海帶多糖抑制平滑肌細胞增殖及抗氧化活性研究

彭臻菲 李泳寧 魏碧娜 林碧珠

摘要：[目的]研究海帶多糖對HO誘導血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）增殖及胞內脂質過氧化物生成量的影響，為闡明海帶多糖對VSMC的作用機制奠定基礎。[方法]以HO為誘導劑建立體外VSMC增殖模型，通過四甲基偶氮唑鹽法和細胞形態(tài)觀察評價海帶多糖對HO誘導VSMC生長和增殖的影響，同時以丙二醛為指標考察海帶多糖對HO誘導VSMC胞內脂質過氧化物生成量的影響。[結果]以50umol·L-1HO為誘導劑建立VSMC體外增殖模型。四甲基偶氮唑鹽法測定結果表明海帶多糖對HO誘導VSMC增殖具有顯著抑制活性，最大增殖抑制率達到73.56%。細胞形態(tài)學觀察結果表明海帶多糖作用下HO誘導的VSMC生長狀態(tài)發(fā)生改變且細胞數量顯著減少。丙二醛檢測結果表明海帶多糖作用下VSMC胞內脂質過氧化物量顯著減少。[結論]海帶多糖能夠抑制HO誘導的VSMC增殖，且顯著降低VSMC胞內脂質過氧化物生成量。

關鍵詞：海帶多糖;血管平滑肌細胞;HO誘導;細胞增殖;脂質過氧化物

中圖分類號：P745文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）12-1457-06

0 引言

[研究意義]近年來，隨著社會經濟發(fā)展與人們生活水平提升，心血管疾病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已嚴重威脅人類健康。動脈粥樣硬化是心血管系統(tǒng)疾病中最常見的疾病之一，也是心血管疾病共同的病理基礎。積極預防和控制動脈粥樣硬化是預防心血管疾病、降低疾病發(fā)病率的重要手段。（前人研究進展）病理學研究結果表明，VSMC增殖是早期動脈粥樣硬化形成的始動環(huán)節(jié)之一，成為心血管疾病防治研究的重要靶細胞。同時，有研究發(fā)現，活性氧自由基（reactiveoxygenspecies，ROS）與VSMC增殖相關。血管緊張素Ⅱ、高糖等通過提高VSMC胞內ROS水平促進細胞增殖。抗氧化劑調控ROS介導信號通路抑制VSMC增殖。因此，以ROS清除劑篩選VSMC增殖抑制劑成為研究方向之一。[本研究切入點]海帶是我國東南沿海常見的經濟型養(yǎng)殖海藻，具有藥食同源性，在我國多部古代醫(yī)學典籍中均有記載其藥學功效。多糖是海帶主要的藥效學活性成分，動物學試驗研究結果表明，海帶多糖可有效降低試驗性大鼠血管脂質沉積，降低動脈粥樣硬化風險。本課題組前期研究發(fā)現海帶多糖具有清除超氧陰離子（O·）活性，且抑制堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）誘導VSMC增殖。已有研究發(fā)現HO通過調控O·導信號通路促進VSMC增殖。但是海帶多糖對VSMC增殖抑制活性與其抗氧化活性相關性研究未見相關報道。[擬解決的關鍵問題]因此，本課題以氧化劑HO為誘導劑建立VSMC體外增殖模型，研究海帶多糖對氧化劑誘導VSMC增殖及胞內過氧化物生成影響，為闡明海帶多糖對VSMC的作用機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1 原料

海帶多糖由本實驗室制備，多糖含量為87.2%;DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司;胎牛血清（FBS）購自杭州四季青;丙二醛（MDA）檢測試劑盒購自碧云天公司;二甲基亞砜（DMSO）、HO購自Sigma公司;動物細胞裂解液購自上海生工;MTT購自Biosharp公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2主要儀器設備

BCM-1000超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司;HERAcell 150i CO恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo公司;TGL-16M冷凍離心機，湖南湘儀;P10-Y超純水系統(tǒng)，科爾頓有限公司;M3酶標分析儀，美國MD公司;TS-100F倒置顯微鏡，日本尼康公司;UV-2600紫外-可見光分光光度計，日本島津公司。

1.3試驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng) VSMC由本實驗室制備。細胞培養(yǎng)及傳代：VSMC采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)。待細胞生長匯合后，吸棄培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)液，PBS緩沖液清洗細胞瓶，加入適量0.25%胰酶，37℃放置3min，倒置顯微鏡下觀察，待細胞呈懸浮，即加入完全培養(yǎng)液終止酶解反應。吸管反復輕輕吹打培養(yǎng)液以分散細胞團，取0.5mL細胞懸液接種于新的培養(yǎng)瓶內，補加新鮮的完全培養(yǎng)液至3mL。置于37℃、5%CO培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

1.3.2HO誘導VSMC增殖模型構建 取濃度為1×10個mL-1VSMC懸液接種96孔板，37℃、5%CO培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24h，待細胞完全貼壁后，用無血清的DMEM培養(yǎng)液37℃孵育8h。加入HO溶液于96孔板至終濃度為設定濃度，對照組用無血清DMEM代替HO。孵育至12h、24h、36h后加入MTT溶液（100ug·孔），孵育4h后，棄上清液，加入DMSO（200uL·孔）。振蕩混勻，于578nm下檢測吸光值。每個試驗組設定6孔平行孔。細胞增殖率計算公式：

式中：A為HO模型組吸光值;Ao為對照組吸光值。

1.3.3MTT法測定VSMC增殖取對數生長期細胞懸液（1×10個·mL）接種于96孔培養(yǎng)板中，200uL孔，待細胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)液，37℃、5%CO培養(yǎng)箱內靜置過夜培養(yǎng)。吸棄培養(yǎng)液，向96孔板內分別加入0.1、0.5、1.o mg·mL海帶多糖樣品，每個濃度樣品設置6個平行孔，HO模型組用DMEM代替多糖樣品。培養(yǎng)至設定時間后，向各孔分別加入HO，繼續(xù)孵育至設定時間，加入MTT溶液（100ug·孔），孵育4h后，棄上清液，加入DMSO（200uL·孔）。振蕩混勻，于578nm下檢測吸光值。細胞增殖抑制率計算公式：

式中：A為HO模型組的吸光值;A為海帶多糖試驗組吸光值。

1.3.4VSMC形態(tài)觀察 取對數生長期細胞懸液（1×10cells·mL）接種于6孔培養(yǎng)板中，1mE·孔，待細胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)液，37℃、5%CO培養(yǎng)箱內靜置過夜培養(yǎng)。吸棄培養(yǎng)液，向6孔板內分別加入0.5、1.0mg·mL海帶多糖樣品，每個濃度樣品設置3個平行孔，HO，模型組用DMEM代替多糖樣品。培養(yǎng)至設定時間后，向各孔分別加入HO，繼續(xù)孵育至設定時間后于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.3.5MDA含量測定按1.3.4方法處理細胞，待細胞經無血清培養(yǎng)液過夜饑餓處理后吸棄培養(yǎng)液，向6孔板內分別加入0.1、0.5、1.0mg·mL海帶多糖樣品，每個濃度樣品設置3個平行孔，HO模型組用DMEM代替多糖樣品。培養(yǎng)至設定時間后，向各孔分別加入HO，繼續(xù)孵育至設定時間后收集細胞，按碧云天MDA檢測試劑盒說明操作，于532nm下測定吸光值，并計算MDA含量。

1.3.6數據分析 數據均采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，均數±標準差表示，并對結果進行LSD-t檢驗。

2 結果與分析

2.1 HO誘導VSMC體外增殖模型的建立

本課題以HO為誘導劑建立VSMC體外增殖模型，結果如表1所示。在相同的HO濃度下，24h試驗組VSMC增殖率均高于12h和48h試驗組。而在HO相同作用時間下，VSMC增殖率均隨著HO濃度的增加呈先上升而后下降的趨勢。在HO濃度為10～100～rnol·L時，VSMC增殖率隨著HO濃度增高而增大。當時間為24h，HO濃度為50gmol·L時，VSMC增殖率達到142.54%，再增加HO濃度至100umol·L，其VSMC增殖率略有增加，但與50umol·L試驗組相比，差異并不顯著。而當HO濃度增加至150umol·L，其VSMC增殖率則有所下降?？梢姰擧O濃度增大至150lamol·L對VSMC具有細胞毒性，這與文獻報道一致。因此，本課題選擇HO誘導VSMC增殖處理濃度為50umol·L，作用時間為24h。

2.2 海帶多糖對VSMC增殖作用的影響

采用MTT法測定海帶多糖對VSMC增殖影響，結果見圖1所示。從圖1可以看出，海帶多糖預處理時間相同時，隨著海帶多糖預處理質量濃度的增加VSMC增殖抑制率增大，呈量效相關性。在相同海帶多糖預處理時間下，與海帶多糖預處理質量濃度為0.1mg·mL-1試驗組相比，海帶多糖預處理質量濃度為0.5mg·mL和1.0mg·mL試驗組VSMC增殖抑制率均顯著增高（P<0.05）。當海帶多糖預處理時間為12h時，質量濃度為1.0mg·mL海帶多糖預處理試驗組VSMC增殖抑制率為53.11%，是相同多糖預處理時間下0.1mg·mL海帶多糖預處理試驗組的5.72倍。由此可見，海帶多糖可抑制氧化劑HO誘導VSMC增殖。

同時，由圖l可以看出，當海帶多糖預處理質量濃度高于0.5mg·mL時，與多糖預處理時間12h試驗組相比，多糖預處理時間為24h和48h試驗組VSMC增殖抑制率均顯著增高（P<0.05），增殖抑制率均達到60%。其中，當海帶多糖預處理質量濃度為1.0mg·mL時，多糖預處理時間為24h試驗組VSMC增殖抑制率最大，達73.56%。因此，后續(xù)試驗選擇海帶多糖預處理時間為24h。

2.3 海帶多糖對VSMC形態(tài)影響

由圖2可知，HO模型組細胞透光性強，細胞邊緣模糊，細胞呈伸展的梭狀，且細胞密度大。海帶多糖預處理試驗組VSMC形態(tài)則出現顯著變化，0.5mg·mL海帶多糖預處理試驗組VSMC數目減少，且細胞胞質回縮，部分細胞呈圓形。1mg·mL海帶多糖預處理試驗組VSMC密度顯著降低，細胞邊緣清晰，細胞胞質回縮，鏡下可見大部分細胞呈圓形。由此可見，海帶多糖可引起VSMC生長形態(tài)改變，隨著海帶多糖預處理濃度的增高，VSMC數量顯著減少，且呈圓形的VSMC數量增多，表明海帶多糖預處理后VSMC形態(tài)發(fā)生顯著變化，使其增殖速度減慢。

2.4 海帶多糖對HO誘導VSMC胞內MDA生成的影響

研究發(fā)現，HO誘導VSMC胞內大量累積ROS可促進VSMC胞內一系列脂質過氧化產物的生成，進而誘導細胞釋放生長因子促使VSMC增殖，因此脂質過氧化物是評估VSMC胞內ROS水平的重要參數。本課題以MDA表征胞內脂質過氧化物生成量，結果如表2所示。

從表2中可以看出，與對照組相比，HO模型組MDA含量顯著提高，達到3.21umol·L，表明HO誘導VSMC胞內生成大量脂質過氧化物，ROS水平顯著提高，這是其誘導VSMC增殖的重要因素。而采用不同質量濃度海帶多糖進行預處理后，其VSMC胞內MDA生成量均有下降。當海帶多糖質量濃度達到1.0mg·mL時，VSMC胞內MDA生成量最低，僅為1.27umol-L，與HO模型組相比下降了60.44%。由此可見，VSMC胞內脂質過氧化物生成量隨著海帶多糖預處理濃度的增加而降低，呈量效相關陸，表明海帶多糖預處理后有效抑制VSMC胞內因HO誘導引起的ROS升高，提示海帶多糖對HO誘導VSMC增殖的抑制機制與調控VSMC胞內ROS水平相關。因此，后續(xù)試驗可進一步從分子水平探討海帶多糖對VSMC胞內ROS的調控機制，闡明海帶多糖對HO誘導VSMC增殖抑制機制。

3討論與結論

病理學研究發(fā)現，血管平滑肌細胞異常增殖是動脈粥樣硬化形成的始動環(huán)節(jié)，也是動脈粥樣硬化心血管疾病共同的病理基礎。研究發(fā)現抗動脈粥樣硬化活性物質西洛他唑通過阻斷VSMC胞內ERK1/2信號通路，抑制VSMC增殖。Bin等對動脈粥樣硬化形成分子機制研究發(fā)現，動脈粥樣硬化重要誘因氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導VSMC胞內轉錄因子KLF5表達，進而上調胞內微小RNA-29a表達水平，最終促進VSMC增殖而形成動脈粥樣硬化斑塊。細胞學研究發(fā)現，ROS水平增高激活VSMC胞內MAPK信號通路并促進VSMC增殖。Yang等研究結果表明高糖處理引起細胞ROS水平增高是其誘導VSMC增殖的主要因素。因此，胞內ROS水平增高是VSMC增殖的促進因子。

天然產物活性研究結果表明，海藻多糖具有顯著抗氧化活性，可有效降低胞內ROS水平。馬軍等研究發(fā)現海藻多糖具有自由基清除和抗脂質過氧化活性。楊運高等用大鼠紅細胞免疫功能缺陷模型研究海藻多糖對紅細胞免疫功能及自由基損傷的影響。試驗結果顯示，海藻多糖增強超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等還原性物質活性，并降低MDA含量，表明海藻多糖可降低大鼠體內ROS水平，是抗氧化劑的重要備選資源。海帶多糖是一種抗氧化活性顯著的海藻多糖，其對DPPH、羥自由基、超氧陰離子等自由基的清除活性顯著。張晴嵐等研究發(fā)現海帶多糖可改善大鼠血脂水平，提高一氧化氮濃度和一氧化氮合酶活性，抑制動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生和發(fā)展。本課題以HO為誘導劑建立VSMC增殖模型，評估海帶多糖作用下動脈粥樣硬化始動因子VSMC生長與脂質過氧化水平的相關性。結果表明，海帶多糖可抑制HO誘導VSMC增殖且呈量效相關性。而海帶多糖濃度與VSMC胞內MDA含量呈負相關性，可見海帶多糖緩解了VSMC胞內因HO誘導引起的ROS水平增高，表明海帶多糖抑制VSMC增殖與其抗氧化活性相關。因此，后續(xù)研究需進一步從ROS調控細胞增殖的MAPK通路上進一步探討海帶多糖對VSMC增殖的抑制機制，為深度開發(fā)海帶藥用價值奠定基礎。