芹菜素誘導(dǎo)膀胱癌5637細(xì)胞凋亡研究

謝楊春+鄧永誠+田黎

【摘 要】 目的：研究芹菜素對人膀胱癌5637細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法：采用20～80μmol/L 芹菜素處理5637細(xì)胞，MTT法檢測膀胱癌5637細(xì)胞增殖抑制率；細(xì)胞軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞成瘤能力的抑制效率；Hoechst 33258細(xì)胞核染色法觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果：芹菜素呈濃度依賴的抑制5637細(xì)胞的增殖；80μmol/L芹菜素處理組細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、染色質(zhì)凝集和核碎片化等典型的細(xì)胞凋亡特征；5637細(xì)胞的克隆形成能力隨著芹菜素濃度增加而顯著降低。結(jié)論：芹菜素能夠抑制人膀胱癌5637細(xì)胞的增殖，抑制5637的克隆形成，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】 芹菜素；膀胱癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

【中圖分類號】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）12-0047-03

Abstract：Objective To study the effects of apigenin on the apoptosis of human bladder cancer cell line 5637. Methods 5637 cells were cultured with different concentrations of apigenin， the MTT assay was used to evaluate the cell inhibition rates. Apoptosis of 5637 cells was observed under a fluorescence microscope using Hoechst 33258 staining， 5637 tumorigenicity was messaured by soft colony formation assay. Results Apigenin causes concentration-dependent inhibition of the proliferation of bladder cancer 5637 cells. 5637 cells treated with apigenin showed significant morphological changes of apoptosis， and the cell tumorigenicity was inhibited as apigenin concentration increased. Conclusion Apigenin can inhibit the proliferation and induce apoptosis of 5637 cells.

Keywords：Apigenin； Bladder cancer； Proliferation； Apoptosis

膀胱癌是最常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，其中移行細(xì)胞癌（Transitional Cell Carcinoma，TCC）占90%，又稱為尿路上皮癌，其中70%～85%的移行細(xì)胞癌為表淺性膀胱癌[1]。臨床中非肌層浸潤性膀胱癌的常用治療方法為經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)[2]。然而，經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)后的患者有50%～80%的復(fù)發(fā)，10%～25%的患者復(fù)發(fā)后發(fā)展為肌層浸潤性膀胱癌[3]。為了抑制膀胱腫瘤的復(fù)發(fā)及進(jìn)一步惡化，化療以及免疫治療被廣泛用于淺表性膀胱癌患者的術(shù)后治療中。較常用的膀胱內(nèi)化療及免疫治療的藥物包括順鉑、絲裂霉素 C、卡介苗以及干擾素-α[4-5]。這些方法雖然在一定程度上取得療效，但是通常給患者帶來不可逆轉(zhuǎn)的系統(tǒng)毒性以及嚴(yán)重的膀胱局部刺激，例如出血性膀胱炎等[6]。因此，尋求無毒副作用且有效的膀胱癌治療藥物十分迫切。

芹菜素（5，7，4′-三羥基黃酮，Apigenin， API），又稱芹黃素，是一種廣泛存在于多種水果和蔬菜中的黃酮類化合物，具有多方面的藥理作用[7-8]，以抗腫瘤作用最為突出。實(shí)驗(yàn)證明芹菜素在體外能夠顯著抑制多種類型的癌細(xì)胞的生長和誘導(dǎo)其凋亡，包括：宮頸癌[9]、卵巢癌[10]、結(jié)腸癌[11]、胃癌[12]等，而在膀胱癌中的作用研究鮮有報道。本實(shí)驗(yàn)觀察了芹菜素對人膀胱癌5637細(xì)胞的生長抑制以及誘導(dǎo)凋亡作用。

1 材料與細(xì)胞

1.1 試劑 芹菜素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號：22806）購自阿拉丁公司；MTT，低熔點(diǎn)瓊脂糖、二甲基亞砜（DMSO），蛋白酶抑制劑購自Sigma；Hoechst 33258，購置南京碧云天。RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）均購自GIBCO公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 人膀胱癌細(xì)胞株5637購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2、95% O2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT法檢測芹菜素對膀胱癌細(xì)胞5637增殖的影響 將5637細(xì)胞以3×103/孔接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度的芹菜素（20、40、80μmol/L），每孔100μl，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，同時以不加芹菜素為空白對照組培養(yǎng)72h 后，向每孔中加入5.0g/L的MTT 20μl繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，向每孔中加入DMSO 200μl溶解結(jié)晶體，置于搖床振蕩30min，至藍(lán)紫色顆粒完全溶解后，于酶標(biāo)儀490nm波長處測定每孔吸光度值（A），并計算細(xì)胞增殖率（%）=（藥物處理孔A值-空白孔A值）/（對照孔A值-空白孔A值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計算平均值。

2.2 Hoechst 33258 細(xì)胞核染色法觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變 將5637細(xì)胞以2×105/孔接種于6孔板中，80μmol/L芹菜素（以不加芹菜素為空白對照組）作用24h后，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗2次，迅即加入4%的多聚甲醛液固定10min后，吸去固定液，以PBS清洗1次，加入5.0mg/L的Hoechst 33258，染色10min，用PBS 清洗3次后，在Zeiss Axio Observer A1熒光倒置顯微鏡下以340nm 激發(fā)光觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)并隨機(jī)拍照。

2.3 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測芹菜素對5637克隆形成能力的影響 將1×103個5637細(xì)胞懸浮液1ml RPMI 1640 （0.3%低熔點(diǎn)瓊脂糖，10%FBS， 1%雙抗）并加入不同濃度的芹菜素（40、80μmol/L），接種于預(yù)處理的6孔板中，同時以不加芹菜素為空白對照組。6孔板預(yù)先放入1ml RPMI 1640 （0.6%低熔點(diǎn)瓊脂糖， 10%FBS， 1%雙抗）。培養(yǎng)3周以后，細(xì)胞克隆形成，采用0.01%結(jié)晶紫染色，觀察計數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P< 0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 芹菜素對5637細(xì)胞增殖的抑制作用 不同濃度芹菜素處理的細(xì)胞的增殖均受到不同程度的抑制，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。芹菜素對5637細(xì)胞增殖的抑制作用呈一定的濃度依賴性，采用不同濃度（20、40、60、80μmol/L）處理后，隨著濃度的增加，其抑制效果更明顯。見圖1。

3.2 芹菜素對5637細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用 不同濃度芹菜素處理的細(xì)胞克隆形成能力均受到嚴(yán)重的抑制，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。芹菜素對5637細(xì)胞的克隆形成能力的抑制作用呈一定的濃度依賴性，采用不同濃度（40、80μmol/L）芹菜素處理后，隨著濃度的增加，其抑制效果更明顯。見圖2。（圖2左圖為芹菜素對5637細(xì)胞克隆形成抑制作用的觀察；右圖為芹菜素對5637細(xì)胞克隆形成抑制作用的統(tǒng)計學(xué)分析。）

3.3 芹菜素誘導(dǎo)5637細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化 采用Hoechst 33258染色的細(xì)胞核結(jié)果顯示，80μmol/L芹菜素處理后，大量的5637細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、染色質(zhì)凝集和核碎片化等典型的細(xì)胞凋亡特征；與此相比，對照組的活細(xì)胞，細(xì)胞核膜完整，核呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布較均勻，細(xì)胞核為藍(lán)色均勻淡染，并未見凋亡細(xì)胞（圖3左圖為芹菜素對5637細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的細(xì)胞核形態(tài)觀察；右圖為芹菜素對5637細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的統(tǒng)計學(xué)分析）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明芹菜素可誘導(dǎo)5637細(xì)胞凋亡。

4 討論

芹菜素作為一種廣泛存在于植物中的天然黃酮類化合物，近年來已成為研究的熱點(diǎn)[13]，但有關(guān)芹菜素抗膀胱癌作用的實(shí)驗(yàn)研究比較少。逃逸了正常細(xì)胞增殖的調(diào)控體系而自主地?zé)o限生長是腫瘤細(xì)胞的典型特征。通過MTT實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20、40、60、80μmol/L芹菜素對人膀胱癌5637細(xì)胞的增殖能力具有顯著的抑制的作用，且隨著濃度的增加抑制效果更加明顯，呈現(xiàn)出良好的和量效關(guān)系。芹菜素抑制膀胱癌細(xì)胞增值的主要機(jī)制，可能與其直接抑制5637細(xì)胞生長，并誘導(dǎo)5637細(xì)胞凋亡等有關(guān)。

在有機(jī)體中，細(xì)胞凋亡是一個復(fù)雜的生理和病理過程，腫瘤的增值與凋亡是調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的最重要的因素之一。研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找抑制腫瘤細(xì)胞增值，增加腫瘤細(xì)胞凋亡的分子藥物，是抑制腫瘤生長，阻礙腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個重要途徑。我們通過Hoechst 33258細(xì)胞核染色結(jié)果顯示，80μmol/L芹菜素處理人膀胱癌5637細(xì)胞，大部分細(xì)胞細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、染色質(zhì)凝集和核碎片化等典型的細(xì)胞凋亡特征。腫瘤的自我更新能力是腫瘤細(xì)胞一個重要特征，我們采用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測芹菜素對膀胱癌5637細(xì)胞自我更新能力的影響[14]，結(jié)果顯示，40、80μmol/L芹菜素對人膀胱癌5637細(xì)胞的克隆形成能力具有顯著的抑制的作用，且隨著濃度的增加抑制效果更加明顯，呈現(xiàn)出良好的和量效關(guān)系。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)芹菜素作為一種植物提取的活性成分，能夠抑制人膀胱癌5637細(xì)胞的增殖以及克隆形成，并誘導(dǎo)其凋亡，芹菜素有望成為無毒副作用且有效的膀胱癌治療藥物。

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（收稿日期：2016.05.09）