HPLC-波長切換法同時測定消栓腸溶膠囊中7個成分的含量

陳瑋

中圖分類號 R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）17-2343-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.17.08

摘 要 目的：建立同時測定消栓腸溶膠囊中7個活性成分綠原酸、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、毛蕊異黃酮苷和藁本內(nèi)酯的含量。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫，檢測波長為326 nm（綠原酸）、210 nm（苦杏仁苷）、230 nm（芍藥苷）、321 nm（阿魏酸）、334（洋川芎內(nèi)酯Ⅰ）、274 nm（毛蕊異黃酮苷）、260 nm（藁本內(nèi)酯），流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：綠原酸、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、毛蕊異黃酮苷和藁本內(nèi)酯檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為1.16～34.81、1.85～55.48、13.22～396.50、13.50～405.09、1.75～52.51、2.74～82.18、7.67～230.07 μg/mL（r為0.999 1～0.999 7）;定量限分別為0.056、0.103、0.085、0.013、0.136、0.184、0.276 μg;精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD<2.0%（n=6）;平均回收率分別為99.3%、98.6%、98.8%、99.7%、97.1%、97.6%和99.2%（RSD<2.0%，n=6）。結(jié)論：建立的含量測定方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于消栓腸溶膠囊中7個成分的同時測定。

關(guān)鍵詞 消栓腸溶膠囊;綠原酸;苦杏仁苷;芍藥苷;阿魏酸;洋川芎內(nèi)酯Ⅰ;毛蕊異黃酮苷;藁本內(nèi)酯;含量測定;高效液相色譜法

Simultaneous Determination of 7 Constituents in Xiaoshuan Enteric-coated Capsules by HPLC-wavelength Switching Method

CHEN Wei（Dept. of Pharmacy， Wanbei Coal-electricity Corporation General Hospital， Anhui Suzhou 234000， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of 7 active constituents in Xiaoshuan enteric-coated capsules， such as chlorogenic acid， amygdalin， paeoniflorin， ferulic acid， senkyunolide Ⅰ， calycosin glycoside and ligustilide. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent Eclipse Plus C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid （gradient elution）. The detection wavelengths were set at 326 nm for chlorogenic acid， 210 nm for amygdalin， 230 nm for paeoniflorin， 321 nm for ferulic acid， 334 nm for senkyunolideⅠ， 274 nm for calycosin glycoside and 260 nm for ligustilide. The flow rate was set at 1.0 mL/min， and the column temperature was 35 ℃. The sample size was 10 μL. RESULTS： The linear range was 1.16-34.81 μg/mL for chlorogenic acid， 1.85-55.48 μg/mL for amygdalin， 13.22-396.50 μg/mL for paeoniflorin， 13.50-405.09 μg/mL for ferulic acid， 1.75-52.51 μg/mL for senkyunolideⅠ， 2.74-82.18 μg/mL for calycosin glycoside， 7.67-230.07 μg/mL for ligustilide （r=0.999 1-0.999 7）， respectively. The limit of quantity were 0.056， 0.103， 0.085， 0.013， 0.136， 0.184 and 0.276 μg. RSDs of precision， stability （24 h） and reproducibility tests were lower than 2.0% （n=6）. Average recoveries were 99.3%，98.6%，98.8%，99.7%，97.1%，97.6% and 99.2% （RSD<2.0%， n=6）. CONCLUSIONS： Established method is accurate and simple. It can be used for simultaneous determination of 7 constituents in Xiaoshuan enteric-coated capsules.

KEYWORDS ? Xiaoshuan enteric-coated capsules; Chlorogenic acid; Amygdalin; Paeoniflorin; Ferulic acid; SenkyunolideⅠ; Calycosin glycoside; Ligustilide; Content determination; HPLC

消栓腸溶膠囊具有補(bǔ)氣、活血和通絡(luò)之功效，是由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎、地龍、桃仁和紅花等7味藥材制成的制劑[1]。研究表明，該藥對腦梗死和缺血性中風(fēng)氣虛血瘀癥效果明顯[2-3]。川芎-當(dāng)歸藥對是治療缺血性中風(fēng)的高頻用藥，在治療缺血性中風(fēng)中協(xié)同發(fā)揮活血通絡(luò)之功用，宋代《太平惠民和劑局方》中記載的芎歸湯即由二者組成[4-5]，其內(nèi)在活性成分主要為綠原酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、阿魏酸和藁本內(nèi)酯等[6]。據(jù)文獻(xiàn)報道，藁本內(nèi)酯和洋川芎內(nèi)酯Ⅰ可加速部分藥物透過血腦屏障，具有抗血小板聚集和抗凝血的作用[7]，綠原酸具有較廣泛的抗菌、抗病毒、抑制血小板聚集等作用[8]。方中黃芪能利水消腫、生津養(yǎng)血，主要含有黃酮類和三萜皂苷類化合物，其中毛蕊異黃酮苷是黃酮類典型代表化合物[9-10];方中赤芍可以散瘀止痛和清熱涼血，內(nèi)含大量單萜類化合物，其中以芍藥苷占比較大[11-12];方中桃仁主要活性成分為苦杏仁苷，具有抗動脈粥樣硬化及免疫調(diào)節(jié)等作用[13]。在消栓腸溶膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[1]中，僅以黃芪甲苷作為定量考察指標(biāo)。而該方中的上述活性成分，特別是綠原酸、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、毛蕊異黃酮苷和藁本內(nèi)酯，均是發(fā)揮活血消腫、通絡(luò)散瘀等藥理活性的主要成分，其含量大小對消栓腸溶膠囊的質(zhì)量具有一定影響，故筆者建議將這些成分納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中加以控制。

在含量測定中，本研究通過設(shè)計L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)化消栓腸溶膠囊中活性成分提取方法，以最大程度地提取出這7個活性成分;再采用高效液相色譜（HPLC）-波長切換法，建立同時測定樣品中綠原酸、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、毛蕊異黃酮苷和藁本內(nèi)酯含量的方法，以進(jìn)一步完善消栓腸溶膠囊質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)，為客觀科學(xué)評價消栓腸溶膠囊質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

e2695 HPLC儀，包括2695Alliance四元梯度泵、2998二極管陣列檢測器（美國Waters公司）;ML204 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）;S180H 超聲清洗器（德國Elma 公司）。

1.2 藥品與試劑

消栓腸溶膠囊（三門峽賽諾維制藥有限公司，批號：20180105、20180106、20180301、20180302、20180501、20180502，規(guī)格：0.2 g）;綠原酸（批號：111521-201708，純度：95.1%）、苦杏仁苷（批號：110820-201506，純度：93.4%）、芍藥苷（批號：110736-201741，純度：95.7%）、毛蕊異黃酮苷（批號：111920-201505，純度：97.1%）、阿魏酸（批號：110773-201614，純度：99.0%）、藁本內(nèi)酯（批號：111737-201507，純度：≥99.0%），上述各對照品均購自中國食品藥品檢定研究院;洋川芎內(nèi)酯Ⅰ對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：Y-085-170609，純度：≥98.0%）;甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5μm）;流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A;10～15 min，10%→25%A;15～20 min，25%→30%A;20～35 min，30%→60%A;35～50 min，60%→80%A;50～60 min，80%A;60～75 min，80%→90%A）;流速：1.0 mL/min;檢測波長：326 nm（0～12 min，檢測綠原酸）、210 nm（12～15.5 min，檢測苦杏仁苷）、230 nm（15.5～20 min，檢測芍藥苷）、321 nm（20～30 min，檢測阿魏酸）、334（30～45 min，檢測洋川芎內(nèi)酯Ⅰ）、274 nm（45～50 min，檢測毛蕊異黃酮苷）、260 nm（50～75 min，檢測藁本內(nèi)酯）;柱溫：35 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取方法 取消栓腸溶膠囊（批號：20180105），以不同提取溶劑（A）、料液比（B）和超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）時間（C）為考察因素，每因素設(shè)計3水平，按L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。以綠原酸、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、毛蕊異黃酮苷和藁本內(nèi)酯的含量的綜合評分為指標(biāo)，各成分權(quán)重系數(shù)[14]均為1/7，綜合評分=1/7×綠原酸含量+1/7×苦杏仁苷含量+1/7×芍藥苷含量+1/7×阿魏酸含量+1/7×洋川芎內(nèi)酯Ⅰ含量+1/7×毛蕊異黃酮苷含量+1/7×藁本內(nèi)酯含量。正交試驗(yàn)因素、水平、設(shè)計與結(jié)果見表1，方差分析結(jié)果見表2。

從表1可直觀看出，各因素對綜合評分的影響順序?yàn)锳>B>C，最優(yōu)組合為A1B3C2;據(jù)表2結(jié)果可知，因素A和B對綜合評分指標(biāo)有顯著影響（P<0.05），因素C無顯著影響（P>0.05），這與表1直觀分析結(jié)果一致。由正交試驗(yàn)可得出，最優(yōu)提取條件為：每1 g供試品以50 mL 30%甲醇為提取溶劑，超聲處理60 min。按上述最優(yōu)提取方案，分別提取3份，計算綠原酸、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、毛蕊異黃酮苷和藁本內(nèi)酯的平均含量分別為0.236、0.377、2.655、2.747、0.353、0.548、1.537 mg/g，RSD均小于2%，綜合評分為1.208，表明最優(yōu)提取方案較好。

2.2.2 供試品溶液制備方法 取消栓腸溶膠囊內(nèi)容物適量，研細(xì)，取細(xì)粉約1 g，精密稱定，置于具塞三角燒瓶中，精密加入50 mL 30%甲醇，稱質(zhì)量，超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）60 min，放冷，用30%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，即得，室溫避光保存。

2.3 混合對照品溶液制備

精密稱取綠原酸、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、毛蕊異黃酮苷、藁本內(nèi)酯對照品各適量，加30%甲醇超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，配制成每1 mL含綠原酸0.058 mg、苦杏仁苷0.092 mg、芍藥苷0.661 mg、、阿魏酸0.675 mg、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ0.088 mg、毛蕊異黃酮苷0.137 mg、藁本內(nèi)酯0.383 mg的混合對照品貯備溶液。取上述貯備溶液2 mL，置于25 mL量瓶中，加30%甲醇稀釋至刻度，即得混合對照品溶液。

2.4 陰性對照溶液制備

取缺黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎、桃仁和紅花的消栓腸溶膠囊處方中的其他藥材和輔料，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成陰性對照溶液，濾過，備用。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”“2.3”“2.4”項(xiàng)下供試品溶液、混合對照品溶液和陰性對照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果各成分與相鄰色譜峰分離度均大于1.5，對稱因子在1.09～1.21之間，理論板數(shù)以綠原酸、芍藥苷、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、毛蕊異黃酮苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯峰計均大于5 000。色譜圖見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.3”項(xiàng)下混合對照品貯備溶液0.5、2.0、6.0、12、15 mL，置于25 mL量瓶中，加30%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，得系列質(zhì)量濃度混合溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定分析，記錄色譜圖。以各成分質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各成分回歸方程和相關(guān)系數(shù)等。取“2.3”項(xiàng)下混合對照品溶液，用30%甲醇逐步稀釋，按各成分色譜峰信噪比（S/N）10 ∶ 1分別測定其定量限。7個成分的線性關(guān)系和定量限數(shù)據(jù)結(jié)果見表3。

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、毛蕊異黃酮苷和藁本內(nèi)酯峰面積的RSD分別0.7%、1.1%、0.5%、0.2%、0.6%、0.8%、1.2%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號：20180105），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于制備后0、3、6、12、15、24 h測定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、毛蕊異黃酮苷和藁本內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.5%、0.7%、1.2%、1.4%、0.9%、1.3%、1.0% （n=6），表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批供試品（批號：20180105），共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定，記錄色譜圖，計算7個成分的含量及RSD值。結(jié)果，綠原酸、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、毛蕊異黃酮苷和藁本內(nèi)酯的平均含量分別為0.232、0.366、2.654、2.735、0.352、0.540、1.526 mg/g，RSD分別為1.2%、0.7%、1.1%、1.1%、1.2%、1.0%、1.5% （n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的消栓腸溶膠囊（批號：20180105）內(nèi)容物適量，共6份，每份約0.5 g，精密稱定，置于具塞三角燒瓶中，分別加入綠原酸0.120 mg、苦杏仁苷0.162 mg、芍藥苷1.466 mg、阿魏酸1.690 mg、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ0.141 mg、毛蕊異黃酮苷0.255 mg、藁本內(nèi)酯0.888 mg，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定，記錄色譜圖，計算各成分加樣回收率及其RSD值，結(jié)果見表4。

2.11 樣品含量測定

分別精密吸取“2.2”“2.3”項(xiàng)下供試品溶液和混合對照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄綠原酸、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、毛蕊異黃酮苷、藁本內(nèi)酯的峰面積，計算消栓腸溶膠囊中7個活性成分的含量，結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

在選擇流動相時，筆者在預(yù)試驗(yàn)中先后考察甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相系統(tǒng)的分離效果。結(jié)果，使用甲醇-水和乙腈-水為流動相時，7個目標(biāo)化合物未能全部檢出;使用甲醇-0.1%磷酸溶液為流動相時，色譜峰總數(shù)較少，且苦杏仁苷和洋川芎內(nèi)酯Ⅰ無法檢出;而使用乙腈-0.1%磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫時，可以將目標(biāo)峰完全洗脫，且各色譜峰對稱性好（0.93～1.08），各峰間分離度均大于1.5。

在預(yù)試驗(yàn)中比較了Dimonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Thermo ODS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）和Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）等4根不同型號色譜柱的分離效果，結(jié)果，使用Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱時，各待測成分色譜峰與前后雜質(zhì)峰的分離度稍大，但不同品牌色譜柱之間差異不大。

在預(yù)試驗(yàn)中考察柱溫對分離效果的影響時，先后考察15、20、25、30、35 ℃這5個溫度，發(fā)現(xiàn)色譜柱柱溫對色譜峰的分離度有較大影響，當(dāng)柱溫提高至35 ℃時相鄰最近的苦杏仁苷和芍藥苷峰方可實(shí)現(xiàn)分離。

在選擇檢測波長時，使用二極管陣列檢測器，在190～400 nm波長段分別掃描7個成分的對照品溶液，結(jié)果，綠原酸、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、毛蕊異黃酮苷和藁本內(nèi)酯最大吸收波長分別為326、210、230、321、334、274、260 nm，為使各目標(biāo)成分色譜峰均能達(dá)到最佳信號強(qiáng)度，本試驗(yàn)采用分段波長儀器自動切換方式。

3.2 提取條件的優(yōu)化

本研究在預(yù)試驗(yàn)中先后考察了加熱回流法、溶劑萃取法和超聲提取法3種提取方式，結(jié)果使用這3種提取方法所提取到的供試液中所含苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、毛蕊異黃酮苷和藁本內(nèi)酯含量分別依次為加熱回流法：0.237、0.365、2.666、2.727、0.361、0.548、1.526 mg/g，溶劑萃取法：0.246、0.379、2.710、2.725、0.399、0.556、1.579 mg/g，超聲提取法：0.235、0.358、2.652、2.737、0.360、0.542、1.512 mg/g。由上述結(jié)果可知，溶劑萃取法所測得各指標(biāo)成分含量稍高，加熱回流次之，但這3種提取方法所得7個成分含量相差甚微（小于5%）?？紤]到加熱回流法提取時間較長（2 h），且操作復(fù)雜;而溶劑萃取法需要專業(yè)儀器，方法不宜推廣;超聲提取法相對來說更加簡便和實(shí)用。且超聲提取技術(shù)是一種節(jié)能、省時、提取效率較高的方法[15]，在中藥成分提取領(lǐng)域已有廣泛運(yùn)用。故最終選用超聲提取法進(jìn)行提取。

由于中藥活性成分種類繁多，極性大小不同，所需溶出介質(zhì)也不相同，且本研究中的7個化合物也存在極性差異，所以將不同提取溶劑作為正交試驗(yàn)篩選中的考察因素。另外，料液比和超聲時間對成分提取效果整體來說雖是呈正比關(guān)系，但無限放大或升高這些條件會影響試驗(yàn)效率，而太小或太低會使活性成分提取不完全，故也將這2項(xiàng)納入考察因素中。

正交試驗(yàn)設(shè)計在中藥提取方法篩選過程中有著廣泛運(yùn)用[16-17]，其使用樣品量較少、試驗(yàn)次數(shù)較少，方法科學(xué)合理。消栓腸溶膠囊藥理作用明顯，其由7味藥材制成，內(nèi)含大量化合物，有效成分的充分提取是質(zhì)量控制試驗(yàn)順利開展的前提條件。本研究以7個成分的綜合評分為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計優(yōu)化溶劑種類、料液比和超聲時間，尋求最優(yōu)提取條件。最終確定提取條件為每1 g供試品以50 mL 30%甲醇超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理60 min。

本研究建立的HPLC-波長切換法可同時測定消栓腸溶膠囊中7個活性成分含量，此方法的建立進(jìn)一步完善了該藥質(zhì)量控制方法，且方法簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可為客觀系統(tǒng)地評價消栓腸溶膠囊的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

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（收稿日期：2019-05-06 修回日期：2019-05-31）

（編輯：劉 萍）