綿羊肺炎支原體感染的診斷和防治技術(shù)研究進(jìn)展

江錦秀 林裕勝 張靖鵬 游偉 黃麗麗 胡奇林

摘要：綿羊肺炎支原體（Mo）是引起綿羊和山羊支原體性肺炎的主要病原之一，呈世界性分布，給世界羊養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。Mo的檢測方法主要有3類：一是病原分離鑒定法，分離率低;二是分子生物學(xué)方法，包括PCR方法、LAMP方法、降落PCR-側(cè)向?qū)游隹焖贆z測方法、DNA探針技術(shù)，分子生物學(xué)方法是目前檢測致病性支原體最為常用的方法;三是免疫學(xué)檢測方法，包括間接血凝方法、ELISA方法、免疫組織化學(xué)及間接免疫熒光。Mo的防治主要是疫苗和藥物治療，

目前臨床用的疫苗主要以滅活疫苗為主，基因工程疫苗是未來的發(fā)展趨勢;Mo的治療主要包括抗生素治療、中藥治療、中西醫(yī)結(jié)合治療，近幾年有報(bào)道稱免疫防御分子對Mo患病羊有免疫調(diào)節(jié)和治療作用，為Mo引起的肺炎的治療提供了新方向。本文對Mo感染的流行病學(xué)、診斷方法、防治方法及疫苗研究進(jìn)行了系統(tǒng)綜述，以期為我國羊支原體性肺炎的研究和防治提供參考。

關(guān)鍵詞：綿羊肺炎支原體;流行病學(xué);診斷方法;防治;疫苗

中圖分類號：S855.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）12-1463-08

0 引言

綿羊肺炎支原體（Myc0Plasma ovzpneumoniae，Mo）屬于柔膜體綱、支原體目、支原體科成員，是羊支原體性肺炎的主要病原之一，主要引起綿羊和山羊的肺炎。Mo無細(xì)胞壁，菌體形態(tài)多樣，菌體直徑約0.1-0.5um，在施加外部壓力情況下可通過0.22um濾膜。Mo生物合成及代謝能力較弱，對培養(yǎng)基營養(yǎng)要求高，生長需要膽固醇，能夠利用環(huán)境中的葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵。Mo基因組為雙鏈DNA，基因組大小在1020-1084kb，不同毒株CDS不同，Y98標(biāo)準(zhǔn)株有819個(gè)CDS，SC01株有864個(gè)CDS，NM2010株有748個(gè)CDS。分離自不同地域與宿主來源的Mo存在高度的基因多態(tài)性。不同Mo分離株的主要免疫原性蛋白也存在一定差異。溶血素A（h1YA）、溶血素C（hlyC）、3-磷酸甘油脫氫酶（GlpD）、丙三醇激酶基因（glpK）、水甘油通道基因（glpF）、P102蛋白、P146蛋白、P97蛋白、P76蛋白是Mo SC01株可能的毒力因子。另有報(bào)道莢膜多糖也是Mo另外一個(gè)重要的毒力因子。Mo感染在全世界養(yǎng)羊國家都有發(fā)生，在我國新疆、內(nèi)蒙古、山東、河南、四川、浙江、福建等多個(gè)省市均有報(bào)道，導(dǎo)致了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。對Mo感染做出及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷及防治對控制該病尤為重要。本文將闡述Mo感染的流行病學(xué)、檢測方法、疫苗研究以及治療技術(shù)的研究進(jìn)展，以期為Mo感染的研究和防治提供參考。

1Mo流行病學(xué)特征

Mo可以侵害山羊和綿羊，一年四季均可發(fā)病，冬春季節(jié)羊感染Mo的發(fā)病率比夏秋高。各日齡羊均可發(fā)病，以3月齡以下的羔羊?yàn)橹鳌o對不同品種羊的感染率不同，Mo對綿羊感染率比對山羊的感染率高，Mo對湖羊的感染率比對哈薩克綿羊、麥蘭奴種綿羊和新疆多浪羊的感染率高。Mo感染的羊在臨床上的主要特征是高熱、流鼻涕、咳嗽、纖維素胸膜肺炎，發(fā)病率因地域和養(yǎng)殖模式而有所不同，發(fā)病率為5%-80%，病死率達(dá)30%-100%。Mo感染羊的癥狀與絲狀支原體山羊亞種（Mycoplasma mycoides subsp.capri，Mine）、山羊支原體山羊亞種（Mycoplasma capricolum capricolum，Mcc）、山羊支原體山羊肺炎亞種（Mycoplasma capricolumsubsp.capripneumonia，Mccp）感染羊的癥狀相似。我國最為普遍流行的是Mo，羊群中同時(shí)存在Mo與Mccp或Mmc混合感染的情況，僅根據(jù)流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床癥狀和病變難以做出確診，需要進(jìn)一步檢測。

2 Mo診斷方法

2.1病原分離鑒定法

分離鑒定法是檢測Mo的金標(biāo)準(zhǔn)。目前Mo培養(yǎng)基大多是采用改良的Thiaucourt's培養(yǎng)基（Modified了hiaucourt’s medium，MTS）、改良KM2培養(yǎng)基（MEM-KM2）、改良的Hayflick培養(yǎng)基、改良支原體肉湯培養(yǎng)基等。胸水是首選的Mo分離材料，其次為肺部病健交界處組織和鼻拭子。培養(yǎng)基的pH一般為7.6-7.8。對CO濃度的要求為5%-10%，可用37℃燭缸厭氧培養(yǎng)箱或者CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)。Mo在液體培養(yǎng)基中一般要盲傳1-3代才能看到顏色變化，在固體培養(yǎng)基上長出白色菌落，Mo的支原體菌落沒有中心臍，可區(qū)別于絲狀支原體簇成員。對菌落進(jìn)行顯微鏡觀察、生化鑒定、PCR等能進(jìn)行鑒定。首次分離可以同時(shí)接種固體和液體培養(yǎng)基以提高分離率。臨床上抗生素的使用以及Mo的培養(yǎng)條件要求苛刻，致使支原體分離率比較低，并且Mo分離鑒定法耗時(shí)長，不適合Mo的早期快速檢測。

2.2 分子生物學(xué)方法

2.2.1PCR方法PCR方法是Mo檢測方法中最為常用的方法，其陽性檢出率高于分離鑒定法和免疫組化方法。Falong Yang等基于熱休克蛋白hsp70基因建立了檢測Mo的PCR方法，檢測下限為4.4pg，其敏感性是基于Mo 16SrDNA基因建立的PCR檢測方法的10倍。儲(chǔ)岳峰等根據(jù)Mmc保守的CAP-21基因和Mo 16SrRNA基因分別設(shè)計(jì)特異性引物，建立了Mmc和Mo的雙重PCR方法。林裕勝等根據(jù)Mo的P80基因、Mmc的MLC-1760基因和Mccp的arcA基因序列，設(shè)計(jì)合成了3對特異性引物，建立了同時(shí)檢測Mo、Mmc和Mccp的多重PCR方法。林裕勝等針對Mo Y-98標(biāo)準(zhǔn)株黏附素基因p113基因序列設(shè)計(jì)1對特異性引物和探針，建立了針對Mo的TaqMan熒光定量檢測方法，其敏感性是傳統(tǒng)PCR的1000倍。Falong Yang等針對p113基因建立了SYBR Green熒光定量檢測方法，其敏感性是基于Mo 16S rDNA基因建立的PCR檢測方法的1000倍。

2.2.2LAMP方法 張雙翔等針對Mo的16S rRNA基因設(shè)計(jì)4條環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）引物，通過優(yōu)化反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間、優(yōu)化內(nèi)外引物濃度以及反應(yīng)體系，建立了Mo LAMP方法。LAMP-LFD技術(shù)是環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermalamplification）與橫向流動(dòng)試紙條（Lateral flowdipstick）相結(jié)合的一種新穎的檢測技術(shù)。張潔等以Mo的熱休克蛋白基因（HSP70）為靶基因，其中HSP70FIP由生物素標(biāo)記進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)物與生物素標(biāo)記的探針雜交后，在橫向流動(dòng)試紙條上完成檢測，使得檢測結(jié)果可視。ZHANG J等也以Mo的延伸因子EF-TU基因?yàn)榘谢蚪⒘薒AMP-LFD方法，敏感性是傳統(tǒng)PCR的1000倍。

2.2.3 降落PCR-側(cè)向?qū)游隹焖贆z測方法杜鮮等結(jié)合降落PCR（TD-PCR）和側(cè)向?qū)游觯↙FA）技術(shù)建立了Mo的檢測方法，將2條特異性引物5’端分別標(biāo)記地高辛和生物素進(jìn)行TD-PCR，以膠體金標(biāo)記抗地高辛抗體復(fù)合物，檢測線包被鏈霉親和素，對照線包被羊抗鼠IgG，組裝成試紙條，將TD-PCR產(chǎn)物滴于檢測試紙條上，最低檢出菌濃度為3×10CCU·mL-1，對Mccp、Mmc、Brucella、E.coli、S.aureus的TD-PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果均為陰性，該方法不但提高了敏感性和特異性，同時(shí)還省去了瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像等步驟，2h即可完成。

2.2.4DNA探針技術(shù)Chen等以Cy5標(biāo)記的單鏈DNA探針結(jié)合到MnO微球體，建立了Mo的DNA探針檢測技術(shù)。檢測的靈敏度達(dá)到1.042copies·uL，重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，簡單，快速，經(jīng)濟(jì)。文中還通過試驗(yàn)證明了MnO微球體比MnO納米片有更大的表面積，對單鏈DNA有更強(qiáng)大的吸收效率，更適合作為單鏈DNA探針的載體，為其他病原的探針技術(shù)的建立提供了參考。

2.3免疫學(xué)方法

2.3.1 間接血凝方法趙萍等用純化的Mo菌體經(jīng)過20倍濃縮，超聲破碎后作為抗原致敏經(jīng)戊二醛處理的綿羊紅細(xì)胞，通過摸索最佳抗原濃度建立了Mo間接血凝試驗(yàn)診斷方法，目前該試劑盒（山羊傳染性胸膜肺炎間接血凝試驗(yàn)抗原、陽性血清與陰性血清）已經(jīng)獲得國家二類新獸藥證書。Mo間接血凝方法已經(jīng)廣泛運(yùn)用于羊場Mo的血清學(xué)調(diào)查。

2.3.2ELISA方法候相山、趙萍等都用MoY98標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)、濃縮、超聲破碎作為全菌包被抗原，建立了間接ELISA方法，證明間接ELISA方法比間接血凝試驗(yàn)具有更高的特異性和敏感性。黃海碧等將Mo抗原表位富集的P71基因片段分3段克隆至原核表達(dá)載體，經(jīng)過免疫原性和反應(yīng)原性篩選純化后的P71-3蛋白作為包被抗原建立了間接ELISA方法，具有很好的特異性和敏感性。程振濤等將Mo HSP70基因進(jìn)行原核表達(dá)，用表達(dá)產(chǎn)物包被抗原建立間接ELISA方法，適用于檢測羊血清Mo HSP70抗體，能夠體現(xiàn)體內(nèi)Mo感染水平和疫苗免疫水平?；蚬こ叹磉_(dá)的蛋白可以進(jìn)行大批量生產(chǎn)、純化，相對于全菌蛋白作為包被抗原，解決了Mo培養(yǎng)困難、周期長、滴度不高的問題，而且還避免了全菌蛋白依賴的試劑盒存在的種特異性不足的問題。

2.3.3 免疫組織化學(xué)及間接免疫熒光 張建華等采集疑似Mo病羊肺組織，進(jìn)行石蠟切片和冰凍切片制作，以Mo標(biāo)準(zhǔn)陽性血清為一抗，分別以免抗山羊IgG-HRP和兔抗山羊IgG-FITC為二抗，對疑似Mo肺組織石蠟切片和冰凍切片及陰性對照分別進(jìn)行免疫組化染色和間接免疫熒光染色，建立了檢測Mo的間接免疫組織化學(xué)和間接免疫熒光方法，建立的這兩種方法對138份樣品進(jìn)行檢測，陽性率與PCR結(jié)果相近，比分離培養(yǎng)的陽性率高。這2種方法不適合病原的早期檢測，操作較為繁瑣，不適合大量樣品的檢測。

Mo感染在臨床診斷上易與其他支原體引起的肺炎相混淆，需要結(jié)合其他檢測方法才能做出確診。分離培養(yǎng)法對樣品要求高而且分離率低，不適合該病的早期診斷。分子生物學(xué)方法對樣本要求較低，是目前檢測Mo最常用、研究最多且高效的方法。LAMP方法由于其對設(shè)備要求低，結(jié)果可視，非常適合基層養(yǎng)殖場使用。熒光定量PCR方法相對于普通PCR和多重PCR具有更高的敏感性、更省時(shí)、結(jié)果更為準(zhǔn)確。間接血凝試驗(yàn)和間接ELISA方法相對于間接免疫組化和間接免疫熒光試驗(yàn)更適合臨床樣本量大的血清學(xué)調(diào)查，ELISA方法敏感性高于間接血凝方法。

3 疫苗研究現(xiàn)狀

3.1滅活疫苗

目前國內(nèi)Mo的疫苗主要是滅活苗，以全菌抗原滅活為主。韓笑等篩選毒力最強(qiáng)的Mo SCO株經(jīng)培養(yǎng)、濃縮至抗原濃度為10CCU·mL，經(jīng)甲醛滅活，以1：1加入油佐劑（白油94%、司本6%和1.5%硬脂酸鋁）乳化后制備成Mo滅活疫苗，對5只攻毒山羊的保護(hù)率為100%。逯忠新等將Mo（MoGH3-3株）和]Vllnc（M87-1株）菌液濃縮后經(jīng)甲醛滅活后按1：1混合，按抗原總量的萬分之一加入硫柳汞做成水相（占疫苗總量的45-50%），加入ISA206油佐劑作為油相，充分?jǐn)嚢枞榛呻p相油乳劑疫苗。該疫苗對Mo和Mmc攻毒山羊的保護(hù)率達(dá)80%以上，一次注射疫苗的有效期達(dá)10個(gè)月。佐劑和滅活疫苗的處理方式都將影響滅活疫苗的免疫效果，費(fèi)磊等研究表明ISA-760、Buonavogtial’S佐劑對Mo滅活疫苗的免疫增強(qiáng)效力顯著優(yōu)于ISA-206和白油佐劑。SOMYA MEHRA等以皂素和氫氧化鋁作為Mmc滅活疫苗的佐劑的免疫保護(hù)率（100%）比單純用皂素作為佐劑的免疫保護(hù)率（75%）高。說明不同佐劑對支原體滅活苗的免疫保護(hù)率的影響比較大。KManimaran等用Mmc凍干皂化的全菌疫苗和凍干皂化超聲疫苗免疫山羊，通過SAT、IHA、CFT、ELISA測試，發(fā)現(xiàn)皂化超聲疫苗比全菌疫苗能誘發(fā)更強(qiáng)的體液免疫，說明超聲處理可以提高滅活疫苗的免疫效果。目前國內(nèi)的商品化疫苗為山羊支原體肺炎滅活疫苗（MoGH3-3株+M87-1株），可以同時(shí)預(yù)防Mo和Mnlc。不同地方流行的支原體具有遺傳多樣性，菌株之間交叉保護(hù)力低，另外Mo體外培養(yǎng)產(chǎn)量相對較低，耗時(shí)，全菌抗原存在安全隱患，所以研發(fā)高效安全的Mo新型疫苗是近年的趨勢。

3.2基因工程疫苗

目前許多研究集中在通過抗原表位鑒定篩選具有良好免疫原性的蛋白，用于制備亞單位疫苗。有報(bào)道Mo的p128基因、p113基因、p74基因、p56基因等表達(dá)的蛋白可以與Mo抗體發(fā)生特異結(jié)合，具有良好的反應(yīng)原性，表明P128蛋白、p113蛋白、P74蛋白以及P56蛋白是Mo的免疫相關(guān)蛋白。Jiang F等通過用純化的重組蛋白rEF-Tu和rHSP70免疫BALB/c小鼠來評估體內(nèi)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，證明了Mo的延伸因子Tu（EF-Tu）和HSP70是能夠誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生和細(xì)胞因子分泌的膜相關(guān)蛋白，HSP70在小鼠中能誘導(dǎo)更好的細(xì)胞免疫應(yīng)答，并且可以在免疫應(yīng)答中充當(dāng)Thl細(xì)胞因子樣佐劑，這2種蛋白可能是開發(fā)Mo疫苗的潛在候選者。MaksimovidZ等研究證明，從綿羊和山羊分離的Mo菌株間存在高度的表型和基因組異質(zhì)性，然而分子質(zhì)量為36、38、40和70kDa的免疫顯性抗原在綿羊和山羊Mo分離株中均存在，為研究亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。多表位抗原是一種能增強(qiáng)蛋白抗原性的方法，田路路等將P97、P113、延伸因子Tu（EF-Tu）、丙酮酸脫氧酶El-a亞單位（PHDA）等具有免疫原性的優(yōu)勢抗原表位串聯(lián)，構(gòu)建多表位融合基因，進(jìn)行原核表達(dá)，結(jié)果表明該重組蛋白有良好的反應(yīng)原性和免疫原性。張軒等通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測以及動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證獲得了EF-Tu蛋白和PHDA蛋白的4個(gè)B細(xì)胞表位和2個(gè)T細(xì)胞表位，將這6個(gè)表位與具有免疫佐劑功能的HSP70的C端用連接子進(jìn)行串聯(lián)，篩選最優(yōu)的串聯(lián)體進(jìn)行原核表達(dá)，并驗(yàn)證了其與Mo免疫血清出現(xiàn)了特異性反應(yīng)。劉文青等的研究也表明Mo標(biāo)準(zhǔn)株Y98膜蛋白P26-P40基因融合表達(dá)的重組蛋白比P26基因和P40基因單獨(dú)表達(dá)的重組蛋白對Mo攻毒小鼠有更高的保護(hù)率，同時(shí)P26-P40重組蛋白對Mo攻毒綿羊也能起到保護(hù)作用。多表位抗原聯(lián)合表達(dá)為Mo新型疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。單核細(xì)胞增生李斯特菌是近年發(fā)展起來的一種新型疫苗活載體，盧海亭等通過同源重組技術(shù)將Mop74抗原基因插入單核細(xì)胞增生李斯特菌（LM rli60）基因缺失弱毒株基因組中，獲得了具有免疫原性的Mo p74基因重組單核細(xì)胞增生李斯特菌，為研發(fā)Mo重組活載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。

目前Mo疫苗以滅活疫苗為主，由于Mo菌株存在遺傳多樣性，同時(shí)存在多種支原體混合感染的情況，臨床應(yīng)用效果不夠理想。亞單位疫苗較傳統(tǒng)滅活疫苗副作用少，多表位串聯(lián)疫苗有更強(qiáng)的免疫原性，同時(shí)可以包含多種抗原表位，可以解決Mo菌株存在的遺傳多樣性問題，活載體疫苗在增強(qiáng)免疫應(yīng)答方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，將是新型Mo疫苗的發(fā)展趨勢。

4 治療研究進(jìn)展

4.1抗生素治療

Mo屬于革蘭氏陰性菌，最常見的治療Mo感染是應(yīng)用抗生素。2011年，宋勤葉等應(yīng)用微量法測定了18種常用抗菌藥物對Mo分離株HDl-goat和Mmc分離株XTl-goat的抗菌活性，結(jié)果這2個(gè)分離株均對喹諾酮類抗生素、酒石酸泰樂茵素及鹽酸多西環(huán)素高度敏感，但是對氨基糖苷類抗生素和磺胺甲惡唑均不敏感，而且同一種抗生素對同一種支原體的不同分離株的抗菌活性有差異。四川地區(qū)的33株山羊源Mo對氟喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和林可霉素類抗菌藥物比較敏感，對氟苯尼考表現(xiàn)出中度敏感，不同Mo菌株的耐藥普有所差異，但26株Mo對氯霉素、鏈霉素、紅霉素、頭孢噻呋、阿米卡星、利福平均表現(xiàn)出耐藥?？股貙χгw引起的疾病有一定的治療效果，但是不能根除，并且不同地方分離株對抗生素的耐藥性不同，需要根據(jù)當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖環(huán)境及藥敏試驗(yàn)來確定用藥。而近年來國外有報(bào)道Mmc、Mcc、牛支原體（Myeoplasmaboris，Mb）等支原體對喹諾酮類抗生素產(chǎn)生了耐藥。因此，隨著喹諾酮類藥物的反復(fù)使用，后期Mo也有可能對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥。

4.2 中藥治療或者中西藥結(jié)合治療

中藥治療或者中西藥結(jié)合治療可以減少耐藥性的產(chǎn)生。陳美安等篩選出兩面針、黃連、黃芩、黃柏、甘草、南板藍(lán)根、白鮮皮等7位中藥提取物對Mo有不同程度的體外抑制和殺滅作用。溫偉等用麻杏石甘湯配合泰樂菌素飲水，外加氟苯尼考和電解多維肌肉注射，對Mo感染羊的治愈率為88.9%。以上研究表明中藥對Mo的治療有較好的效果。

4.3 免疫防御分子治療

近幾年研究表明疾病抗性基因編碼的蛋白（免疫防御分子）對感染Mo的病羊有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。多位學(xué)者都通過建立人工感染Mo的患病羊模型后，分別注射真核表達(dá)的短腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1重組蛋白（Shortpalate，lungandnasalepitheliumclone 1，SPLUNCl）、殺菌通透性增加蛋白基因重組蛋白（bactericidal/permeabilitv-increasing proteingene，BPI）、類泛素15（Interferon stimulated genel5，ISGl5）以及甘露糖結(jié)合凝集素（MBL）等蛋白，通過監(jiān)測相關(guān)細(xì)胞因子的變化等證實(shí)了這4種蛋白對Mo感染的病羊有免疫調(diào)節(jié)和治療作用，免疫防御分子在感染性疾病中的作用備受學(xué)術(shù)界關(guān)注，這為支原體的治療和新藥的研制提供了新的思路。

目前Mo的治療仍以抗生素為主，但由于不同地區(qū)抗生素的使用導(dǎo)致不同分離株的耐藥譜不同，建議分地區(qū)定期對Mo的抗菌活性進(jìn)行測試以指導(dǎo)臨床用藥。中藥成分復(fù)雜，有的成分有毒性作用，體外試驗(yàn)的效果需要臨床進(jìn)一步驗(yàn)證。免疫防御分子對Mo感染的病羊有免疫調(diào)節(jié)和治療作用，可以減輕Mo感染羊的臨床癥狀，但并不能完全阻止肺臟實(shí)質(zhì)性病變的發(fā)生。Mo引起的肺炎應(yīng)以免疫預(yù)防為主，治療為輔。

5 結(jié)論

Mo感染是當(dāng)前國內(nèi)外危害養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展的一種主要疫病，目前以滅活疫苗免疫為主要預(yù)防措施，臨床上該病的防治效果不佳，應(yīng)該加強(qiáng)Mo感染的致病機(jī)理和免疫機(jī)制等研究，研發(fā)安全、高效的羊支原體性肺炎疫苗，保障養(yǎng)羊業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展。