煙草黑脛病生防菌的篩選鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

劉暢++許家來++郭凱

摘要：從山東煙田土壤中篩選對(duì)山東煙草黑脛?。≒hytophthora parasitica var.nicotianae）具有較強(qiáng)拮抗作用的生防菌株。通過稀釋涂布法初篩后，用平板對(duì)峙法復(fù)篩到拮抗效果較好的菌株YCG-2，根據(jù)菌株形態(tài)與培養(yǎng)特征、ITS序列分析進(jìn)行鑒定，該菌株與哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的親緣關(guān)系較近，且形態(tài)與培養(yǎng)特征與哈茨木霉基本相符，因此鑒定為哈茨木霉。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件，最優(yōu)發(fā)酵條件為每500 mL瓶 20 g 菇渣，料水比為1 g ∶3.0 mL，種子液接種量1×107 CFU/g，pH值7.0，最適溫度28 ℃，恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。

關(guān)鍵詞：煙草黑脛?。还哪久?；發(fā)酵條件；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： S435.72文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0167-04

煙草黑脛病的病原菌為煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae Breda或P. parastica var. nicotianae Tucker）[1]，隸屬于藻物界（Chromista）、卵菌門（Oomycota）、卵菌綱（Oomycetes）、腐霉目（Pythiales）、腐霉科（Pythiaceae）、疫霉屬（Phytophthora）[2]。煙草黑脛病是世界性的嚴(yán)重病害，在我國(guó)發(fā)生較為普遍，特別在河南和山東黃淮煙區(qū)嚴(yán)重影響煙草產(chǎn)量和質(zhì)量[3]。山東省是老重病區(qū)，曾因推廣抗病品種在生產(chǎn)上起到較好的作用，但年發(fā)病率仍在5%～20%，如1981年安丘縣曾因此病絕產(chǎn)667 hm2以上[4]。在不采取防治措施情形下，會(huì)出現(xiàn)毀滅性災(zāi)害[5]。目前煙草生產(chǎn)上抗黑脛病品種效果有限，黑脛病的防治主要依賴甲霜靈等苯基酰胺類殺菌劑，且防治藥物品種單一[6]。

隨著煙草和煙草制品逐步向無公害方向發(fā)展，生物防治方法應(yīng)運(yùn)而生，能夠有效克服農(nóng)藥殘留和病菌抗藥性的問題，生防菌通過與病原真菌的拮抗作用來防治煙草黑脛病。近年來，國(guó)內(nèi)已有不少關(guān)于煙草黑脛病生防菌方面的研究。如普城沙雷菌、綠針假單胞菌、黏類芽孢桿菌等細(xì)菌都對(duì)煙草疫霉有較強(qiáng)的拮抗作用[7-8]。喻會(huì)平等篩選出的復(fù)配細(xì)菌菌株對(duì)煙草黑脛病有很好的防治效果[9]。張良等研究顯示，長(zhǎng)柄木霉（Trichoderma longbrachitum）和涇陽鏈霉菌（Streptomyces jingyangensis）是具有較高親和性的增效組合，2個(gè)菌株復(fù)配后可有效促進(jìn)煙苗生長(zhǎng)和防治煙草黑脛病[10]。但目前為止，篩選出煙草疫霉菌的拮抗菌以細(xì)菌居多，真菌較少，且在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用很少。本研究擬從山東省濰坊市洛莊煙草實(shí)驗(yàn)站煙田的土壤中分離、純化、篩選拮抗菌，并對(duì)拮抗效果較好的真菌菌株進(jìn)行了發(fā)酵條件的優(yōu)化，為后期驗(yàn)證該菌株在田間的防治效果，利用該菌株制作菌肥，并應(yīng)用于煙田奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1樣品來源2014年6月從山東省濰坊市洛莊煙草實(shí)驗(yàn)站附近煙草黑脛病發(fā)生較為嚴(yán)重的煙田采集土壤5份。采集土壤時(shí)，選取病煙株集中地塊附近無病煙株，收集煙株根周圍土壤，每塊煙田取3株，3株煙的根周圍土等量混為1份樣品，分裝入無菌50 mL刻度塑料試管內(nèi)，貼上標(biāo)簽后帶回實(shí)驗(yàn)室分離拮抗菌。

1.1.2主要試劑和儀器引物（ITS 1、ITS 4）、Taq mix 購(gòu)自上海生工生物有限公司，Marker購(gòu)自Takara公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭ｋ娪緝x、PCR為Bio-Rad，顯微鏡為Nikon eclipse E100 。

1.1.3培養(yǎng)基及發(fā)酵材料PDA培養(yǎng)基（培養(yǎng)篩選出的拮抗真菌）購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司，LB培養(yǎng)基（培養(yǎng)篩選出的拮抗細(xì)菌，含胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物 5.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，瓊脂 15.0 g/L，pH值 7.0），燕麥培養(yǎng)基（OA，燕麥 60.0 g/L，瓊脂18.0 g/L），發(fā)酵材料為蘑菇渣（蘑菇渣為主要發(fā)酵材料，來自山東省棗莊冠宇食用菌有限公司）。

1.2拮抗菌的初篩

5份土壤每份取10 g于盛有90 mL無菌水的三角瓶中，搖床150 r/min振蕩30 min，記作1×10-1。取1 mL懸濁液至含有9 mL無菌水的試管中，渦旋60 s，記作1×10-2，依次稀釋至1×10-5。取1×10-4和1×10-5這2個(gè)濃度上清液各100 μL涂板，3次重復(fù)，板中央接病原菌煙草黑脛病WZL-072（由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離獲得）。28 ℃下培養(yǎng)3～5 d，挑取周圍無病原菌絲生長(zhǎng)的菌株進(jìn)行分離純化。

1.3拮抗菌的復(fù)篩

采用平板對(duì)峙法，將初篩出來的拮抗菌與煙草黑脛病原菌株WZL-072進(jìn)行對(duì)峙。

1.3.1拮抗細(xì)菌與WZL-072對(duì)峙試驗(yàn)將5 mm打孔器打孔的WZL-072菌塊置于OA培養(yǎng)基上，4個(gè)大小相同無菌濾紙片等距離放于WZL-072四周，吸取5 μL 180 r/min、28 ℃培養(yǎng)12 h的拮抗細(xì)菌菌液滴于濾紙片上，以等量無菌水為對(duì)照，各3次重復(fù)。28 ℃下培養(yǎng)5～7 d，每天測(cè)量WZL-072菌落直徑。

1.3.2拮抗真菌與WZL-072對(duì)峙試驗(yàn)利用5 mm打孔器分別打孔拮抗真菌與WZL-072，各取1塊置于OA培養(yǎng)基上進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，各3次重復(fù)。28 ℃下培養(yǎng)5～7 d，每天測(cè)量WZL-072菌落直徑。

1.3.3抑菌率的計(jì)算

抑菌率=對(duì)照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑對(duì)照病原菌菌落直徑×100%。

1.4菌株的鑒定

1.4.1形態(tài)學(xué)鑒定滴1滴乳酸酚棉蘭染色液于載玻片中央，膠帶粘取一點(diǎn)轉(zhuǎn)接3 d的YCG-2 菌絲放于染色液上，濾紙吸去多余的染色液，在10×40、10×100倍的光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)、孢子的大小及形狀。參照喻璋等的方法[11]進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4.2分子生物學(xué)鑒定樣品DNA的提取按照艾德萊生物公司的“真菌基因組DNA快速提取試劑盒”中的方法進(jìn)行，用真菌通用引物（ITS 1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS 4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行擴(kuò)增[12]，測(cè)定其序列。通過Blast程序，從NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性搜索，選取相似性最高且是有效發(fā)表的典型菌株的序列，用clusta lX 進(jìn)行序列比對(duì)，用MEGA 4.0的Neighbor-Joining 法選取前250個(gè)最好的比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定 YCG-2菌株的分類地位。

1.5發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.5.1種子液的制備及種子液孢子濃度檢測(cè)種子液的制備：稱20 g菇渣于500 mL三角瓶中，加蒸餾水50 mL，料水比為1 g ∶2.5 mL，121 ℃滅菌40 min，接種5-10塊菌塊，28 ℃培養(yǎng)6 d。加150 mL無菌水，搖勻后用2層無菌紗布過濾，濾液 5 000 r/min 離心10 min，倒掉上清液，加30%甘油重懸孢子液，混勻后分裝入凍存管中，-80 ℃保存。采用活菌計(jì)數(shù)法檢測(cè)種子液孢子濃度：取1 mL種子液，梯度稀釋后進(jìn)行平板培養(yǎng)（培養(yǎng)基內(nèi)加入曲通抑制菌絲生長(zhǎng)）。培養(yǎng)溫度 28 ℃，時(shí)間48 h，3次重復(fù)。

1.5.2單因素試驗(yàn)選擇裝料量、溫度、料水比、接種量、pH值作為影響YCG-2菌株生長(zhǎng)的主要因素，通過單因素試驗(yàn)選取正交試驗(yàn)的因素和水平?；緱l件為裝料量20 g蘑菇渣，料水比為1 g ∶2.5 mL，pH值自然，接種1 mL濃度1×107 CFU/g 的孢子液，28 ℃培養(yǎng)6 d后取出計(jì)算活菌數(shù)。在基本條件基礎(chǔ)上，按照表1所列指標(biāo)逐項(xiàng)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。每個(gè)處理3次重復(fù)。

表1單因素水平梯度設(shè)置

料水比

（含水率）接種量

（CFU/g）裝料量

（g）pH值培養(yǎng)溫度

（℃）1 ∶1.5（60%）1×10455.0221 ∶2.0（67%）1×105105.6251 ∶2.5（71%）1×106156.0281 ∶3.0（75%）1×107206.5311 ∶3.5（80%）1×108257.034

1.5.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取料水比（X1）、裝料量（X2）、培養(yǎng)溫度（X3）3個(gè)因素為考察對(duì)象，以活菌數(shù)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，3次重復(fù)，試驗(yàn)因素水平及編碼見表2。

1.6數(shù)據(jù)處理與分析

采用STATA方差分析軟件及 Microsoft Excel 2003統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性分析，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行正交分析。

2結(jié)果

2.1拮抗菌的初篩

從采集到的5份土樣中初篩得到26株純培養(yǎng)拮抗細(xì)菌，編號(hào)為YCG-B1至YCG-B26，8株純培養(yǎng)拮抗真菌，編號(hào)為YCG-1至YCG-8。

2.2拮抗菌的復(fù)篩

如表3所示，采用對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)一步篩選，共篩選到7株菌株有抑制效果，其中6株細(xì)菌、1株真菌，抑菌率67.42%～84.34%，抑菌效果最好的是YCG-2，抑菌率達(dá)到84.34%。

2.3經(jīng)典分類學(xué)特征

觀察發(fā)現(xiàn)：在PDA培養(yǎng)基上，YCG-2菌株菌落開始為白色絮狀，逐漸變?yōu)榫G色，后期變?yōu)榘稻G色，顏色由淺變深，狀態(tài)由絮狀逐漸變得緊而密。通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：YCG-2菌株的菌絲纖細(xì)無色，具分隔，多分枝，分枝間夾角呈銳角。分生孢子梗從菌絲的側(cè)枝上生出，對(duì)生或互生，一般有2～3次分枝，著生分生孢子的小梗瓶形或錐形。分生孢子多為球形（圖1）。

2.4系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征

用真菌通用引物ITS 1和ITS 4擴(kuò)增菌株YCG-2的核糖體DNA，得到595 bp的 ITS DNA序列，利用Blast程序與NCBI中已登錄的基因序列進(jìn)行比對(duì)，選取與其同源性較高且已定名的菌株的相關(guān)序列信息，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，取前250個(gè)最好的比對(duì)結(jié)果建樹（圖2），可以看出，菌株YCG-2的序列與哈茨木霉的序列相似性較高。

2.5拮抗菌株YCG-2發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1料水比變化對(duì)YCG-2孢子產(chǎn)量的影響由圖3可見，料水比對(duì)菌株YCG-2的生長(zhǎng)有很大影響，料水比為

1 g ∶1.5 mL時(shí)，YCG-2菌株的孢子產(chǎn)量最少，孢子數(shù)為8.00×108 CFU/g；料水比為1 g ∶3.0 mL時(shí)YCG-2產(chǎn)生的孢子最多，達(dá)到29.00×108 CFU/g，所以1 g ∶3.0 mL為菌株YCG-2產(chǎn)生孢子的最佳料水比。

2.5.2接種量變化對(duì)YCG-2孢子產(chǎn)量的影響由圖4可知，接種量對(duì)YCG-2菌株的生長(zhǎng)有一定影響，在裝料20 g蘑菇渣，料水比為1 g ∶3.0 mL，自然pH值，28 ℃條件下，隨著接種量的增大，YCG-2孢子產(chǎn)量也會(huì)增加，接種量為1×107 CFU/g 時(shí)YCG-2孢子產(chǎn)量最大，孢子數(shù)達(dá)到29.50×108 CFU/g，當(dāng)接種量繼續(xù)增大，YCG-2菌株的活菌數(shù)則急劇降低，這可能是因?yàn)槟⒐皆械木w過多，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)成分不能滿足過量菌體的生長(zhǎng)，從而影響活菌數(shù)。

2.5.3裝料量變化對(duì)YCG-2孢子產(chǎn)量的影響由圖5可見，YCG-2菌株的孢子產(chǎn)量隨著裝料量的增加，孢子產(chǎn)量越高，此時(shí)料水比為1 g ∶3.0 mL，自然pH值，接種1 mL濃度 1×107 CFU/g 的孢子液，溫度28 ℃。在每瓶20 g裝料量情況下菌株的生長(zhǎng)狀況最好，孢子產(chǎn)量達(dá)到最高值29.01×108 CFU/g。當(dāng)裝料量達(dá)到每瓶25 g時(shí)，孢子產(chǎn)量有所降低，這可能與物料堆積過多造成透氣量下降有關(guān)。

2.5.4初始pH值變化對(duì)YCG-2菌株生長(zhǎng)的影響用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)物料pH值。從圖6可以看出，在試驗(yàn)所設(shè)置的pH值梯度區(qū)間內(nèi)（5.5～7.5），YCG-2菌株都能生長(zhǎng)，且在pH值為7.0時(shí)孢子產(chǎn)量達(dá)到最高值。在pH值為7.0時(shí)YCG-2的產(chǎn)孢量最多，達(dá)到40.11×108 CFU/g。物料pH值偏大或偏小，孢子產(chǎn)量均減少。

2.5.5溫度變化對(duì)YCG-2菌株生長(zhǎng)的影響分別在22、25、28、31、34 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定不同溫度下的活菌數(shù)，結(jié)果（圖7）表明，溫度變化對(duì)YCG-2菌株的生長(zhǎng)影響很大。在28 ℃下孢子產(chǎn)量達(dá)到最高值39.60×108 CFU/g。隨著溫度的升高，YCG-2孢子產(chǎn)量越來越低，34 ℃時(shí)孢子產(chǎn)量降低到6.0×104 CFU/g。

2.6孢子產(chǎn)生條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

為了驗(yàn)證單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過SPSS統(tǒng)計(jì)軟件設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。本試驗(yàn)選取裝料量、培養(yǎng)溫度、料水比3個(gè)因素為考察對(duì)象，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表4，方差分析見表5。

由表5可知，3個(gè)因素對(duì)YCG-2菌株生長(zhǎng)的影響作用大小依次為A>B>C，即裝料量>溫度>料水比。通過該正交試驗(yàn)結(jié)果確定最佳組合水平為A2B2C2。在裝料量為20 g、培養(yǎng)溫度為28 ℃、料水比為1 g ∶3.0 mL的最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，平均產(chǎn)孢量為40.18×108 CFU/g。

3小結(jié)與討論

煙草黑脛病是煙草生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的土傳病害之一，山東省是受害比較嚴(yán)重的產(chǎn)煙省，每年經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)億元，僅次于煙草病毒病[1]。由于生物防治對(duì)環(huán)境無污染及不容易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)成為病害防治研究的熱點(diǎn)，需要研究和開發(fā)環(huán)境友好的土傳病害生物防治技術(shù)。

本研究從山東省煙草黑脛病發(fā)生嚴(yán)重的煙田里選擇長(zhǎng)勢(shì)良好無病煙株，取其根際土，經(jīng)過初篩和復(fù)篩，獲得1株對(duì)對(duì)煙草疫霉具有較強(qiáng)抑制作用的真菌菌株YCG-2，該菌株的抑菌率最高可達(dá)到84.34%。鑒于此，選擇YCG-2菌株作為后期的主要研究對(duì)象，利用傳統(tǒng)分類方法和18S rDNA 序列測(cè)定法對(duì)菌株YCG-2 進(jìn)行了鑒定，確定菌株YCG-2為哈茨木霉。采用單因素和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)菌株YCG-2進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，得到其最佳發(fā)酵配方和最適發(fā)酵條件。最適培養(yǎng)溫度為28 ℃，pH值為7.0，這與莊敬華等[13]、于曉丹等[14]的關(guān)于木霉發(fā)酵條件研究結(jié)果相似，但張愛華等[15]關(guān)于哈茨木霉發(fā)酵條件的初步研究結(jié)果顯示最適培養(yǎng)溫度為 22 ℃，本研究結(jié)果與之相差較大，可能是因?yàn)楣哪久咕瓴煌?、所用培養(yǎng)基不同等。

為了能降低菌種擴(kuò)大生產(chǎn)成本，本試驗(yàn)以廢棄菇渣為培養(yǎng)基質(zhì)，并以孢子產(chǎn)生量為指標(biāo)，優(yōu)化了相應(yīng)的發(fā)酵條件，為推廣應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。Harman研究認(rèn)為，木霉的生防作用與其根際定殖能力密切相關(guān)[16-17]，因此YCG-2菌株的根際定殖能力有待于進(jìn)一步研究，以期能盡快將其推向大田應(yīng)用。

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