虎杖-乳香的有效組分配伍對慢性非細菌性前列腺炎NOD小鼠的藥效學評價研究

高瑞松 劉慧英 田雪飛 滕永杰 賀勇凱 王帥 熊偉 林群芳 周青

[摘要]目的探討大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油配伍對非肥胖性糖尿（non-obese diabetic，NOD）小鼠慢性非細菌性前列腺炎發(fā)揮治療作用的最佳配比。方法正常雄性NOD小鼠220只，按照L8（2⁷）正交表隨機分為8組，另設立陽性對照組、模型組、空白對照組，共11組，每組20只。按組別給予相應干預，酶聯(lián)免疫吸附法（cnzyme-labeled immunosorbent assay，ELISA）檢測NOD小鼠前列腺組織勻漿中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-αTNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，lL-1β）、白介素-6（interleukin-6.1L-6）、白介素-10（interleukin-10.IL-10）含量的變化，并結合蘇木素-伊紅（haematoxylin-eosin，HE）染色法評價前列腺組織病理改變程度，明確大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油的最佳配比與量效關系。結果正交實驗極差結果顯示各因素影響強弱依次為虎杖苷>大黃素>乳香揮發(fā)油，方差分析結果發(fā)現(xiàn)虎杖苷、大黃素、乳香揮發(fā)油對療效的影響具有統(tǒng)計學意義（P<0.01.P<0.05）。大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油的最佳配比為大黃素0.1g/kg虎杖苷04g/kg乳香揮發(fā)油0.4g/kg。結論大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油的最優(yōu)比例配伍具有減輕慢性非細菌性前列腺炎動物模型炎癥的療效，乳香揮發(fā)油與虎杖苷之間具有協(xié)同作用。

[關鍵詞]大黃素;虎杖苷;乳香揮發(fā)油;前列腺炎

[中圖分類號]R285.5;R697+，33[文獻標志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.11.004

血-前列腺屏障系統(tǒng)是臨床治療慢性前列腺炎效果欠佳的重要原因。前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)乳香可促進虎杖等清熱利濕藥對慢性前列腺炎大鼠前列腺組織炎性細胞浸潤程度的改善及腺上皮結構修復的功效。臨床研究也表明，配伍了芳香開竅中藥的加味虎杖散治療男性慢性前列腺炎效果佳。進一步的研究表明，乳香可增加前列腺上皮細胞的通透性，調(diào)節(jié)屏障相關的細胞連接蛋白ZO-1、Claudins蛋白表達的作用，并且不同劑量的乳香對蛋白表達的影響具有差異性。因此我們推測乳香、虎杖的最優(yōu)化劑量配伍，可進一步提高藥物對慢性前列腺炎的治療效果。而中藥乳香、虎杖的主要抗炎成分是乳香揮發(fā)油、大黃素和虎杖苷等。為此，我們采用正交設計方法對3種有效成分進行了治療慢性前列腺炎NOD小鼠的藥效學評價研究，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康SPF級非肥胖性糖尿（non-obese diabetic，NOD）小鼠220只，雄性，6周齡，體質(zhì)量20-30g;SPF級SD大鼠4只，雄性，體質(zhì)量240-300g，由中南大學實驗動物學部提供許可證號：SCXK（湘）[2016-0002]。

1.1.2主要試劑 百白破疫苗（批號：201611068-2）購自湖南省疾病預控制中心：大黃素（批號：20180207384）：虎杖苷（批號：20180417159），質(zhì)量分數(shù)均為98%，均來自北京索萊寶科技有限公司：乳香購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科：塞來昔布（規(guī)格200mg/粒，瑞輝制藥有限公司）：CFA完全弗氏佐劑購自美國Sigma公司;BCA蛋白定量試劑盒購自中國北京康為世紀生物科技有限公司。

1.1.3主要儀器 352型酶標儀（Labsystems Multi-skan MS，芬蘭）;AC8洗板機（Thermo Labsystems，芬蘭）。

1.2實驗方法

1.2.1模型制備 參照文獻方法制備前列腺組織抗原。取雄性SD大鼠4只，處死后分離前列腺組織，剪碎后加入含0.5%TritonX-100及蛋白酶抑制劑的PBS中置冰上勻漿，10000r/min 4℃離心10min，取上清液。BCA法測定蛋白含量后，蛋白提純液用PBS溶液稀釋至1.0mg/mL濃度，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。參照文獻方法制備NOD小鼠慢性非細菌性前列腺炎模型：前列腺蛋白提純液按1：1加入CFA完全弗氏佐劑乳化，第0天和第15天進行NOD小鼠的多點皮下注射（每點注射0.5mL，左腳墊、右腳墊、尾根部基部、左肩胛、右肩胛），同時腹腔注射百白破疫苗0.1mL。第21天時每組處死2只NOD小鼠，分離前列腺組織，經(jīng)病理學驗證，間質(zhì)及腺腔內(nèi)可見明顯的中性粒細胞浸潤，腺腔內(nèi)有大量脫落細胞及少量炎性細胞，造模成功。

1.2.2藥物制備 按照2010年版《中華人民共和國藥典》附錄XD中水蒸氣蒸餾法提取乳香揮發(fā)油。大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油配伍混懸液臨用前配制，按組別要求以0.5%的羧甲基纖維素鈉為助溶劑配制大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油的配伍混懸液，并在室溫下充分攪拌30min以上。

1.2.3三因素二水平正交設計 將中藥有效成分大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油分別按照不同比例配伍，通過采用3因素即A大黃素、B虎杖苷、C乳香揮發(fā)油，2水平即低、高2個劑量的正交表L8（2⁷）進行設計，主要考察A、B、C三個因素在治療慢性前列腺炎療效中的主次作用，同時考慮乳香揮發(fā)油分別與大黃素、虎杖苷之間的一級交互作用，對虎杖一乳香有效成分配伍進行優(yōu)選。優(yōu)選結果為8組藥物濃度：分別為A₁B₁C₁（正交1組）、A₁B₁C₂（正交2組）、A₁B₂C₁（正交3組）、A₁B₂C₂（正交4組）、A₂B₁C₁（正交5組）、A₂B₁C₂（正交6組）、A₂B₂C₁（正交7組）、A₂B₂C₂（正交8組）。見表1。

1.2.4動物分組及干預 正常雄性NOD小鼠220只，隨機分為11組：按照L8（2⁷）正交表分8組（正交1組-正交8組），分別予以相應干預措施，并設立陽性對照組、模型組、空白對照組，每組20只。大量臨床及文獻驗證塞來昔布作為目前治療慢性前列腺炎的西藥療效確切，因此，本實驗選擇塞來昔布為陽性對照藥。根據(jù)人和動物體表面積換算方法，陽性對照組給予塞來昔布0.02g/kg，空白對照組及模型組給予等容量蒸餾水灌胃。抗原注射22d時開始灌胃，連續(xù)灌胃14d后處死，分離前列腺組織置-80℃冰箱保存待測。

1.2.5檢測指標 （1）病理學HE染色：NOD小鼠前列腺組織HE染色后光鏡下觀察病理學改變及炎癥浸潤情況，根據(jù)前列腺炎組織學診斷標準，病理學分級標準制定病變情況分級標準，通過等級資料分析判定病變程度;（2）炎癥因子檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA法，檢測NOD小鼠前列腺組織勻漿中炎癥因子、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-10（inter-leukin-10，IL-10）的含量變化。

1.3統(tǒng)計處理

等級資料采取秩和檢驗，計量資料用“x±s”表示，組間比較若滿足正態(tài)性及方差齊性則采用成組t檢驗，若不滿足則采用秩和檢驗，通過正交極差分析、方差分析法對實驗結果進行統(tǒng)計學分析。以P<0.05為有差異統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1前列腺組織病理學檢測

空白組前列腺組織腺體分布及腺泡形態(tài)數(shù)量正常，未見炎細胞浸潤：模型組前列腺組織腺泡數(shù)量減少，凝固體少見，腺上皮局灶性壞死脫落，腺腔內(nèi)有大量炎性細胞及脫落的腺上皮細胞，間質(zhì)內(nèi)可見較多中性粒細胞細胞浸潤：陽性對照組前列腺腺體分布及排列基本正常，間質(zhì)輕度增生，可見少量炎細胞浸潤。正交1-8組：正交2、4、6、8組腺體分布及排列基本正常，可見少量中性粒細胞浸潤：正交3、5、7組腺腔分泌物內(nèi)見少量脫落細胞及腺上皮脫落，間質(zhì)內(nèi)輕度中性粒細胞浸潤：正交1組間質(zhì)內(nèi)可見明顯的中性粒細胞浸潤，腺腔內(nèi)有大量脫落細胞及少量炎性細胞。

2.2各組NOD小鼠前列腺組織病變程度比較

參照前列腺炎組織診斷標準和病理學分級標準進行評分和計數(shù)，根據(jù)秩均值排序?qū)Ω鹘MNOD小鼠前列腺組織病變程度進行分級并評價。方差分析結果顯示差異有統(tǒng)計學意義（x²=158.466.P=0.000），根據(jù)秩均值排序，發(fā)現(xiàn)正交8組及陽性對照組NOD小鼠前列腺組織病變程度低于模型組，陽性對照組及正交2、4、6組的炎癥程度相對較低，秩均值較低，空白組前列腺組織無病變，秩均值最高。結果見表2。

2.3正交試驗結果分析

2.3.1直觀分析 我們采用ELISA法檢測了各組前列腺組織勻漿中炎癥因子IL-1B、IL-10、IL-6、TNF-α含量變化。結果顯示，各因素對IL-1B、IL-10、IL-6、TNF-α影響的順序為虎杖苷>大黃素>乳香揮發(fā)油，最佳配比方案為A₁B₂C₂，數(shù)據(jù)結果顯示，低劑量的大黃素有抗炎效果，而高劑量的大黃素反而炎癥控制不佳，故大黃素優(yōu)選出1水平：使用高劑量的虎杖苷能促進療效，使炎癥水平降低，故優(yōu)選出虎杖苷2水平。根據(jù)炎癥因子IL-1B、IL-10、IL-6、TNF-α含量，將各正交組分別與模型組、陽性對照組進行組間比較分析，結果顯示正交2、4、6、8組及陽性對照組與模型組相比較，組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05.P<0.01）。結果發(fā)現(xiàn)：（1）正交2.4.6.8組均為乳香揮發(fā)油高劑量組（P<0.05，P<0.01），說明高劑量乳香揮發(fā)油對炎癥水平調(diào)控更優(yōu)：（2）高劑量水平的虎杖苷顯示出更強的改善炎癥狀態(tài)的作用;（3）正交5、6、7、8組均含有高劑量大黃素，與模型組進行組間比較，其中正交5、7組P值均大于0.05.說明治療效果不明顯：而正交6、8組包含有高劑量乳香揮發(fā)油，與模型組進行組間比較，其P值均小于0.01.說明療效良好。以上結果顯示高劑量大黃素反而加重炎癥反應，增加炎癥因子的含量，而高劑量大黃素在高劑量乳香揮發(fā)油的拮抗作用下，可提高中藥抗炎作用。結果見表3、表4。

2.3.2方差分析 未考慮交互作用的前提下，方差分析結果顯示，各因素影響大小順序：虎杖苷>大黃素>乳香揮發(fā)油。說明因素A與因素B的含量高低對炎癥因子的含量變化具有更直接的影響。見表5。

2.3.3交互作用分析 綜合乳香揮發(fā)油與大黃素、乳香揮發(fā)油與虎杖苷之間的交互作用，通過分析4個觀察指標值，通過四格表計算，發(fā)現(xiàn)（B+C）效應大于B和C單用效應，故二者合用存在協(xié)同作用;（A+C）效應小于A和C單用效應，故二者合用存在拮抗作用。分析結果說明，因素C乳香揮發(fā)油與因素B虎杖苷間具有協(xié)同交互作用，提示乳香揮發(fā)油能促進虎杖苷療效：因素C乳香揮發(fā)油與因素A大黃素間具有拮抗交互作用，提示乳香揮發(fā)油能抑制高劑量大黃素副作用。同時BxC交互作用顯著，而AxC交互作用不顯著，提示因素C乳香揮發(fā)油與因素B虎杖苷的交互作用對炎癥因子水平的影響顯著。見表6。

3討論

中醫(yī)藥治療慢性前列腺炎具有一定優(yōu)勢，如何進一步提高中醫(yī)藥治療慢性前列腺炎的療效，是臨床研究者們一直關注的問題。根據(jù)慢性前列腺炎“敗精瘀阻”的中醫(yī)病機，結合前列腺特殊的組織結構及屏障功能特點，圍繞“不通”的病理本質(zhì)，我們將芳香開竅藥物用于促進慢性前列腺炎的中藥治療方案中，取得了很好的療效，并發(fā)現(xiàn)芳香開竅藥乳香促進前列腺上皮屏障通透性可提高虎杖的療效。為了探討芳香開竅藥物促進清熱利濕藥物配伍規(guī)律的物質(zhì)基礎，我們進一步對乳香及虎杖主要的有效活性成分進行了分析與研究，通過正交設計對他們的最佳配伍模式進行了探討。

虎杖中的主要有效成分包括蒽醌類和芪類，其中具有抗炎作用的主要成分有大黃素、虎杖苷。據(jù)報道，虎杖中的蒽醌類組分大黃素具有抗菌消炎、抗腫瘤、免疫抑制等藥理作用。其中抗炎抗氧化作用在慢性前列腺炎的治療中具有更重要的意義。在對抗局部急性炎癥時，大黃素能發(fā)揮強有力的作用，對核轉錄因子和黏附分子的表達有明顯的抑制作用，因此，可治療多種炎癥，并可通過抑制巨噬細胞分泌TNF-α來抑制過度的炎癥反應，還能抑制由內(nèi)毒素誘導的TNF-α、IL-10、IL-6、IL-8等炎癥細胞因子的分泌，對免疫激活機制進行影響。而虎杖苷可通過抑制炎癥介質(zhì)釋放，降低TNF-α、IL-6等含量發(fā)揮抗炎作用。

本研究組前期研究充分證明了虎杖治療慢性前列腺炎的有效性以及芳香開竅藥乳香等的促前列腺上皮屏障通透性提高虎杖療效的作用。本研究中，我們選擇了虎杖中的有效成分大黃素、虎杖苷作為研究因素，并與乳香揮發(fā)油進行組合來探討虎杖、乳香中有效成分治療慢性前列腺炎的配伍規(guī)律，通過綜合分析各治療組NOD小鼠模型前列腺組織病理及組織勻漿中丁NFF-α、IL-1B、IL-6、IL-10水平變化，發(fā)現(xiàn)虎杖、乳香的有效成分配伍具有良好的控制炎癥作用。直觀分析及方差分析表明，大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油三因素最佳配比水平為A₁B₂C₂，即大黃素為1水平0.1g/kg、虎杖苷為2水平0.4g/kg、乳香揮發(fā)油為2水平0.4g/kg療效更好。此外還發(fā)現(xiàn)，高劑量大黃素使用反而加重炎癥反應，我們推測可能源于大黃素具有瀉下作用，與過用傷正氣，反而造成免疫紊亂，加重炎癥反應有關。虎杖苷的作用相對溫和，對炎癥反應的調(diào)控表現(xiàn)出劑量依賴性，高劑量水平的虎杖苷顯示出更強的炎癥改善作用。

三因素大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油，對NOD小鼠慢性非細菌性前列腺炎治療作用的影響大小順序為虎杖苷>大黃素>乳香揮發(fā)油，提示在治療中發(fā)揮最主要作用是虎杖苷。根據(jù)報道，無論在體內(nèi)還是體外，虎杖苷都能夠通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)炎癥因子的表達水平，例如通過阻斷TNF-α、IL-6和IL-1B的表達等方式，從而減輕細胞受到的炎癥損害，這跟本研究結果基本相一致。

通過考察三因素大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油之間的交互作用，發(fā)現(xiàn)乳香揮發(fā)油與虎杖苷之間具有協(xié)同作用，而與大黃素之間具有拮抗作用。乳香揮發(fā)油的這種作用，我們推測與其前列腺屏障相關蛋白的調(diào)節(jié)作用有關，可影響前列腺腺泡及上皮細胞連接的通透性，從而發(fā)揮與虎杖苷及大黃素之間的協(xié)同或拮抗作用。

綜上所述，中藥虎杖、乳香中有效成分大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油按優(yōu)化比例配伍使用具有改善NOD小鼠慢性前列腺炎模型前列腺組織炎癥狀態(tài)的作用。