā)酵液的生防效果及抑菌機(jī)理等方面進(jìn)行深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1]陳瑞泰，朱賢朝，王智發(fā)，等. 全國(guó)16個(gè)主產(chǎn)煙?。▍^(qū)）煙草侵染性病害調(diào)研報(bào)告[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，1997，18（4）：1-7.

CHEN R T， ZHU X C， WANG Z F， et al. Investigation report on tobacco infective diseases of 16 main tobacco producing provinces in China[J]. Chinese Tobacco Science， 1997（4）： 1-7.

[2]賴(lài)傳雅. 農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)：南方本[M]. 北京：科學(xué)出版社，2003：157-161.

LAI C Y. Agricultural Plant Pathology： Southern version[M]. Beijing： Science Press， 2003： 157-161.

[3]王志愿，姜清治，霍沁建. 煙草黑脛病的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（21）：250-255.

WANG Z Y， JIANG Q Z， HUO Q J. Research progress on tobacco black shank disease[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2010， 26（21）： 250-255.

[4]羅華元，王紹坤，常壽榮，等. 12種農(nóng)藥在煙葉中殘留及煙氣中轉(zhuǎn)移試驗(yàn)初報(bào)[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，25（5）：636-641.

LUO H Y， WANG S K， CHANG S R， et al. Determination

of 12 pesticides residues in tobacco leaf and shifting to smoke[J]. Journal of Yunnan Agricultural University， 2010， 25（5）： 636-641.

[5]李義強(qiáng)，孫惠青，王秀國(guó)，等. 防治煙草黑脛病常用農(nóng)藥殘留量與降解的研究[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2011，17（4）：67-73.

LI Y Q， SUN H Q， WANG X G， et al. The degradation dynamics and residue level of different germicides against tobacco black shank[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2011， 17（4）： 67-73.

[6]彭閣，姜乾坤，譚軍，等. 煙草黑脛病拮抗真菌的篩選及活性評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2018，39（1）：77-84.

PENG G， JIANG Q K， TAN J， et al. Selection and field evaluation of antagonistic fungi against tobacco black shank[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（1）： 77-84.

[7]徐同偉，周建云，祖慶學(xué)，等. 兩株煙草黑脛病拮抗菌的篩選、鑒定和促生防病潛力評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2017，38（3）：44-50.

XU T W， ZHOU J Y， ZU Q X， et al. Screening， identification， biocontrol and growth-promoting potential evaluation of two bacterial strains against tobacco black shank[J]. Chinese Tobacco Science， 2017， 38（3）： 44-50.

[8]楊兵，劉慧美，龍章富. 微生物防治煙草黑脛病的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)藥，2015，54（9）：629-634.

YANG B， LIU H M， LONG Z F. Recent advances in microbiological control of Phytophthora parasitica var. nicotianae[J]. Agrochemicals， 2015， 54（9）： 629-634.

[9]楊珍福，吳毅歆，陳映嵐，等. 煙草拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選與防病促生長(zhǎng)效果[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2014（6）：48-53.

YANG Z F， WU Y X， CHEN Y L， et al. Screening， growth promotion， and disease control of antagonistic and endophytic bacteria in tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2014（6）： 48-53.

[10]王靜，孔凡玉，張成省，等. 放線菌F8對(duì)煙草黑脛病的拮抗作用及其產(chǎn)酶活性[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2013（2）：49-53.

WANG J， KONG F Y， ZHANG C X， et al. Antagonism effect and enzyme-producing comparison of Actinomycetes F8 against tobacco black shank[J]. Chinese Tobacco Science， 2013（2）： 49-53.

[11]陳志誼. 芽孢桿菌類(lèi)生物殺菌劑的研發(fā)與應(yīng)用[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2015，31（5）：723-732.

CHEN Z Y. Research and application of bio-fungicide with Bacillus spp.[J]. Chinese Journal of Biological Control， 2015， 31（5）： 723-732.

[12]陳志誼，劉榮，劉永鋒. 水稻紋枯病拮抗細(xì)菌B-916的選育[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2003，19（1）：15-18.

CHEN Z Y， LIU R， LIU Y F. The screening of antagonistic bacteria strain B-916 against rice sheath blight[J]. Chinese Journal of Biological Control， 2003， 19（1）： 15-18.

[13]郭榮君，劉杏忠，楊懷文，等. 芽孢桿菌BH_1防治大豆根腐病的效果及機(jī)制[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2003，19（4）：180-184.

GUO R J， LIU X Z， YANG H W， et al. Mechanism of rhizobacteria BH1（Bacillus sp .）to suppress soybean root rot disease caused by Fusarium spp.[J]. Chinese Journal of Biological Control， 2003， 19（4）： 180-184.

[14]歐雄常，柳鳳，詹儒林. 拮抗辣椒疫病菌的紅樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌篩選及RS261菌株鑒定[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2009，36（2）：175-180.

OU X C， LIU F， ZHAN R L. Screen of mangrove endophytic bacteria antagonists against Phytophthora capsici and identification of strain RS261[J]. Microbiology， 2009， 36（2）： 175-180.

[15]馮志珍. 解淀粉芽孢桿菌FB-16的篩選及其對(duì)作物疫霉菌的抑制作用[D]. 咸陽(yáng)：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

FENG Z Z. Screening and inhibitory effect of Bacillus amyloliquefaciens FB-16 against crop Phytophthora sp.[D]. Xianyang： Northwest A&F University， 2012.

[16]張榮勝，王曉宇，羅楚平，等. 解淀粉芽孢桿菌Lx-11產(chǎn)脂肽類(lèi)物質(zhì)鑒定及表面活性素對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病的防治作用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（10）：2014-2021.

ZHANG R S， WANG X Y， LUO C P， et al. Identification of the lipopeptides from Bacillus amyloliquefaciens Lx-11 and biocontrol efficacy of surfactin against bacterial leaf streak[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2013， 46（10）： 2014-2021.

[17]黃玲玲，裘紀(jì)瑩，唐琳，等. 解淀粉芽胞桿菌NCPSJ7對(duì)采后蘋(píng)果輪紋病的生物防治作用[J]. 中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2015，21（2）：20-24.

HUANG L L， QIU J Y， TANG L， et al. Biological control effect of Bacillus amylus NCPSJ7 on postharvest apple ring rot[J]. Food and Nutrition in China， 2015， 21（2）： 20-24.

[18]周曉梅，劉強(qiáng)，王瑛璐. 拮抗菌生物防治農(nóng)作物病害的研究進(jìn)展[J]. 吉林師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010（4）：36-39.

ZHOU X M， LIU Q， WANG Y L. Research progress on biocontrol of crop diseases by antagonistic bacteria[J]. Journal of Jilin Normal University （Natural Science Edition）， 2010（4）： 36-39.

[19]常冬梅. 芽孢桿菌（Bacillus spp.）根際接種促進(jìn)辣椒（Capsicum annuum L.）生長(zhǎng)的作用機(jī)理[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2010.

CHANG D M. Mechanisms of Bacillus spp. rhizosphere inoculation promoting growth of pepper （Capsicum annuum L.）[D]. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2010.

[20]Ryu C M， Kim J， Choi O， et al. Improvement of biological

control capacity of Paenibacillus polymyxa E681 by seed pelleting on sesame[J]. Biological Control， 2006， 39（3）： 282-289.

[21]吳秉奇，梁永江，丁延芹，等. 兩株煙草根際拮抗菌的生防和促生效果研究[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2013（1）：66-71.

WU B Q， LIANG Y J， DING Y Q， et al. Study on disease-preventing and growth-promoting effects of two antifungal bacteria from tobacco rhizosphere[J]. Chinese Tobacco Science， 2013（1）： 66-71.

[22]Beatty P H， Jensen S E. Paenibacillus polymyxa produces fusaricidin-type antifungal antibiotics active against Leptosphaeria maculans， the causative agent of blackleg disease of canola[J]. Canadian Journal of Microbiology， 2002， 48（2）： 159-169.

[23]王波，周澗楠，黃忠勤，等. 一株多粘類(lèi)芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa對(duì)甘薯黑斑病的生物防治效果及作用機(jī)理初探[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29（10）：40-43.

WANG B， ZHOU J N， HUANG Z Q， et al. Biocontrol efficacy of a Paenibacillus polymyxa strain against black rot of sweet potato and its action mechanism[J]. Acta Agriculturae Jiangxi， 2017， 29（10）： 40-43.

[24]馬夙靜. 多粘類(lèi)芽孢桿菌ZYPP18的分離鑒定與促生防病效果測(cè)定[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

MA S J. Identification and determination the plant growth promoting and biocontrol properties of Paenibacillus polymyxa ZYPP18[D]. Tai’an： Shandong Agricultural University， 2018.

[25]曹琦琦，周登博，鄭麗，等. 水稻紋枯病菌拮抗菌的篩選、鑒定及培養(yǎng)條件探索[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2013，29（2）：270-276.

CAO Q Q， ZHOU D B， ZHENG L， et al. Screening， identification and cultivation conditions of microbes antagonistic to rice sheath blight fungus Rhizoctonia solani[J]. Chinese Journal of Biological Control， 2013， 29（2）：270-276.

[26]張鏡，牟利輝，劉志偉，等. Act0988拮抗菌株鑒定及培養(yǎng)條件與菌株生長(zhǎng)關(guān)系研究[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2016，32（7）：112-118.

ZHANG J， MOU L H， LIU Z W， et al. Identification of antagonistic strain act0988，and relationships between cultivation conditions and its growth[J]. Biotechnology Bulletin， 2016， 32（7）： 112-118.

[27]趙德立，曾林子，李暉，等. 多粘芽孢桿菌JW-725抗菌活性物質(zhì)及其發(fā)酵條件的初步研究[J]. 植物保護(hù)，2006，32（1）：48-51.

ZHAO D L， ZENG L Z， LI H， et al. Fermentation of Bacillus polymyxa JW-725 and preliminary extraction of the antifungal substances[J]. Plant Protection， 2006， 32（1）： 48-51.