UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)結(jié)合UNIFI數(shù)據(jù)庫(kù)快速分析止痛化癥膠囊的化學(xué)成分

吳福林 王翠竹 董慶海 王涵 譚靜 林紅強(qiáng) 劉金平 李平亞

中圖分類號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）17-2336-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.17.07

摘 要 目的：對(duì)止痛化癥膠囊（簡(jiǎn)稱“ZTHZC”）中的化學(xué)成分進(jìn)行快速鑒定，為進(jìn)一步闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和全面質(zhì)量控制提供參考。方法：采用超高效液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)對(duì)ZTHZC中化學(xué)成分進(jìn)行分離。通過(guò)查閱ZTHZC化學(xué)成分及其單味中草藥的化學(xué)成分相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，將化學(xué)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)保存成.mol格式的文件，補(bǔ)充完善UNIFI數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)UNIFI數(shù)據(jù)庫(kù)篩查，對(duì)ZTHZC中化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，依據(jù)其精確分子質(zhì)量、特征離子、中性丟失、二級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律、色譜保留行為以及結(jié)合對(duì)照品信息和文獻(xiàn)報(bào)道等對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：共鑒定出了70個(gè)化學(xué)成分，包括 38個(gè)有機(jī)酸及有機(jī)酸酯類、8個(gè)生物堿類、9個(gè)黃酮類、5個(gè)三萜皂苷類、5個(gè)醛類、2個(gè)酮類、1個(gè)醌類、1個(gè)聚炔類和1個(gè)單萜類化合物。結(jié)論：建立的方法能快速檢測(cè)、鑒定ZTHZC的化學(xué)成分，本研究結(jié)果為其質(zhì)量控制、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 止痛化癥膠囊;化學(xué)成分;UNIFI數(shù)據(jù)庫(kù);超高效液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

Rapid Analysis of Chemical Components of Zhitong Huazheng Capsules Based on UPLC-Q-TOF/MS Technology Combined with UNIFI Database

WU Fulin，WANG Cuizhu，DONG Qinghai，WANG Han，TAN Jing，LIN Hongqiang，LIU Jinping，LI Pingya（School of Pharmacy， Jilin University， Changchun 130021， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To rapidly identify chemical components of Zhitong huazheng capsules （shorted for “ZTHZC”）， and to provide reference for further elucidating the pharmacodynamic material basis and overall quality control. METHODS： UPLC-Q-TOF/MS method was adopted to separate the chemical components of ZTHZC. By reviewing literatures that related to chemical components of ZTHZC and its single Chinese traditional medicinal crops， the chemical structure of the chemical components was saved into a .mol format file， and supplemented the UNIFI database. The chemical constituents of ZTHZC were qualitatively analyzed by UNIFI database screening， and validated according to their precise molecular mass， characteristic ions， neutral loss， secondary mass spectrometry cleavage， chromatographic retention behavior， combined reference information and literature reports. RESULTS： A total of 70 chemical components were identified in this experiment， including 38 organic acids and organic acid esters， 8 alkaloids， 9 flavonoids， 5 triterpenoid saponins， 5 aldehydes， 2 ketones， 1 quinone， 1 polyacetylene and 1 monoterpenoid. CONCLUSIONS： This study provides a rapid detection and identification method for chemical components of ZTHZC， and also provides a scientific basis for the clarification of ZTHZC’s quality control and pharmacodynamics.

KEYWORDS Zhitong huazheng capsules; Chemical components; UNIFI database; UPLC-Q-TOF/MS

止痛化癥膠囊（簡(jiǎn)稱“ZTHZC”）是由黨參、炙黃芪、炒白術(shù)、丹參、當(dāng)歸、雞血藤、三棱等19味中藥炮制而成，主治益氣活血、散結(jié)止痛，用于氣虛血瘀所致的月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)，癥見(jiàn)行經(jīng)后錯(cuò)、經(jīng)量少、有血塊、行經(jīng)小腹疼痛，慢性盆腔炎見(jiàn)上述證候者[1]。臨床上將其廣泛用于治療痛經(jīng)、盆腔炎及子宮腺肌病等婦科疾病[2-5]，療效甚好。目前，對(duì)于ZTHZC化學(xué)成分的研究主要集中在幾種有效成分（如丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B）的含量測(cè)定上[6-8]，制劑中許多其他化學(xué)成分還未明確。而中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，因此，對(duì)于ZTHZC藥效物質(zhì)基礎(chǔ)需要進(jìn)一步研究。

近年來(lái)，超高效液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)已經(jīng)成為天然藥物中活性成分快速分離和鑒定的有力手段。而UNIFI數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)簡(jiǎn)單、高效、全面的平臺(tái)，包括從600多種中藥中發(fā)現(xiàn)的6 000多種化合物信息，能夠?qū)?shù)據(jù)采集、峰提取、分子式確定、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及生成報(bào)告相結(jié)合，對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行快速、全面地定性分析[9]。將UPLC-Q- TOF/MS與UNIFI數(shù)據(jù)庫(kù)相結(jié)合，已經(jīng)被應(yīng)用到傳統(tǒng)中藥及復(fù)方中化學(xué)成分的快速鑒定中[10-12]。基于此，本研究將采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)結(jié)合UNIFI數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)ZTHZC的化學(xué)成分進(jìn)行快速、全面的篩查分析，為進(jìn)一步闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及全面的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Xevo G2-XS Q-TOF四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLC 二元泵和樣品管理器（美國(guó)Waters公司）;N-A35氮?dú)獍l(fā)生器（上海金浪科技有限公司）;FA1104N 電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）;R501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）;TGL-16aR飛鴿超離速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

ZTHZC（吉林金寶藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20161010，規(guī)格：0.3 g/粒）;木樨草素（批號(hào)：111520- 200504）、阿魏酸（批號(hào)：110773-201012）、山柰酚（批號(hào)：110861-201310）、檸檬酸（批號(hào)：111679-201602）、咖啡酸（批號(hào)：110885-201102）、咖啡酸乙酯（批號(hào)：111678- 200401）、原兒茶醛（批號(hào)：110810-200205）、黃芪甲苷（批號(hào)：0781-200311）、迷迭香酸（批號(hào)：11871-2001102）、雙氫槲皮素（批號(hào)：180317）等10個(gè)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（純度：均≥98%）;延胡索乙素（批號(hào)：17022720）、黨參炔苷（批號(hào)：17062207）、紫草酸（批號(hào)：171220）、奎寧酸（批號(hào)：20150321）、丹酚酸B（批號(hào)：150927）、芒柄花黃素（批號(hào)：17031005）、丹參素（批號(hào)：151106）、原兒茶酸（批號(hào)：171109）、丹酚酸A（批號(hào)：171217）、丹酚酸C（批號(hào)：171105）等10個(gè)對(duì)照品均購(gòu)自北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司（純度：均≥98%）;乙腈（美國(guó)Fisher公司，色譜級(jí)）;甲酸鈉、亮氨酸-腦啡肽（美國(guó)Sigma公司，色譜級(jí)）;水為屈臣氏純凈水。

2 方法

2.1 樣品溶液的制備

取ZTHZC內(nèi)容物，研細(xì)，過(guò)40目篩。取粉末約1 g，用80%甲醇在80 ℃水浴中提取3次，每次3 h，合并3次提取液。將提取液過(guò)濾后，將濾液合并，旋干。用80%甲醇1.0 mL將提取物溶解，過(guò)0.22 μm濾膜，收集濾液，備用。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱定對(duì)照品木樨草素0.001 1 g、阿魏酸0.001 0 g、山柰酚0.001 2 g、檸檬酸0.001 3 g、咖啡酸0.001 5 g、咖啡酸乙酯0.001 6 g、原兒茶醛0.001 8 g、黃芪甲苷0.002 1 g、迷迭香酸0.001 5 g、雙氫槲皮素0.001 9 g、延胡索乙素0.002 5 g、黨參炔苷0.001 1 g、紫草酸0.002 6 g、奎寧酸0.001 4 g、丹酚酸B 0.002 7 g、芒柄花黃素0.002 3 g、丹參素0.002 4 g、原兒茶酸0.002 1 g、丹酚酸A 0.001 6 g、丹酚酸C 0.002 6 g，置于同一10 mL量瓶中，加入甲醇溶解，定容，即得。

2.3 檢測(cè)條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;柱溫：30 ℃;樣品管理器溫度：15 ℃;流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，10%B;2～26 min，10%→90%B;26～28 min，90%B;28～29 min，90%→10%B;29～30 min，10%B）;流速：0.4 mL/min;進(jìn)樣體積：10 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子化源（ESI），連續(xù)掃描模式，采用正、負(fù)離子檢測(cè)模式（ESI+、ESI-）;掃描范圍：質(zhì)荷比（m/z）100～1 500;毛細(xì)管電壓：3.0 kV;錐孔電壓：40 V;錐孔氣流量：50 L/h;脫溶劑氮?dú)饬髁浚?00 L/h;氬氣流量：0.15 mL/min;離子化源溫度：120 ℃;脫溶劑氣溫度：300 ℃。采用亮氨酸-腦啡肽[M+H]+質(zhì)荷比（m/z）為556.277 1、[M-H]- m/z為 554.262 0作為L(zhǎng)ock Spray校正標(biāo)準(zhǔn)液（100 pg/mL），對(duì)儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)校正，其校正流速為正離子模式（15 μL/min），使用甲酸鈉溶液對(duì)儀器進(jìn)行校正。

2.4 數(shù)據(jù)的采集與處理

取“2.1”項(xiàng)下樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，記錄圖譜。采用UPLC-Q-TOF/MS 模式采集數(shù)據(jù)，使用UNIFI數(shù)據(jù)庫(kù)軟件進(jìn)行ZTHZC化學(xué)成分的自動(dòng)識(shí)別。第一步，先通過(guò)查閱ZTHZC化學(xué)成分及其單味中草藥的化學(xué)成分相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，將化學(xué)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)保存成.mol格式的文件，然后導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI數(shù)據(jù)庫(kù)中，作為原有的傳統(tǒng)中藥庫(kù)的補(bǔ)充，并建立了ZTHZC數(shù)據(jù)庫(kù);第二步，將原始數(shù)據(jù)通過(guò)Waters Compression and Archival Tool v1.10軟件進(jìn)行壓縮;第三步，應(yīng)用UNIFI數(shù)據(jù)庫(kù)軟件自動(dòng)篩查、鑒定化合物，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的人工提峰、計(jì)算分子式以及分析碎片斷裂情況;第四步，建立一個(gè)過(guò)濾篩選方法，即設(shè)定質(zhì)量誤差為-5～5 ppm，且響應(yīng)值大于3 000;最后，通過(guò)結(jié)合碎片離子理論精確質(zhì)量數(shù)、相對(duì)保留時(shí)間和分子式匹配軟件Elemental composition、化合物結(jié)構(gòu)匹配軟件MassFragment、離線及在線質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（PubMed、Mass Bank、Chemspider、METLIN）及相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)各主要化合物進(jìn)行人工識(shí)別和確認(rèn)。

3 結(jié)果

在ZTHZC中共檢測(cè)到70個(gè)化合物，包括38個(gè)有機(jī)酸及有機(jī)酸酯、8個(gè)生物堿、9個(gè)黃酮、5個(gè)三萜皂苷、5個(gè)醛類、2個(gè)酮類、1個(gè)醌類、1個(gè)聚炔類和1個(gè)單萜類化合物。ESI+、ESI-模式下的質(zhì)譜基峰離子流圖見(jiàn)圖1，化合物的鑒定結(jié)果見(jiàn)表1，ZTHZC中鑒定出的各類化合物的結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖2。

3.1 有機(jī)酸及有機(jī)酸酯類化合物的鑒定

有機(jī)酸及有機(jī)酸酯類化合物是ZTHZC的主要活性成分，基于UNIFI數(shù)據(jù)庫(kù)所推斷出的裂解碎片，結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)及對(duì)照品比對(duì)的方法，鑒定出有機(jī)酸及有機(jī)酸酯類化合物38個(gè)，下面以化合物6和化合物65為例，簡(jiǎn)述其鑒定過(guò)程。

（1）化合物6：在ESI-模式下，化合物6的保留時(shí)間為1.03 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z 196.972 7[M-H]-;以m/z 196.972 7[M-H]-為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）掃描，主要產(chǎn)生3個(gè)碎片離子，即m/z 178.966 7[M-H- H2O]-、m/z 152.961 0[M-H-HCOOH] -、m/z 134.993 3[M-H-H2O- HCOOH]-，與丹參素對(duì)照品的碎片離子基本一致，再結(jié)合文獻(xiàn)[13]報(bào)道，可將其鑒定為丹參素。丹參素對(duì)照品和化合物6的MS/MS圖見(jiàn)圖3。

（2）化合物65：在ESI-模式下，化合物65的保留時(shí)間為25.02 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z 281.248 7[M-H]-;以m/z 281.248 7[M-H]-為母離子進(jìn)行MS/MS掃描，主要產(chǎn)生1個(gè)碎片離子，即m/z 265.051 7[M-H-CH3]-，再結(jié)合文獻(xiàn)[14]報(bào)道，可將其鑒定為棕櫚油酸乙酯?；衔?5的MS/MS圖見(jiàn)圖4。

3.2 生物堿類化合物的鑒定

在ESI+模式下，生物堿類化合物共鑒定出8個(gè)，下面以化合物23為例，簡(jiǎn)述其鑒定過(guò)程：化合物23保留時(shí)間為6.64 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z 356.185 6[M+H]+，以m/z 356.185 6[M+H]+為母離子進(jìn)行MS/MS掃描，主要產(chǎn)生5個(gè)碎片離子，即分別為m/z 341.158 2[M+H-CH3]+，m/z 310.136 1[M+H-CH3-OCH3]+，m/z 192.100 9[M+H-C10H12O2]+，m/z 178.085 9[M+H-C11H14O2]+， m/z 150.064 5[M+H- C12H15O2N]+，與延胡索乙素對(duì)照品的碎片離子基本一致，再結(jié)合文獻(xiàn)[15]報(bào)道，可將其鑒定為延胡索乙素。延胡索乙素對(duì)照品和化合物23的MS/MS圖見(jiàn)圖5。

3.3 黃酮類化合物的鑒定

在ESI-模式下，黃酮類化合物共鑒定出9個(gè)，下面以化合物43為例，簡(jiǎn)述其鑒定過(guò)程：化合物43保留時(shí)間為10.51 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z 267.942 6[M-H]-;以m/z 267.942 6[M-H]-為母離子進(jìn)行MS/MS掃描，主要產(chǎn)生1個(gè)碎片離子，即m/z 251.004 4[M-H-CH3]-，這與芒柄花黃素對(duì)照品的碎片離子基本一致，再結(jié)合文獻(xiàn)[16]報(bào)道，可將其鑒定為芒柄花黃素。芒柄花黃素對(duì)照品和化合物43的MS/MS圖見(jiàn)圖6。

3.4 三萜皂苷類化合物的鑒定

在ESI-模式下，三萜皂苷類化合物共鑒定出5個(gè)，下面以化合物47為例，簡(jiǎn)述其鑒定過(guò)程：化合物47保留時(shí)間為11.91 min，準(zhǔn)分子離子m/z 871.454 5[M+HCOO]-;以m/z 871.454 5 [M+HCOO]-為母離子進(jìn)行MS/MS掃描，主要產(chǎn)生2個(gè)碎片離子，即m/z 697.418 2[M-COCH3-C4H8O2]-，m/z 667.167 8[M-H-OCOCH3- C5H10O2]-。結(jié)合文獻(xiàn)[17]報(bào)道，可將其鑒定為黃芪皂苷Ⅱ?；衔?7的MS/MS圖見(jiàn)圖7。

3.5 醛類、酮類及其他類化合物的鑒定

應(yīng)用提取離子色譜法結(jié)合UNIFI數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，在ESI+、ESI-檢測(cè)模式下，推斷出5個(gè)醛類，2個(gè)酮類及其他類成分（包括1個(gè)醌類、1個(gè)聚炔類、1個(gè)單萜類化合物），其鑒定過(guò)程同上（不再一一列出）。

4 討論

在本研究中，筆者首次運(yùn)用 UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)結(jié)合UNIFI數(shù)據(jù)分析平臺(tái)定性分析了ZTHZC中的化學(xué)成分。UPLC能夠?qū)Ω鞒煞诌M(jìn)行高效地分離，Q-TOF- MS具有高靈敏度、高分辨率，能夠進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)，Q-TOF/MS的MS數(shù)據(jù)采集模式可通過(guò)低碰撞能掃描和高碰撞能掃描之間快速切換同時(shí)完成兩種掃描功能的數(shù)據(jù)采集，排除假陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)進(jìn)行母離子、子離子、中性缺失分析。在低碰撞能掃描下得到相關(guān)分子離子峰及其加合峰的信息，在高碰撞能掃描下得到相關(guān)碎片峰的信息，兩者再通過(guò)保留時(shí)間進(jìn)行關(guān)聯(lián)，UNIFI能夠進(jìn)行快速篩查鑒定，將三者結(jié)合，即可實(shí)現(xiàn)快速地分離、檢測(cè)、鑒定ZTHZC的化學(xué)成分。本研究共鑒定了70個(gè)化學(xué)成分，包括38個(gè)有機(jī)酸及有機(jī)酸酯類、8個(gè)生物堿類、9個(gè)黃酮類、5個(gè)三萜皂苷類、5個(gè)醛類、2個(gè)酮類、1個(gè)醌類、1個(gè)聚炔類和1個(gè)單萜類化合物。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）規(guī)定，利用薄層色譜法進(jìn)行丹參鑒別和采用高效液相色譜法測(cè)定丹參素的含量來(lái)控制止痛化癥膠囊的質(zhì)量[1]，但是對(duì)于中藥大復(fù)方，單一的成分含量測(cè)定不足以反映藥品的整體質(zhì)量。而本研究檢測(cè)到的丹酚酸B等酚酸類、延胡索乙素等生物堿類及黃芪甲苷等都可作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，可保障藥品更加有效、安全。本研究為中藥材及中藥復(fù)方化學(xué)成分的分析提供了一種快速檢測(cè)的方法，同時(shí)也為ZTHZC的質(zhì)量控制、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明提供了科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2019-04-02 修回日期：2019-05-20）

（編輯：林 靜）