牡丹皮炒炭前后顏色與有效成分含量的相關(guān)性分析

陳昕 黃茂勝 孟江 王淑美

中圖分類號(hào) R283 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）17-2360-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.17.11

摘 要 目的：研究牡丹皮炒炭前后顏色與有效成分含量的相關(guān)性，為牡丹皮和牡丹皮炭飲片的鑒別和質(zhì)量評價(jià)提供參考。方法：使用色差儀測定牡丹皮炒炭前后飲片粉末顏色的色度空間參數(shù)[明度值（L*）、紅綠分量值（a*）、黃藍(lán)分量值（b*）及總色差值（E*ab）]，采用高效液相色譜法測定牡丹皮和牡丹皮炭飲片粉末中10種有效成分（沒食子酸、5-羥甲基糠醛、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚、山柰素）的含量，并應(yīng)用SPSS 21.0軟件對顏色的色度空間參數(shù)和有效成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果：沒食子酸含量與色度空間參數(shù)均無相關(guān)性（P>0.05）;5-羥甲基糠醛含量與L*、b*、E*ab呈極顯著性負(fù)相關(guān)（P<0.01），與a*呈極顯著性正相關(guān)（P<0.01）;芍藥苷含量與L*、b*、E*ab呈極顯著性正相關(guān)（P<0.01），與a*無相關(guān)性（P>0.05）;氧化芍藥苷含量與L*、E*ab呈極顯著性正相關(guān)（P<0.01），與a*呈極顯著性負(fù)相關(guān)（P<0.01），與b*無相關(guān)性（P>0.05）;兒茶素、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚、山柰素含量與L*、b*、E*ab均呈顯著性正相關(guān)（P<0.05），與a*呈顯著性負(fù)相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：色差技術(shù)可以量化牡丹皮和牡丹皮炭飲片的顏色，牡丹皮炒炭前后顏色與其有效成分含量具有顯著的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 牡丹皮;牡丹皮炭;含量;顏色;相關(guān)性分析

Correlation Analysis of Color and Effective Components Content in Moutan Cortex before and after Carbonized

CHEN Xin，HUANG Maosheng，MENG Jiang，WANG Shumei（School of TCM， Guangdong Pharmaceutical University/Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica， State Administration of Traditional Chinese Medicine/Engineering Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of Universities in Guangdong Province， Guangzhou 510006， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the correlation between the color of Moutan Cortex and the contents of effective components before and after carbonized， and to provide reference for identification and quality evaluation of Moutan Cortex and its charcoal piece decoction. METHODS： Using colorimeter determination of Moutan Cortex and Moutan Cortex charcoal decoction pieces powder chroma space parameter [lightness value （L*）， red， green and component values （a*）， yellow and blue component value （b*） and total color difference value （E*ab）]， HPLC method for content determination of 10 effective components （gallic acid， 5-HMF， catechins， oxypaeoniflorin， paeoniflorin， quercetin， benzoyl paeoniflorin， isorhamnetin， paeonol， kaempferide） content in Moutan Cortex and Moutan Cortex charcoal decoction pieces. On this basis， the correlation between the content of effective components and the chromaticity space parameter of a color was studied by SPSS 21.0 software. RESULTS： There was no correlation between gallic acid content and the chromaticity space parameter of a color （P>0.05）. There was an extremely significant negative correlation between 5-HMF content and L*， b*， E*ab （P<0.01）， and an extremely significant positive correlation between 5-HMF content and a* （P<0.01）. The content of paeoniflorin was positively correlated with L*， b* and E*ab， but not with a* （P>0.05）. The content of oxidized paeoniflorin was positively correlated with L* and E*ab （P<0.01）， and negatively correlated with a* （P<0.01）， but not with b* （P>0.05）. The content of catechins， quercetin， benzoyl paeoniflorin， isorhamnin， paeonol and kaempferol were positively correlated with L*， b* and E*ab （P>0.05）， and negatively correlated with a* （P>0.05）. CONCLUSIONS： Chromatic aberration technology can quantify the color of Moutan Cortex and its charcoal decoction pieces， and there is a significant correlation between the color of Moutan Cortex before and after processing and the content of its active ingredients.

KEYWORDS Moutan Cortex; Moutan Cortex charcoal; Content; Color; Correlation analysis

牡丹皮為毛茛科植物牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）的干燥根皮，味苦、辛，微寒，歸心、肝、腎經(jīng)，具有清熱涼血、活血化瘀的功效，用于熱入營血、溫毒發(fā)斑、吐血衄血、夜熱早涼、無汗骨蒸、經(jīng)閉痛經(jīng)、跌撲傷痛、癰腫瘡毒等癥[1]。牡丹皮炭為牡丹皮的炒炭品，具有涼血止血的作用，用于吐血、崩漏及多種血熱出血證[2]。研究發(fā)現(xiàn)，牡丹皮及牡丹皮炭飲片中均含有酚及酚苷類成分（如丹皮酚）、單萜及其苷類成分（如芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷）和其他成分[如5-羥甲基糠醛（5-HMF）、沒食子酸、兒茶素、槲皮素、山柰素、異鼠李素]等多種有效成分[3-6]，且這些有效成分具有解熱、活血化瘀、收斂止血、抑制血小板聚集等功效[7-10]，與牡丹皮及牡丹皮炭飲片的功效一致。2015年版《中國藥典》（一部）[1]中關(guān)于牡丹皮炮制前后的質(zhì)量控制，主要是通過傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別外觀性狀、顏色和丹皮酚含量測定相結(jié)合的方法。但顏色評價(jià)具有很大的主觀性和模糊性，而飲片顏色差異常常反映其質(zhì)量優(yōu)劣，且與飲片內(nèi)在物質(zhì)成分含量的高低也息息相關(guān)[11-12]。目前，牡丹皮和牡丹皮炭飲片成分和顏色之間的相關(guān)性尚未見報(bào)道，故有必要對牡丹皮炒炭前后顏色進(jìn)行客觀、數(shù)字化評價(jià)，并對顏色和成分之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。

色彩色差計(jì)又稱為光電反射光度計(jì)，其可以用光電測定的方法，迅速、準(zhǔn)確、方便地測出各種試樣被測位置的顏色，并且通過計(jì)算機(jī)直接換算成明度值（L*）、紅綠分量值（a*）、黃藍(lán)分量值（b*）對顏色進(jìn)行數(shù)值化表示[13]。近年來，色差分析在食品、藥品方面應(yīng)用較多，如萬超等[14]采用色差計(jì)測定醋延胡索飲片顏色并與主要成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析，實(shí)現(xiàn)了醋延胡索質(zhì)量的快捷評價(jià);徐珍珍等[12]利用色差計(jì)對木香粉末的色差值進(jìn)行測定并與有效成分木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯和揮發(fā)油的含量相關(guān)聯(lián)，為木香質(zhì)量評價(jià)體系的建立提供了參考。因此，本研究采用色差計(jì)對牡丹皮和牡丹皮炭飲片粉末進(jìn)行顏色的測定，將傳統(tǒng)的顏色指標(biāo)進(jìn)行客觀化和數(shù)字化，并與其有效成分（沒食子酸、5-HMF、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚、山柰素）含量進(jìn)行相關(guān)性研究，為牡丹皮和牡丹皮炭飲片的鑒別和質(zhì)量評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

CR-400/410色彩色差計(jì)、CR-A50粉末測試盒、CR-A33e玻璃防光保護(hù)盒（日本柯尼卡美能達(dá)有限公司）;1100系列高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)，配備一個(gè)光電二極管陣列檢測器（美國安捷倫公司）;CY-20炒藥機(jī)（江陰市祝塘明科機(jī)械廠）;JP-105A高速多功能粉碎機(jī)（永康市久品工貿(mào)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

10批牡丹皮藥材分別購買于10個(gè)不同地區(qū)，由廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院劉基柱教授鑒定均為毛茛科植物牡丹P. suffruticosa Andr.的干燥根皮，藥材收集后裝入密封袋存放于干燥器中陰涼避光處保存，并于3年內(nèi)完成試驗(yàn);兒茶素對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-12050702，純度：≥98%）;山柰素對照品（批號(hào)：110861-201310，純度：≥98%）、異鼠李素對照品（批號(hào)：110860-201410，純度：≥98%）均購自中國食品藥品檢定研究院;5-HMF對照品（批號(hào)：150802，純度：≥98%）、沒食子酸對照品（批號(hào)：140801，純度：≥98%）、氧化芍藥苷對照品（批號(hào)：150822，純度：≥98%）、芍藥苷對照品（批號(hào)：150609，純度：≥98%）、槲皮素對照品（批號(hào)：140425，純度：≥98%）和苯甲酰芍藥苷對照品（批號(hào)：150903，純度：≥98%）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司;丹皮酚對照品（本實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：20150708，純度：≥98%）;乙腈和甲酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。牡丹皮藥材來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 牡丹皮和牡丹皮炭樣品的制備

2.1.1 牡丹皮飲片樣品的制備 取牡丹皮藥材，迅速洗凈，潤后切薄片，曬干，粉碎過5號(hào)篩，即得。

2.1.2 牡丹皮炭飲片樣品的制備 分別取一半的各批次牡丹皮樣品，照2015年版《中國藥典》（四部）通則0213中炒炭法[15]，并結(jié)合課題組前期優(yōu)選的炮制工藝[16]炒至樣品表面呈黑褐色，內(nèi)部黃褐色。取出，晾涼，粉碎過5號(hào)篩，即得（對應(yīng)飲片樣品編號(hào)為PMC-01～PMC-10）。

2.2 牡丹皮炒炭前后顏色的色度空間參數(shù)測定

采用色彩色差計(jì)分別對牡丹皮樣品和牡丹皮炭粉末進(jìn)行客觀評價(jià)。每批樣品測定5次，取平均數(shù)。測定條件為光源D65，標(biāo)準(zhǔn)觀察角度2°，照明口徑50 mm，儀器誤差（ΔE*ab）在0.8以內(nèi)，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差（ΔE*ab）在0.07以內(nèi)，以色度空間參數(shù)L*、a*、b*進(jìn)行色澤量化，總色差值（E*ab）=[（L*）2+（a*）2+（b*）2]1/2。

2.2.1 精密度考察 取樣品RMC-01適量，在同一時(shí)間點(diǎn)測量顏色的色度空間參數(shù)，重復(fù)測量5次，取平均值。結(jié)果，L*、a*、b*的RSD分別為0.07%、0.67%和0.14%（n=5），表明儀器精密良好。

2.2.2 在不同界光亮強(qiáng)度下的穩(wěn)定性考察 取樣品RMC-01適量，置于同一裝載容器內(nèi)，分別在同一天的不同時(shí)間點(diǎn)（8 ∶ 30、11 ∶ 30、14 ∶ 30、17 ∶ 30、20 ∶ 30）測量顏色的色度空間參數(shù)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測量5次，取平均值。結(jié)果，L*、a*、b*的RSD分別為0.92%、2.73%和2.01%（n=5），表明外界光強(qiáng)度對試驗(yàn)結(jié)果影響較小。

2.2.3 樣品穩(wěn)定性考察 取樣品RMC-01適量，置于同一裝載容器內(nèi)，分別放置0、1、2、3、4、5 d后測量顏色的色度空間參數(shù)，每次重復(fù)測量5次，取平均值。結(jié)果，L*、a*、b*的RSD分別為1.14%、2.76%和2.21%（n=5），表明樣品5 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 牡丹皮及牡丹皮炭飲片顏色的色度空間參數(shù)測定 分別取10批牡丹皮和牡丹皮炭飲片，按 “2.2”項(xiàng)下方法操作，測定各樣品顏色的色度空間參數(shù)，結(jié)果見表2。

2.2.5 牡丹皮和牡丹皮炭顏色差異性分析 將樣本分為牡丹皮組和牡丹皮炭兩組，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行相關(guān)分析。由于測得的牡丹皮和牡丹皮炭顏色的色度空間參數(shù)數(shù)據(jù)不完全符合多元正態(tài)性和方差齊性分布，故選擇KruskaWallis H秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。以牡丹皮和牡丹皮炭分類作為分組變量，牡丹皮和牡丹皮炭的L*、a*、b*為檢驗(yàn)變量，經(jīng)KruskaWallis H檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，牡丹皮和牡丹皮炭L*、a*、b*的χ2值分別為14.286、9.143、13.166（P均<0.01），拒絕H0，接受H1，可認(rèn)為二者間顏色有顯著性差異。

2.2.6 牡丹皮和牡丹皮炭顏色判別分析 將樣本分為牡丹皮組和牡丹皮炭兩組，以組別為分組變量，測得的牡丹皮和牡丹皮炭顏色的色度空間參數(shù)為自變量，并且作為訓(xùn)練集樣本。采用SPSS 21.0軟件建立以L*、a*、b*為輸入的判別兩組的判別函數(shù)。再用訓(xùn)練集樣本回代[17-18]，對判別函數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。由組間均值相等性檢驗(yàn)結(jié)果可知，自變量L*、a*、b*的P均<0.01，表明在判別函數(shù)中L*、a*、b*均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，L*、a*、b*的λ值（反映組間差異程度，λ值越接近0，組間差異越顯著）分別為0.092、0.603、0.364，其中L*的λ值最接近0，故可認(rèn)為L*判別更有意義。由Wilk’s Lambda檢驗(yàn)結(jié)果建立了典型判別函數(shù)，λ值為0.045，P=0，判別函數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，標(biāo)準(zhǔn)化典型判別函數(shù)=2.794×L*+2.839×a*-1.421×b*，非標(biāo)準(zhǔn)化典型判別函數(shù)=0.987×L*+3.816×a*-1.575×b*-49.308。將樣本數(shù)據(jù)代入非標(biāo)準(zhǔn)化典型判別函數(shù)，得到各樣本的函數(shù)值，函數(shù)值大于0的樣本，判到“牡丹皮”，反之判到“牡丹皮炭”。Fisher的線性判別式函數(shù)分別為牡丹皮=71.904×L*+334.979×a*-159.175×b*-1 895.500，牡丹皮炭=63.282×L*+301.656×a*-145.960×b*-1 464.970，將樣本數(shù)據(jù)代入兩個(gè)線性判別式函數(shù)中，得出兩個(gè)函數(shù)值，將樣本判入所得函數(shù)值較大的分組中。

2.3 多成分含量測定

2.3.1 樣品溶液的制備 準(zhǔn)確稱量樣品粉末0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加50%甲醇50 mL，室溫超聲（功率：300 W，頻率：50 kHz）提取30 min，然后以20 000 ? ? ?r/min離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加50%甲醇定容并搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.2 色譜條件 參考本課題組前期測定牡丹皮炮制前后化學(xué)成分（沒食子酸、5-HMF、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚、山柰素）含量的條件和方法[9]，色譜條件如下：色譜柱為Ultimate TM XB-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）;流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）（V/V），梯度洗脫（0～30 min，5%→15%A;30～60 min，15%→50%A;60～70 min，50%→95%A）;檢測波長為254 nm;柱溫為30 ℃;流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL。

2.3.3 方法學(xué)考察 按照相關(guān)方法進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果顯示，10個(gè)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的相關(guān)系數(shù)R2均>0.999 1;檢測限和定量限范圍分別為2.4～37.5 ng和0.011～0.258 2 μg;在精密度試驗(yàn)中，日內(nèi)、日間的RSD分別為0.16%～1.97%、0.39%～2.06%（n=6）;在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，峰面積的RSD均<3.0%（n=6）;平均回收率為91.8%～109.5%，RSD均<5.0%（n=6）。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確、可行。

2.3.4 牡丹皮及牡丹皮炭飲片中10個(gè)有效成分含量的測定 取牡丹皮和牡丹皮炭飲片，按“2.3.1” 項(xiàng)下方法制成樣品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，并計(jì)算各成分的含量，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，結(jié)果見表3。

2.4 相關(guān)性分析

2.4.1 顏色與牡丹皮炒炭前后的Pearson相關(guān)性分析 將樣本分為牡丹皮組和牡丹皮炭兩組，以組別為自變量，L*、a*、b*、E*ab為因變量，利用SPSS 21.0軟件對其進(jìn)行Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)。結(jié)果，組別與L*、a*、b*、E*ab的相關(guān)性系數(shù)分別為-0.953、0.630、-0.797、-0.955，雙側(cè)P均<0.05，可認(rèn)為牡丹皮炒炭前后與L*、b*、E*ab呈顯著性負(fù)相關(guān)，而與a*則呈顯著性正相關(guān)。

2.4.2 顏色與有效成分含量的Pearson相關(guān)性分析 利用SPSS 21.0軟件對牡丹皮和牡丹皮炭飲片中10個(gè)有效成分的含量與其色度空間參數(shù)L*、a*、b*、E*ab進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果見表4。

從表4可以看出，牡丹皮和牡丹皮炭飲片中除了沒食子酸外，其他成分含量均與顏色的色度空間參數(shù)有顯著相關(guān)性。其中，兒茶素、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚和山柰素含量與L*、b*、E*ab存在顯著性正相關(guān)關(guān)系，與a*存在顯著性負(fù)相關(guān)關(guān)系;5-HMF含量與L*、b*、E*ab存在極顯著性負(fù)相關(guān)關(guān)系，與a*存在極顯著性正相關(guān)關(guān)系;芍藥苷含量與L*、b*、E*ab存在極顯著性正相關(guān)關(guān)系，與a*無相關(guān)性;氧化芍藥苷含量與L*、E*ab存在極顯著性正相關(guān)關(guān)系，與a*存在極顯著性負(fù)相關(guān)關(guān)系，與b*無相關(guān)性。

2.4.3 顏色與有效成分含量的線性回歸分析 以牡丹皮和牡丹皮炭飲片中10種有效成分含量為自變量，色度空間參數(shù)L*、a*、b*、E*ab為因變量，利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果，自變量與顏色的色度空間參數(shù)L*、a*、b*和E*ab的決定系數(shù)R2分別為0.919、0.663、0.949、0.922，說明顏色的色度空間參數(shù)受有效成分含量的影響程度分別為91.9%、66.3%、94.9%、92.2%，這表明牡丹皮和牡丹皮炭飲片的顏色與有效成分含量的相關(guān)性較大，即10種有效成分含量可以解釋顏色色度空間參數(shù)的66.3%～94.9%，結(jié)果見表5。

2.4.4 牡丹皮炒炭前后與有效成分含量的相關(guān)性 將樣本分為牡丹皮組和牡丹皮炭兩組，以組別為自變量， 10個(gè)有效成分含量為因變量，采用SPSS 21.0軟件對其進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，牡丹皮炒炭前后與10個(gè)有效成分（沒食子酸、5-HMF、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚、山柰素）的相關(guān)系數(shù)r分別為0.328（P>0.05）、0.859（P<0.01）、-0.742（P<0.01）、-0.751（P<0.01）、-0.788（P<0.01）、-0.979（P<0.01）、-0.974（P<0.01）、-0.910（P<0.01）、-0.819（P<0.01）、-0.898（P<0.01）。由r值可以看出，10個(gè)成分中除了沒食子酸外，其他成分的含量與牡丹皮炒炭前后均具有顯著相關(guān)性，其中5-HMF含量呈顯著性正相關(guān)，其余8個(gè)成分（兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚、山柰素）均呈顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論

本研究通過對牡丹皮和牡丹皮炭飲片粉末的顏色色度空間參數(shù)進(jìn)行測定和分析，發(fā)現(xiàn)牡丹皮炒炭前后與色度空間參數(shù)L*、a*、b*、E*ab均有顯著相關(guān)性，與L*、b*、E*ab呈顯著性負(fù)相關(guān)，與a*則呈顯著性正相關(guān)。將牡丹皮炒炭前后顏色色度空間參數(shù)與其主要有效成分的含量進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)除5-HMF含量與L*、b*、E*ab存在極顯著性負(fù)相關(guān)關(guān)系，與a*存在極顯著性正相關(guān)關(guān)系外;其他絕大多數(shù)成分（兒茶素、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚、山柰素）含量均與L*、b*、E*ab存在顯著性正相關(guān)關(guān)系，與a*存在顯著性負(fù)相關(guān)關(guān)系。以上結(jié)果說明，可以通過飲片顏色區(qū)分牡丹皮的不同炮制品，同時(shí)牡丹皮不同炮制品顏色與其藥效成分含量具有顯著的相關(guān)性。故利用色差計(jì)將主觀顏色進(jìn)行數(shù)字化、精確化、客觀化，并結(jié)合HPLC法對多個(gè)有效成分含量測定，建立的牡丹皮飲片的顏色與多個(gè)有效成分含量之間的相關(guān)性評價(jià)技術(shù)，可快速、準(zhǔn)確地判定牡丹皮和牡丹皮炭飲片質(zhì)量，這不僅可為中藥材及飲片進(jìn)行精確客觀的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，也有利于規(guī)范中藥材及飲片流通使用中的質(zhì)量控制，促進(jìn)中藥材及飲片市場的良好發(fā)展。

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（收稿日期：2019-03-08 修回日期：2019-05-20）

（編輯：林 靜）