西花薊馬幾丁質(zhì)合成酶UAP基因克隆及功能分析

陸承聰 李恒 張祥琴 王諒 陳藝欣 田厚軍 林碩 張潔 陳勇 魏輝

摘要：[目的]闡明幾丁質(zhì)合成通路中的關(guān)鍵基因UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（UDPN-acetylglucosaminepyrophosphorylases，UAP）對西花薊馬Frankliniella occidentalis生長發(fā)育的影響。[方法]基于西花薊馬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆驗證了UAP基因的開放閱讀框（openReadingFrame，ORF）全長序列，命名為FoccUAP。利用RT-qPCR方法分析FoccUAP在各個組織和不同齡期的表達情況。最后通過向西花薊馬蛻皮24h的2齡若蟲顯微注射dsUAP，檢測沉默效率，觀察其對西花薊馬生長發(fā)育的影響。[結(jié)果]FoccUAP基因開放閱讀框全長1545bp，編碼514個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為56.738kDa，具有Glyoo-tmnf-GTA-typcSuperfamily家族的保守結(jié)構(gòu)域，與等翅目、蜚蠊目、直翅目和半翅目昆蟲的UAP基因親緣關(guān)系較近。FoccUAP基因在西花薊馬各個組織都有表達，在頭部和腹部相對表達量最高，觸角、胸部和足相對表達量較低。該基因在蟲體生長發(fā)育的各個階段均有表達，其中2齡幼蟲、蛹以及羽化后24、48、168、240h的成蟲表達量分別是1齡幼蟲的1.30、2.50、1.56、2.0、2.43和2.56倍。RNAi結(jié)果表明，注射dsUAP的西花薊馬羽化率（36.3%）和注射后120h的存活率（5.0%）均顯著低于dsGFP對照組，且注射dsUAP的西花薊馬成蟲出現(xiàn)翅膀發(fā)育不完整、胸腹部皺縮不規(guī)則等畸形現(xiàn)象。[結(jié)論]FoccUAP基因?qū)ξ骰ㄋE馬生長發(fā)育具有重要的作用。

關(guān)鍵詞：西花薊馬;UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶;幾丁質(zhì)合成;RNAi

中圖分類號：S435文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）12-1419-07

0 引言

[研究意義]西花薊馬Frankliniella occidentalis，屬于纓翅目Thysanoptera，薊馬科Thripidae，是全球性的重要害蟲之一，主要通過直接取食以及間接傳播病毒病對250多種農(nóng)作物、花卉、蔬菜和樹木造成危害。2003年6月在我國大陸首次發(fā)現(xiàn)該蟲，2004年后在北京和云南等地造成嚴重危害，是一種危險性入侵生物。目前，國內(nèi)外主要采用化學(xué)藥劑來防治薊馬，但由于人們長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致昆蟲抗藥性增強和化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境污染日益嚴重。幾丁質(zhì)是自然界中存在最普遍的氨基多糖，主要存在于真菌、線蟲和節(jié)肢動物中。幾丁質(zhì)是昆蟲表皮、體內(nèi)組織基底膜和消化道圍食膜的主要成分，對昆蟲的形態(tài)構(gòu)建及生命活動具有重要的作用。由于幾丁質(zhì)在昆蟲生長發(fā)育過程起著關(guān)鍵性的作用，同時人類和高等動物不具備幾丁質(zhì)代謝系統(tǒng)的特性，因此，開展幾丁質(zhì)合成途徑相關(guān)基因研究具有重要的理論意義與潛在應(yīng)用價值。（前人研究進展）昆蟲發(fā)育必須經(jīng)歷周期性脫皮和合成新皮的過程，這一過程伴隨著幾丁質(zhì)的合成和降解。昆蟲幾丁質(zhì)的合成過程非常復(fù)雜，目前發(fā)現(xiàn)有8種酶共同參與其中：海藻糖酶（Trehalase）、己糖激酶（hexokinase）、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（glucose-6-phosphateisomerase）、谷氨酸鹽：果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶（glutamine：fructose-6-phosphate AminotransferasC）、葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（glucosamine-6-phosphate-N-acetyltr-ansferase）、磷酸乙酰氨基葡萄糖變位酶（phosphoacetyl-glucosamine mutasC）、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase）和幾丁質(zhì)合成酶（chitin synthase）。其中某一個過程受阻就會造成幾丁質(zhì)合成困難，導(dǎo)致昆蟲因缺少幾丁質(zhì)而不能存活。UDP-N-acetylglucosaminepyrophosphorylase（UAP）作為幾丁質(zhì)合成途徑上的關(guān)鍵酶之一，其功能在黑腹果蠅Drosophila melanogaster、埃及伊蚊Aedesaegypti、家蠶Bombyxmori、赤擬谷盜Tribolium-caslaneum、甜菜夜蛾Jpodopteraexigua等真核生物中得到了研究。對真核生物和原核生物的UAP進行比較，發(fā)現(xiàn)UAP基因的氨基酸序列并不相似，但有一個相同L/MX2GXIGTX6PK氨基酸結(jié)構(gòu)域。通過對赤擬谷盜的TeUAP靶基因進行RNA干擾，發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜由于幾丁質(zhì)合成量不足而導(dǎo)致死亡。RNA干擾甜菜夜蛾5齡第一天的幼蟲SeUAP基因，會導(dǎo)致部分甜菜夜蛾出現(xiàn)蛹期畸形及死亡。同樣的結(jié)論也出現(xiàn)在對果蠅突變體的研究中，果蠅的DmUAP基因突變體存在許多缺陷，主要是角質(zhì)層和氣管形態(tài)的缺陷，導(dǎo)致缺陷的原因主要是幾丁質(zhì)含量的減少。[本研究切入點]幾丁質(zhì)對昆蟲生長發(fā)育具有極其重要的意義，基于昆蟲幾丁質(zhì)代謝途徑開發(fā)環(huán)境友好型的殺蟲劑成為植物保護領(lǐng)域的研究熱點。然而，目前國內(nèi)外關(guān)于薊馬UAP的功能研究尚未見報道。[擬解決的關(guān)鍵問題]在西花薊馬基因組與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，本研究對西花薊馬UAP基因進行克隆、鑒定，利用實時熒光定量PCR法研究該基因在西花薊馬生長發(fā)育過程中的表達模式，并利用RNAi技術(shù)，觀察該基因?qū)ξ骰ㄋE馬生長發(fā)育的影響，為進一步探討西花薊馬UAP的生理功能提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

西花薊馬由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所提供，用四季豆飼養(yǎng)于人工氣候箱（MGC-350HP-2，上海一恒科技有限公司）。飼養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，相對濕度60%～70%，光照L：D=14：10h。

1.2 西花薊馬UAP-ORF的克隆鑒定

在西花薊馬基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，獲得了FoccUAP基因開放閱讀框序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計全長引物（表1）。西花薊馬總RNA的提取采用Trizol（Invitrogen公司）法，總RNA用EasyScrlptReverse Transcrlptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物科技有限公司）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此作為PCR模板擴增FoccUAP開放閱讀框。PCR體系為20uL：2uL 10×Taq Buffer，2uL dNTPs（2.5mmol·L），1uL cDNA模板，上下游引物各0.5uL（10umol·L），0.5uL Taq酶，用ddHO補齊至20uL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min;95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1mm，反應(yīng)35個循環(huán);最后72℃延伸10min。取5uL PCR產(chǎn)物，加1uL 6×loadingbuffer混合上樣，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。片段純化回收后用5uL與pEASY -T1Cloning Kit載體（北京全式金生物科技有限公司）連接，轉(zhuǎn)化后挑選陽性克隆子送福州鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。

1.3FoccUAP序列特性及系統(tǒng)進化樹分析

使用DNA star軟件將克隆獲得的DNA序列翻譯成蛋白質(zhì)序列;使用NCBIBlastx進行氨基酸序列同源性比對，使用在線工具ExPASy（http：//web.Expasy.org/protparam）對蛋白質(zhì)的分子量、等電點等進行預(yù)測，采用SignalP 5.0（http：//www.cbs.dm.dk/services/SignalP/）進行信號肽的預(yù)測，使用Conserved domams（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Stmcture/lexington/lexington.cgi？cmd=rps）預(yù)測FoccUAP的保守結(jié)構(gòu)域等。

經(jīng)過BLAST同源比對，從NCBI網(wǎng)站（https：www.Ncbi.Nlm.nih.gov）分別選取半翅目、雙翅目、等翅目、鞘翅目等共28個物種的昆蟲幾丁質(zhì)合成酶UAP序列，與本研究克隆的FoccUAP序列進行進化樹分析。使用MEGA7軟件Neighbor Jommg方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.4FoccUAP的時空表達

組織表達選取羽化24h的成蟲300頭，在PBS緩沖液中解剖出觸角、頭、胸、腹、足;時間表達選取蛻皮24h的1齡若蟲、2齡若蟲、蛹和羽化24、48、168、240h的成蟲各100只。Trizol法提取西花薊馬的總RNA，然后用EasyScrlpt ReverseTranscriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物科技有限公司）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)序列信息設(shè)計熒光定量特異性引物（表1），同時以西花薊馬的β-actin基因（GenBank登錄號：XM 026432071.1）作為內(nèi)參（表1）。分別以FoccUAP基因在腹部和1齡幼蟲的表達量作為組織表達和時間表達的標準參量。每組樣品重復(fù)3次。試驗采用2的方法汁算FoccUAP基因的相對表達量。熒光定量PCR采用20uL體系：SYBR預(yù)混液（TakaRa）10uL，上下游引物（10gmol·L）各0.4uL，cDNA模板1uL，滅菌超純水8.2uL。PCR采用兩步法進行：95℃預(yù)變性30s;95℃變性5s，62℃退火15s，40次循環(huán)。

1.5 FoccUAP的dsRNA合成

根據(jù)已獲得的基因序列設(shè)計靶向FoccUAP的dsRNA干擾片段（dsUAP），同時根據(jù)綠色熒光蛋白序列設(shè)計用于對照的dsGFP片段（表1）。以PEASY-FoccUAP質(zhì)粒為模板，擴增特異性片段并回收，用HiScribe T7Quick High Yield RNA Synthesis Kit（NewEngland Biolabs）試劑盒合成dsRNA。體外轉(zhuǎn)錄體系為：ATP、GTP、UTP和CTP各2uL，T7RNAPolymerase Mix2uL，模板（DNA）1ug，10×Reactionbuffer 2uL，加RNase free water補至20uL，37℃反應(yīng)12h。最后在反應(yīng)體系加1uL DNase I（TakaRa），37℃ 30min除去DNA模板。合成的dsRNA梯度稀釋后使用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000（Thermo）進行質(zhì)量及濃度檢測，并保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6RNAi注射試驗及表型觀察

利用油壓式手動微量注射儀（Cell Tramoil，Eppendorf）將質(zhì)量濃度為0.5ug·gL的dsFoccUAP和dsGFP分別注射到200只蛻皮24h的2齡西花薊馬若蟲體腔。注射后72h和120h分別取出20只活蟲檢測dsRNA的沉默效果。另外，在注射后12h，取30只活蟲，單頭飼養(yǎng)于放置四季豆的飼養(yǎng)管中，每12h觀察存活情況和形態(tài)變化，共觀察144h，統(tǒng)計個體死亡率和成蟲畸形率。試驗重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)分析

不同處理組之間的多重比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA，Tukey HSD test）（SPSS 21.0），差異顯著性檢驗水平標準P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1FoccUAP的克隆與序列進化分析

以西花薊馬總RNA合成的cDNA為模板，克隆得到與預(yù)期大小相符的目標片段，經(jīng)測序獲得了西花薊馬FoccUAP的開放閱讀框（open reading frame，ORF），全長1545bp，編碼514個氨基酸（圖1）。經(jīng)軟件SignalP 5.0預(yù)測，F(xiàn)occUAP含有信號肽，區(qū)域為第1-10個氨基酸：MEHQYENLRN（圖1）。利用NCBI的Conserved domains功能對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)FoccUAP具有1個保守的結(jié)構(gòu)域：GlYco-tranf-GTA-typcsuperfamily結(jié)構(gòu)域（第89-411位氨基酸）（圖1）。

將FoccUAP氨基酸序列與其他28種昆蟲UAP利用MEGA5.1鄰接法，以步長值1000構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖2）。圖中進化樹可分為兩大支，其中FoccUAP與等翅目、蜚蠊目、直翅目和半翅目昆蟲的UAP親緣關(guān)系最近，序列最高同源性為56%（圖2）。

2.2FoccUAP的時空表達

利用RT-qPCR分析FoccUAP基因在西花薊馬不同發(fā)育階段的mRNA相對表達量。結(jié)果表明FoccUAP基因在蟲體生長發(fā)育的各個階段均有表達，其中2齡幼蟲、蛹以及羽化后24、48、168和240h的表達量分別是1齡幼蟲的1.30、2.5、1.56、2.0、2.43、2.56倍（圖3-A）。此外，對提取羽化后24h的西花薊馬不同組織的總RNA進行RT-qPCR分析FoccUAP基因的表達情況。結(jié)果表明，F(xiàn)occUAP基因在西花薊馬各個組織都有表達，在頭部和腹部相對表達量最高，觸角、胸部和足表達量較低（圖3-B）。

2.3 dsRNA干擾對西花薊馬存活率和發(fā)育的影響

由圖4-A可知，顯微注射0.5ug·uL的dsUAP可顯著抑制FoccUAP基因的表達，觀察發(fā)現(xiàn)，注射dsGFP的西花薊馬羽化率為86.8%，而注射dsUAP的西花薊馬羽化率僅為36.3%，且在注射后120h的總存活率僅為5.o%（圖4-B）;此外，注射dsUAP的西花薊馬成蟲出現(xiàn)翅膀發(fā)育不完整、胸腹部皺縮等畸形現(xiàn)象（圖4-C～D）。說明UAP基因與西花薊馬的表皮發(fā)育和蛻皮有一定的關(guān)系。

3討論與結(jié)論

UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase，UAP）是生物合成中的關(guān)鍵酶，主要功能為催化可逆反應(yīng)N-乙酰氨基葡萄糖-1磷酸（N acetylglucosamme-1-phosphate，GlcNAc-1-P）+UTP形成UDP-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc）+ppi。UAP最早從金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureu中分離純化得到，隨后在小牛的大腦組織和念珠菌球蟲Monilio-phthoraperniciosa中純化獲得。UAP在原核和真核生物的生理代謝活動中均扮演重要作用。近年昆蟲UAP的研究也取得了長足的進步，埃及伊蚊Aedesaegypti、黑腹果蠅Drosophila melanogaster和甜菜夜蛾Jpodopteraexiguo等三十多種昆蟲的UAP基因得到克隆鑒定。進一步研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲UAP基因與昆蟲表皮、氣管和圍食膜中幾丁質(zhì)的合成密切相關(guān)，如黑腹果蠅D.melanogaster UAP基因缺陷導(dǎo)致蟲體表皮的上皮組織畸形，氣管表現(xiàn)亦不正常，并且?guī)锥≠|(zhì)含量大量減少;赤擬谷盜Tribolium castaneum UAP基因?qū)ハx的生長發(fā)育及存活至關(guān)重要;利用dsRNA干擾東亞飛蝗Locusta migratoria UAP基因，其中腸和表皮中的幾丁質(zhì)合成都受到阻礙，最終導(dǎo)致蟲體蛻皮障礙而死亡;在甜菜夜蛾S. exigua中將UAP基因沉默后，同樣可引起甜菜夜蛾化蛹障礙死亡。然而，纓翅目薊馬類昆蟲是目前農(nóng)作物生產(chǎn)上最為重要的害蟲之一，還未見UAP研究報道。因此，開展薊馬類昆蟲UAP基因功能研究具有重要理論意義和應(yīng)用價值。

本研究首次克隆鑒定了薊馬類害蟲UAP基因，發(fā)現(xiàn)西花薊馬UAP基因與其他昆蟲同源性較低，序列最高同源性僅為56%，表明纓翅目昆蟲在進化上具有較高的保守性。從組織表達模式看，頭部FoccUAPmRNA相對表達量最高，表明頭殼發(fā)育過程中需要大量的幾丁質(zhì)，這與頭部比其他組織更加堅硬相一致。此外，從時間表達模式看，蛹期和羽化168h和240h成蟲的FoccUAP mRNA相對表達量最高，這可能是由于蛹階段蟲體需要形成翅以及更為堅固蛹殼，因此需要大量幾丁質(zhì)供給;而成蟲階段FoeeUAP mRNA的高表達，該結(jié)果與UAP在甜菜夜蛾相似，說明UAP除了與昆蟲表皮、氣管和圍食膜中幾丁質(zhì)合成相關(guān)，可能還有其他未明確的功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過向蛻皮后24h的2齡若蟲顯微注射質(zhì)量濃度為0.5ug的dsUAP抑制FoccUAP基因的表達，西花薊馬死亡率顯著增加;同時，注射dsUAP的西花薊馬化蛹率顯著降低且成蟲胸腹部、翅膀出現(xiàn)畸形。這表明，UAP基因表達水平下降可能導(dǎo)致幾丁質(zhì)的前體物質(zhì)UDP-GlcNAc合成不足，從而使幾丁質(zhì)合成受阻而引發(fā)蟲體畸形甚至死亡，其詳細的死亡機理還需要進一步研究。

綜上所述，本研究首次對西花薊馬UAP基因進行克隆、鑒定，利用實時熒光定量PCR法研究該基因在西花薊馬生長發(fā)育過程中的表達模式，并利用RNAi技術(shù)觀察該基因?qū)ξ骰ㄋE馬生長發(fā)育的影響，為進一步探討西花薊馬UAP基因的生理功能提供科學(xué)參考。