基于氣相色譜質(zhì)譜的脂肪萎縮小鼠血漿代謝組學(xué)研究

吳琪 吳雅韻 韋世杰 余玉英

摘要目的：脂肪萎縮是引起糖脂代謝紊亂的重要因素之一。通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）技術(shù)分析aP2nSREBP1c脂肪萎縮小鼠血漿代謝譜的變化，研究與其密切相關(guān)的差異代謝物與代謝通路，探討其生物學(xué)基礎(chǔ)。方法：應(yīng)用GCMS技術(shù)對6只同窩野生型小鼠和6只轉(zhuǎn)基因小鼠血漿樣品進(jìn)行檢測，對檢測結(jié)果進(jìn)行多元統(tǒng)計分析，篩選出顯著差異的代謝物，借助MetaboAnalyst分析代謝通路。結(jié)果：與野生型（wildtype，WT）小鼠比較，轉(zhuǎn)基因（transgenic，TG）小鼠血漿中乳酸、L纈氨酸、3羥基丁酸、尿素、d半乳糖、D阿洛糖、硬脂酸、棕櫚酸、肌醇、油酸、11十八碳烯酸含量增加。代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)3條脂肪萎縮相關(guān)通路。結(jié)論：通過對aP2nSREBP1c小鼠血漿代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，丙酮酸代謝，磷酸肌醇代謝途徑與脂肪萎縮相關(guān)，為闡明糖脂代謝性疾病的發(fā)病機制提供了代謝組學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞脂肪萎縮;氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用;代謝組學(xué)

中圖分類號：R917文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.009

脂肪萎縮是一種異質(zhì)性、遺傳性或獲得性疾病，主要特征是身體脂肪的選擇性喪失[1]。過量的脂肪累積或組織萎縮導(dǎo)致脂肪對脂質(zhì)的儲存能力不足，引起外周組織脂毒性損傷和低度炎性反應(yīng)，增加糖尿病和動脈粥樣硬化等糖脂代謝性疾病風(fēng)險[2]。近年來國內(nèi)外已有相關(guān)文獻(xiàn)應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)對肥胖癥進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了許多與肥胖相關(guān)的代謝標(biāo)志物[35]，但是在脂肪萎縮的代謝組學(xué)方面的研究是缺乏的。事實上，脂肪萎縮的遺傳突變表型在代謝綜合征中并不罕見;脂肪萎縮與肥胖可同時發(fā)生，其代謝后果相似可能疊加[67]。因此，研究脂肪萎縮下小分子代謝物的變化有利于更加全面認(rèn)識糖脂代謝性疾病的發(fā)病機制，并在此基礎(chǔ)上研發(fā)防治策略和藥物。

近年來，代謝組學(xué)的快速發(fā)展為生命科學(xué)的研究提供許多便捷，它能定量檢測生物體在病理生理刺激或遺傳環(huán)境因素改變下所產(chǎn)生的動態(tài)變化，對于明晰機體發(fā)生的代謝變化指出方向。目前，多種分析技術(shù)應(yīng)用于代謝組學(xué)研究，而GCMS的應(yīng)用較為廣泛，其特點包括較高檢測靈敏度和可供參考的標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫，能夠定性分析代謝產(chǎn)物[8]。aP2nSREBP1c轉(zhuǎn)基因小鼠具有白色脂肪少，棕色脂肪肥大的特點。隨年齡增加，肝臟脂肪異位沉積逐漸加重，并且伴有嚴(yán)重的胰島素抵抗問題[9]。由于糖脂代謝紊亂和脂肪生成分化障礙，該小鼠曾用作先天遺傳引起的脂肪萎縮癥或糖尿病研究[1011]。本實驗主要借助GCMS儀器對aP2nSREBP1c轉(zhuǎn)基因小鼠的血漿樣品進(jìn)行代謝組學(xué)檢測與分析，旨在探究脂肪萎縮條件下血漿代謝物的變化，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物aP2nSREBP1c轉(zhuǎn)基因小鼠由美國Jackson實驗室引進(jìn)，委托南京大學(xué)模式動物研究所凈化，動物合格證編號：J003393 SCXK（蘇）20100001。動物實驗期間均飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實驗動物中心。飼養(yǎng)繁殖條件：SPF級動物房，溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，12 h：12 h晝夜間斷照明，進(jìn)食普通飼料，自由飲食飲水。

1.1.2試劑與儀器渦旋混合器（德國IKA公司）;臺式高速冷凍離心機（美國SCILOGEX公司）;DK8D電熱恒溫水槽（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;HGC24A型氮吹濃縮儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）;Agilent 7890B/5977B型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）。甲醇（色譜純，德國Merck公司）;甲氧胺鹽酸鹽（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，F(xiàn)1601013）;吡啶（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）;N，O雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（含三甲基氯硅烷）（87VMHMM，東京化成工業(yè)株式會社）;正庚烷（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）;超純水。

1.2方法

1.2.1動物分組aP2nSREBP1c轉(zhuǎn)基因小鼠是C57BL/6J和SJL背景的雜合子個體，參照J(rèn)ackson實驗室基因型鑒定方法鑒定轉(zhuǎn)基因型和野生型，根據(jù)基因型把小鼠分為WT組和TG組。

1.2.2檢測指標(biāo)與方法

1）脂肪組織形態(tài)觀察：經(jīng)乙醚麻醉側(cè)眼底靜脈叢取血后處死小鼠，迅速分離脂肪組織，置于4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋，切片，HE染色，進(jìn)行病理形態(tài)觀察分析。

2）血漿樣品獲取與前處理：10周齡小鼠12 h禁食后經(jīng)乙醚麻醉，側(cè)眼底靜脈叢取血，肝素鈉抗凝，離心（3 000 r/min，4 ℃，15 min）取血漿。吸取50 μL新鮮血漿于離心管中，加入200 μL甲醇沉淀蛋白質(zhì)，渦旋混勻1 min，離心10 min（15 000 r/min，4 ℃），取上清液200 μL氮氣吹干。加入20 mg/mL甲氧胺吡啶溶液50 μL，混勻，在70 ℃下肟化1 h。加入50 μL BSTFA（含1%TMCS），在70 ℃水浴下衍生化1 h。加入50 μL正庚烷，渦旋混勻后離心移取上清至微量進(jìn)樣管，待GCMS分析。

3）測定條件：色譜柱：HP5MS（60 m×250 μm×0.25 μm）;進(jìn)樣量：1 μL;進(jìn)樣口溫度：260 ℃;進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣。升溫程序：起始溫度60 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至100 ℃，保持5 min，以15 ℃/min升至170 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至210 ℃保持2 min，以15 ℃/min升至350 ℃保持3 min。電離方式：EI;電子轟擊能量：70eV;離子源溫度：230 ℃;四級桿溫度：150 ℃;溶劑延遲：11 min。

4）數(shù)據(jù)處理及差異代謝物篩選：使用GCMS聯(lián)用儀對血漿樣品進(jìn)行檢測分析，經(jīng)過積分后利用美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)局化學(xué)數(shù)據(jù)庫（NIST）進(jìn)行化合物比對。將比對后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入MetaboAnalyst（https：//www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/）在線分析網(wǎng)站，采用無監(jiān)督模式識別的主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）觀察各組分分離趨勢，根據(jù)倍數(shù)變化>1.5和P<0.05篩選差異代謝物[12]，以匹配分?jǐn)?shù)大于80的鑒定結(jié)果作為可信結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS軟件對樣本進(jìn)行統(tǒng)計分析，2組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用MetaboAnalyst進(jìn)行代謝通路富集分析，鑒別出2組間差異顯著的代謝通路。

2結(jié)果

2.1表型評價白色脂肪病理切片觀察HE染色中，細(xì)胞質(zhì)的脂肪被溶解呈空泡狀，細(xì)胞核位于細(xì)胞一側(cè)。與野生型（WT）小鼠比較aP2nSREBP1c轉(zhuǎn)基因（TG）小鼠白色脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴較少且體積較小。TG小鼠白色脂肪呈萎縮狀態(tài)。見圖1。

2.2血漿非靶向代謝組學(xué)TIC圖采用GCMS技術(shù)對小鼠血漿進(jìn)行分析，得到血漿代謝物的總離子流圖，從中得到樣品的化合物信息，質(zhì)譜信息，離子豐度等。結(jié)果顯示2組樣本多數(shù)代謝物的出峰時間集中在12～37 min，但在峰信號和峰數(shù)目上存在差別，TG組的峰信號明顯強于WT組，表明2組的血漿代謝輪廓存在一定差異。見圖2。

2.3主成分分析（PCA）PCA分析是一種無監(jiān)督模式識別的多元變量統(tǒng)計分析方法，可以通過降維的方式，反映出高維數(shù)據(jù)樣本之間的差異。結(jié)果如圖3所示，PCA得分圖上WT與TG樣本點分散于不同區(qū)域，說明正常WT小鼠與TG小鼠血漿內(nèi)源性代謝物具有差異。

2.4差異代謝物的篩選結(jié)果本研究共篩選出11種差異代謝產(chǎn)物，與WT比較，TG組中乳酸、L纈氨酸、3羥基丁酸、尿素、d半乳糖、D阿洛糖、硬脂酸、棕櫚酸、肌醇、油酸、11十八碳烯酸含量增加。見表1、圖4。

2.5代謝產(chǎn)物通路分析將11種差異代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst進(jìn)行在線數(shù)據(jù)處理分析。圖中每個圓圈對應(yīng)相關(guān)的通路，圓圈的著色代表代謝物在數(shù)據(jù)中具有不同程度的顯著性，著色越深，差異越大;反之，差異越小。根據(jù)通路影響值（pathway impact>0.1）得到：纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，丙酮酸代謝，磷酸肌醇代謝，共3條與脂肪萎縮相關(guān)的代謝通路。見圖5。

3討論

實驗以aP2nSREBP1c轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對象，應(yīng)用GCMS技術(shù)對血漿樣本進(jìn)行代謝組學(xué)研究，共篩選出11個差異代謝物（包括氨基酸、脂肪酸、糖）。這些代謝物在脂肪萎縮小鼠血漿中顯著上調(diào)，表明小鼠體內(nèi)發(fā)生了代謝紊亂。通路富集表明差異代謝物在體內(nèi)主要涉及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，丙酮酸代謝，磷酸肌醇代謝途徑。

纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成屬于支鏈氨基酸（Branched Chain Amino Acids，BCAA）的生物合成途徑。BCAA是一種特殊的必需氨基酸。研究認(rèn)為，BCAA能夠激活雷帕霉素（the Mammalian Target of Rapamycinm，mTOR）靶點引起胰島素抵抗[1314]。機體中BCAA缺乏時，白色脂肪內(nèi)硬脂酰輔酶a、脂肪酸合酶均被抑制，棕色脂肪組織內(nèi)解耦聯(lián)蛋白1表達(dá)水平增加，產(chǎn)熱耗能增強，脂肪含量快速減少，機體呈現(xiàn)消耗表型[1516]。此外，BCAA被證明可以通過mTOR信號在下丘腦的水平上調(diào)節(jié)脂肪的瘦素分泌和食物攝入[17]。本研究中纈氨酸在轉(zhuǎn)基因小鼠中的血漿代謝水平顯著升高，這可能與小鼠脂肪因子信號通路受損相關(guān)[18]。

肌醇參與了磷酸肌醇的代謝途徑。肌醇是許多二級信使的前體分子，由葡萄糖合成，是磷脂酰肌醇的組成部分。在胰島素發(fā)揮作用的過程中，磷脂酰肌醇是重要的遞質(zhì)，參與多種信號的傳遞。乳酸參與丙酮酸代謝途徑。丙酮酸作為物質(zhì)代謝的重要中間體，可通過三羧酸循環(huán)實現(xiàn)體內(nèi)糖、脂肪和氨基酸的相互轉(zhuǎn)化，是三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝聯(lián)系的樞紐。與酮體代謝相關(guān)的3羥基丁酸，與脂肪酸代謝相關(guān)的硬脂酸、油酸、棕櫚酸、11十八碳烯酸，與糖代謝相關(guān)的d半乳糖、D阿洛糖、與蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的尿素，血漿代謝水平升高。提示脂肪萎縮可能導(dǎo)致機體的糖脂代謝紊亂，能量代謝異常問題。

脂肪組織不僅是能量儲備器官，它還是一個具有多種內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌功能的內(nèi)分泌器官，脂肪組織通過分泌多種激素及信號調(diào)節(jié)分子，與胰腺、肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等進(jìn)行器官對話[19]。過量的脂肪累積或組織萎縮都將影響全身的代謝。本研究使用的代謝組學(xué)技術(shù)有助于系統(tǒng)了解機體總的病理生理過程，契合中醫(yī)學(xué)“整體觀念，辨證論治”理論。通過該技術(shù)分析脂肪萎縮小鼠的差異代謝物變化及其代謝途徑，能一定程度上反映脂肪萎縮小鼠代謝水平變化，將為闡明糖脂代謝性疾病的發(fā)病機制，研發(fā)該病中醫(yī)藥/中西醫(yī)結(jié)合防治策略和創(chuàng)新藥物，提供代謝組學(xué)的實驗依據(jù)。

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（2018-12-10收稿責(zé)任編輯：王楊）