白藜蘆醇-羥丙基-β-環(huán)糊精-殼聚糖緩釋微球的制備及表征

張純剛 于琛琛 周旖璇 尹麗 程嵐 康廷國(guó) 韓嵐

中圖分類號(hào) R943 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）17-2322-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.17.04

摘 要 目的：制備白藜蘆醇（RES）-羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）-殼聚糖緩釋微球（RES-HP-β-CD-Chitosan），并進(jìn)行表征。方法：按質(zhì)量比1 ∶ ?7 ∶ 0.25稱取RES原料藥、HP-β-CD和殼聚糖，先采用溶劑法制備RES-HP-β-CD包合物，在此基礎(chǔ)上加入殼聚糖，采用噴霧干燥法制得RES-HP-β-CD-Chitosan。采用光學(xué)顯微鏡觀察所制緩釋微球的粒徑。采用X射線衍射法、差式掃描量熱法、紅外光譜法、掃描電子顯微鏡對(duì)所制RES-HP-β-CD-Chitosan進(jìn)行表征。采用紫外分光光度法測(cè)定所制緩釋微球中RES的含量，計(jì)算載藥量和包封率。結(jié)果：所制RES-HP-β-CD-Chitosan的粒徑為（2.23±0.35） μm（n=300），表征結(jié)果顯示，RES-HP-β-CD-Chitosan呈球形，微球表面出現(xiàn)收縮褶皺，RES被包合于羥丙基-β-環(huán)糊精中，以分子狀態(tài)或無(wú)定型狀態(tài)存在。RES-HP-β-CD-Chitosan的載藥量為11.67%（n=3）、包封率為96.27%（n=3）。結(jié)論：成功制得RES-HP-β-CD-Chitosan。

關(guān)鍵詞 白藜蘆醇;羥丙基-β-環(huán)糊精;殼聚糖;制備;表征

Preparation and Quality Evaluation of Resveratrol-Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin-Chitosan Sustained- release Pellets

ZHANG Chungang1，YU Chenchen1，ZHOU Yixuan1，YIN Li1，CHENG Lan1，KANG Tingguo1，HAN Lan2（1.School of Pharmacy， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Liaoning Dalian 116620， China;2.School of Pharmacy， Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Hefei 230012， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To prepare Resveratrol-hydroxypropyl-β-cyclodextrin-chitosan sustained-release pellets （RES-HP-β- CD-Chitosan）， and to characterize it. METHODS： Resveratrol raw material， HP-β-cyclodextrin and chitosan were collected with ratio of 1 ∶ 7 ∶ 0.25. Resveratrol-HP-β-cyclodextrin inclusion compound were prepared by solvent method， and then added into chitosan， RES-HP-β-CD-Chitosan were prepared by spray drying method. Particle size of prepared sustained-released pellets were observed by optical microscope. X-ray， DSC， IR and SEM were used to characterize RES-HP-β-CD-Chitosan. The contents of resveratrol in prepared sustained-released pellets were determined by UV spectrum， and drug-loading amount and encapsulation efficiency were calculated. RESULTS： Particle size of prepared RES-HP-β-CD-Chitosan was （2.23±0.35） μm （n=300）. Characterization results show that RES-HP-β-CD-Chitosan was spherical in shape; shrinkage was found on the surface of microspheres， and resveratrol was included in HP-β-cyclodextrin in molecule or amorphous state. Drug-loading amount of prepared RES-HP-β-CD-Chitosan was 11.67% （n=3）， encapsulation efficiency was 96.27% （n=3）. CONCLUSIONS： RES-HP-β-CD- Chitosan is prepared successfully.

KEYWORDS ? Resveratrol; Hydroxypropyl-β-cyclodextrin; Chitosan; Preparation; Characterization

白藜蘆醇（Resveratrol，RES）屬于非黃酮類多酚化合物，具有順、反兩種異構(gòu)體，其反式異構(gòu)體的生物活性更強(qiáng)[1]，其主要存在于虎杖、花生、葡萄、桑椹等植物中，藥理作用廣泛，包括抗氧化、抗炎、抗癌、心血管保護(hù)等，具有巨大的開發(fā)研究?jī)r(jià)值[2-6]。但是由于RES的水溶性差[7]，且具有光敏性[8]，及對(duì)酸堿度敏感[9]，同時(shí)在體內(nèi)代謝迅速[10]，致使口服生物利用度不足1%[11]，嚴(yán)重影響其臨床應(yīng)用。

環(huán)糊精是一類重要的高分子材料，通過與藥物形成包合物結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)提高難溶性藥物溶解性、增強(qiáng)藥物穩(wěn)定性、改善藥物生物利用度等目的[12]。經(jīng)改性后的羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）與天然的β-環(huán)糊精相比，HP-β-CD水溶性大幅度提高，并具有更高的安全性[13]。殼聚糖是自然界存在的一種堿性氨基多糖，具有生物相容性和生物黏附性，可以延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的滯留時(shí)間和釋放時(shí)間，增加機(jī)體對(duì)藥物的吸收[14]。

為了提高RES的溶解性，本文采用溶劑法制備RES-HP-β-CD包合物（RES-HP-β-CD），在此基礎(chǔ)上加入殼聚糖，制備成RES-HP-β-CD-殼聚糖緩釋微球（RES-HP-β-CD-Chitosan），并對(duì)所制緩釋微球進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，以期為RES新制劑的開發(fā)及應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

FA1004 精密電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司）;LC-2010A 高效液相色譜儀（日本島津公司）;UV1600紫外分光光度計(jì)（上海美普達(dá)儀器有限公司）;Bioq-8000噴霧干燥儀[匯和堂生物工程設(shè)備（上海）有限公司];BA300光學(xué)顯微鏡（加拿大Motic公司）;JSM-7800F掃描電子顯微鏡（日本Jeol公司）;ESCALAB 250X射線衍射儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific ? ? 公司）;FTIR-850紅外光譜儀（天津港東科技股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

RES原料藥（武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，批號(hào)：20171225，純度：98%）;RES對(duì)照品（南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)：111535-201502，純度：98%）;HP-β-CD（山東濱州智源生物科技有限公司，批號(hào)：20171201）;殼聚糖（濰坊海之源生物制品有限公司，批號(hào)：160815A）;其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 緩釋微球的制備

2.1.1 RES-HP-β-CD的制備 精密稱取RES原料藥與HP-β-CD，質(zhì)量比為1 ∶ 7，先將HP-β-CD溶于適量乙醇中，然后將RES原料藥加入其中，攪拌下使之溶解，并在室溫下?lián)]干乙醇，即得RES-HP-β-CD。

2.1.2 RES-HP-β-CD-Chitosan的制備 精密稱取殼聚糖溶于1% 醋酸中，將RES-HP-β-CD分散加入到上述溶液中，攪拌，采用噴霧干燥法制備RES-HP-β-CD-Chitosan，其中RES/HP-β-CD/殼聚糖的質(zhì)量比為1 ∶ 7 ∶ 0.25。噴霧干燥工藝參數(shù)：進(jìn)口溫度130 ℃，出口溫度75 ℃，進(jìn)料速度5 mL/min，霧化氣流速8.8 L/min。

2.2 表征

2.2.1 粒徑 采用的BA300光學(xué)顯微鏡直接觀察RES-HP-β-CD-Chitosan的粒徑，記錄大約300粒緩釋微球的直徑，通過計(jì)算平均值得到緩釋微球的粒徑。結(jié)果，RES-HP-β-CD-Chitosan的粒徑為（2.23±0.35） μm（n=300）。

2.2.2 X射線衍射法 使用ESCALAB 250 X射線衍射儀分別對(duì)RES原料藥、HP-β-CD、殼聚糖、RES-HP- β-CD及其處方量的物理混合物、RES-HP-β-CD-Chitosan及其處方量的物理混合物進(jìn)行掃描，2 θ范圍為4°～60°。X射線衍射分析圖見圖1。

由圖1顯示，RES為典型的晶體化合物，其在4°～60°范圍內(nèi)存在明顯的晶體衍射峰，而HP-β-CD、殼聚糖在此范圍內(nèi)無(wú)衍射峰，為無(wú)定形化合物。在兩個(gè)物理混合物中，RES的晶體衍射峰明顯，說明RES以晶體的形式存在。而在RES-HP-β-CD和RES-HP-β- CD-Chitosan中，并未發(fā)現(xiàn)RES的晶體衍射峰，提示RES被包合于HP-β-CD中。

2.2.3 差示掃描量熱法 采用差示掃描量熱法分別對(duì)RES原料藥、HP-β-CD、殼聚糖、RES-HP-β-CD及其處方量的物理混合物、RES-HP-β-CD-Chitosan及其處方量的物理混合物進(jìn)行檢測(cè)，置于鋁制坩堝中，以空坩堝作為參考池，升溫速度為10 ℃/min，掃描范圍為30～300 ℃。差示掃描量熱分析圖見圖2。

由圖2顯示，RES玻璃轉(zhuǎn)化溫度（Tg）為181 ℃[1]，在272 ℃出現(xiàn)其藥物熔點(diǎn)峰;其余樣品在90 ℃左右均出現(xiàn)一寬峰，這可能是由于樣品中所含的水分蒸發(fā)所致的吸熱峰;HP-β-CD和殼聚糖以無(wú)定形形態(tài)存在，未顯示熔融吸熱峰;兩個(gè)物理混合物中均存在一個(gè)熔融吸熱峰，說明其中的RES仍以晶體存在，其峰形較寬、較鈍，且溫度較RES原料藥的熔點(diǎn)低，這可能是由于溫度高于Tg，藥物處于高彈態(tài)，藥物分子的熱運(yùn)動(dòng)速率增加，使部分藥物分子進(jìn)入HP-β-CD空腔，部分藥物分子與HP-β-CD外部的羥丙基形成氫鍵緊密連接，從而對(duì)藥物的熔點(diǎn)存在抑制。RES-HP-β-CD和RES-HP-β-CD-Chitosan中均未出現(xiàn)RES的熔點(diǎn)峰，說明其中的RES以分子狀態(tài)或無(wú)定型狀態(tài)存在。

2.2.4 紅外光譜法 使用紅外光譜儀分別對(duì)RES原料藥、HP-β-CD、殼聚糖、RES與HP-β-CD 物理混合物、RES-HP-β-CD、RES-HP-β-CD-Chitosan及其處方量的物理混合物進(jìn)行掃描，通過溴化鉀（KBr）壓片的方法，在 ?4 000～400 cm-1的條件范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。紅外光譜分析圖見圖3。

由圖3顯示，RES的特征峰有3 305 cm-1、1 515 cm-1和1 380 cm-1（酚苯環(huán)）、964 cm-1、827 cm-1和678 cm-1。HP-β-CD 的特征峰有3 448 cm-1、2 937 cm-1、1 654 cm-1、1 049 cm-1以及757 cm-1、850 cm-1、935 cm-1（葡萄糖環(huán)特征吸收峰）。殼聚糖的特征峰是—OH與N—H因氫鍵作用而致伸縮振動(dòng)吸收峰重疊形成的，其波長(zhǎng)為3 480 cm-1。在兩個(gè)物理混合物的紅外光譜中仍存在RES的酚苯環(huán)特征峰。而在RES-HP-β-CD、RES-HP-β-CD-Chitosan的紅外光譜中均未發(fā)現(xiàn)RES的酚苯環(huán)吸收峰，提示RES被包合于HP-β-CD中。

2.2.5 掃描電子顯微鏡 精密稱取少量RES原料藥、RES-HP-β-CD和RES-HP-β-CD-Chitosan，涂布在帶有雙面黏附膠的玻璃片上，操作電壓為20 kV，使用掃描電子顯微鏡觀察不同樣品粒子表面的微觀形態(tài)。掃描電子顯微鏡圖見圖4。

由圖4顯示，RES原料藥為棒狀晶體，制成RES-HP-β-CD、RES-HP-β-CD-Chitosan后，藥物分散均勻，且未出現(xiàn)RES原料藥晶體，這進(jìn)一步證實(shí)了RES被包合于HP-β-CD中。此外，RES-HP-β-CD-Chitosan呈球形，由于熱脹冷縮現(xiàn)象，其表面出現(xiàn)收縮褶皺。

2.3 RES含量的測(cè)定

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 稱取RES對(duì)照品適量，加1%醋酸溶液10 mL，超聲（功率：180 W，頻率：59 kHz，下同）使其溶解，加入無(wú)水乙醇定容至100 mL，在200～400 nm進(jìn)行紫外掃描。按RES-HP-β-CD-Chitosan制備方法制備不含RES的空白輔料，同法制備成空白輔料溶液，在200～400 nm進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果顯示，RES在307 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，空白輔料溶液在307 nm波長(zhǎng)處無(wú)吸收，故確定RES的檢測(cè)波長(zhǎng)為307 nm。紫外吸收光譜圖見圖5。

2.3.2 線性關(guān)系的考察 精密稱取RES對(duì)照品30 mg，加1%醋酸溶液10 mL，超聲使其溶解，再用無(wú)水乙醇定容至100 mL。分別用移液管移取上述溶液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL，置于100 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇定容，于307 nm波長(zhǎng)處測(cè)定RES的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為y=0.130 1x-0.009 2（R2=0.999 7），結(jié)果表明，RES檢測(cè)質(zhì)量濃度在1.8～6.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取RES-HP-β-CD-Chitosan適量（約相當(dāng)于30 mg RES），置于100 mL量瓶中，加1%醋酸溶液10 mL，超聲使其溶解，再用無(wú)水乙醇定容至刻度，再用移液管量取1 mL，置于100 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇定容制成供試品溶液。供試品溶液在室溫下放置0、1、2、4、8、12 h后，于307 nm波長(zhǎng)處測(cè)定RES的吸光度。結(jié)果，RES吸光度的RSD<1%（n=6），表明RES在室溫下放置12 h的穩(wěn)定性良好。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取RES對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備RES質(zhì)量濃度分別為2.4、4.2、5.4 μg/mL的無(wú)水乙醇溶液，于307 nm波長(zhǎng)處測(cè)定RES的吸光度，同日內(nèi)每個(gè)濃度測(cè)定3次，連續(xù)測(cè)定3 d，考察日內(nèi)精密度和日間精密度。結(jié)果，RES吸光度的日內(nèi)、日間RSD均<2.0%（n=3）。

2.3.5 回收率試驗(yàn) 稱取24、30、36 mg的RES對(duì)照品，分別加入相應(yīng)處方量的空白輔料，置于100 mL量瓶中，加1%醋酸溶液10 mL，超聲使其溶解，并用無(wú)水乙醇定容至刻度，制備成RES質(zhì)量濃度分別為2.4、3.0、3.6 ? ?μg/mL的溶液，于307 nm波長(zhǎng)處測(cè)定RES的吸光度，計(jì)算含量。以測(cè)定值/加入值×100%計(jì)算回收率。結(jié)果，平均回收率分別為100.0%、100.24%、99.7%，RSD=1.77%（n=3）。

2.4 載藥量與包封率的測(cè)定

精密稱取RES-HP-β-CD-Chitosan適量（約相當(dāng)于30 mg RES），置于100 mL量瓶中，加適量1 %醋酸溶液10 mL，超聲使其溶解，再用無(wú)水乙醇定容至刻度，用移液管量取1 mL，置于100 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇定容。于307 nm波長(zhǎng)處測(cè)定RES的吸光度，計(jì)算含量，再按以下公式計(jì)算載藥量和包封率。載藥量=微球中含藥量/微球總質(zhì)量×100%;包封率=微球?qū)嶋H含藥量/微球理論含藥量×100%。結(jié)果，RES-HP-β-CD-Chitosan中RES的載藥量為11.67%（n=3），包封率為96.27%（n=3）。

3 討論

為了改善RES的水溶性差的問題，本試驗(yàn)采用HP-β-CD包合RES，以提高RES的體外溶解度;再通過加入殼聚糖制備成RES-HP-β-CD-Chitosan，使該RES制劑在體內(nèi)呈現(xiàn)出生物黏附特性和緩釋的特性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，RES在RES-HP-β-CD-Chitosan中處于分子狀態(tài)或無(wú)定型狀態(tài)。RES分子間的水難溶性主要是由于其分子間發(fā)生分子內(nèi)的氫鍵鍵合，使其水溶性降低[15]。本研究通過采用HP-β-CD包合，避免了RES分子間氫鍵鍵合，相鄰的RES分子由于HP-β-CD包合作用不能通過分子間氫鍵鍵合，以及環(huán)糊精的包合作用可以有效的增加藥物的水溶性。從X射線衍射、差式掃描量熱、紅外光譜及掃描電鏡結(jié)果來看，RES藥物在制劑中以非晶形存在，由于藥物以非晶形的狀態(tài)存在，因此降低了藥物在介質(zhì)中溶解過程的活化能，使藥物可以更快速地溶解，提高溶解度。再則本試驗(yàn)的制備方法簡(jiǎn)單可行，較容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

本文并沒有測(cè)試RES-HP-β-CD-Chitosan的Zeta電位。主要是由于RES-HP-β-CD-Chitosan是固體粉末，如加入到水中混懸測(cè)定Zeta電位，會(huì)導(dǎo)致HP-β-CD從微球中溶解出來，不能保持其原有結(jié)構(gòu)，使測(cè)定值不準(zhǔn)確;如果使用乙醇作為分散介質(zhì)來測(cè)定RES-HP-β-CD-Chitosan的Zeta電位，則會(huì)導(dǎo)致藥物和環(huán)糊精都溶解在介質(zhì)中，同樣不能準(zhǔn)確測(cè)定出Zeta電位。再則注射用的納米制劑測(cè)定Zeta電位主要是考察制劑的穩(wěn)定性。但是相比于注射的納米制劑，本文制備的RES-HP-β-CD-Chitosan的粒徑較大，制劑的粉末流動(dòng)性較好;并且口服微球進(jìn)入胃腸道以后，由于胃液及腸液的pH值影響，微球的Zeta電位對(duì)該制劑在體內(nèi)的運(yùn)輸、傳遞及釋放等方面可能影響較小。因此基于上述幾點(diǎn)原因本研究并沒有測(cè)定微球的Zeta電位。

殼聚糖是自然界廣泛存在的多糖，其具有良好的生物相容性、生物黏附性，且對(duì)細(xì)胞無(wú)毒[16]。本試驗(yàn)制備的RES-HP-β-CD-Chitosan有可能提高RES藥物的吸收主要原因如下：（1）口服后殼聚糖質(zhì)子化后，可在微球表面形成凝膠，使藥物緩慢釋放;（2）由于細(xì)胞膜表面為負(fù)電荷，通過正、負(fù)電荷吸引殼聚糖與黏膜產(chǎn)生黏附作用，延長(zhǎng)藥物在胃腸道的滯留時(shí)間，從而加藥物吸收[17];（3）殼聚糖可以打開腸道細(xì)胞之間連接，增加藥物的吸收[18]。

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（收稿日期：2019-06-18 修回日期：2019-08-07）

（編輯：鄒麗娟）