膽南星發(fā)酵制品與混合蒸制品的鑒別研究

陳云 陳勁松 郁紅禮 吳皓 王衛(wèi) 程梓燁 單雪蓮 蔡寶昌

摘要? 目的：以豬膽汁及天南星、制天南星為原料分別制備發(fā)酵制膽南星及混合蒸制膽南星，以膽汁酸類成分為指標(biāo)，建立以豬膽汁為炮制輔料的膽南星2種炮制品的薄層鑒別及HPLC-ELSD特征圖譜。方法：采用硅膠G薄層板，以石油醚：丙酮：冰醋酸（11∶ 8∶ 0.8）為展開劑，10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，建立薄層色譜鑒別方法。采用Agilent Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈與0.1%冰醋酸水為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，ELSD：漂移管溫度為105 ℃，氮?dú)饬髁繛?.5 mL/min，建立膽南星HPLC-ELSD特征圖譜鑒別方法。結(jié)果：TLC和HPLC-ELSD圖譜均顯示發(fā)酵制膽南星可檢測到游離型膽汁酸類成分豬膽酸（HCA）、豬去氧膽酸（HDCA）和鵝去氧膽酸（CDCA）3個(gè)特征成分，而混合蒸制膽南星中未檢測出;混合蒸制膽南星可檢測到結(jié)合型膽汁酸類成分甘氨豬去氧膽酸（GHDCA）和甘氨鵝去氧膽酸（GCDCA）2個(gè)特征成分，而發(fā)酵制膽南星中未檢測出。結(jié)論：所建膽汁酸類成分的薄層色譜鑒別法（TLC）和高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法（HPLC-ELSD）均可有效鑒別膽南星的發(fā)酵制品和混合蒸制品，為膽南星質(zhì)量控制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞? 膽南星;膽汁酸類成分;薄層色譜鑒別;HPLC-ELSD特征圖譜;炮制;發(fā)酵;蒸制

Study on Identification of Fermentation Products and Mixed Steamed Products of Arisaema Cum Bile

Chen Yun1，Yu Hongli1，2，3，Wu Hao1，2，3，Chen Jinsong4，Wang Wei1，Cheng Ziye1，Shan Xuelian1，Cai Baochang1，2，3

（1 Pharmacology College of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 2 Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicine Processing，Nanjing 210023，China; 3 Engineering Center of State Ministry of Education for Standardization of Chinese Medicine Processing，Nanjing 210023，China; 4 Sichuan Qianyuan traditional Chinese Medicine Decoction Co.，Ltd.Guanghan 618304，China）

Abstract Objective： Using pig bile and Arisaematis Rhizome and Arisaematis Rhizoma Preparatum as raw materials，the fermenting and mixed evaporating of arisaema cum bile were prepared respectively，and the bile acids were used as the index.To establish thin layer identification and HPLC-ELSD characteristic map of 2 processed products from porcine bile.Methods Silica gel G thin layer plate was applied，and petroleum ether：acetone：glacial acetic acid （11∶ 8∶ 0.8） were used as developing agent and 10% sulfuric acid ethanol solution as chromogenic agent，a TLC identification method was established.An Agilent Eclipse XDB C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm） column was used，with acetonitrile and 0.1% glacial acetic acid water as mobile phase for gradient elution.The flow rate was 1 mL/min，at 30 ℃ and ELSD：drift tube at 105 ℃.The identification method of HPLC-ELSD characteristic map of arisaema cum bile was established by nitrogen flow rate of 2.5 mL/min. Results： TLC and HPLC-ELSD spectra showed that three characteristic components of free hyocholic acid （HCA），hyodeoxycholic acid （HDCA） and chenodeoxycholic acid （CDCA），could be detected in fermented arisaema cum bile，but not in mixed evaporation.Two characteristic components of conjugated bile acids，（GHDCA） and （GCDCA），could be detected by mixed evaporation of arisaema cum bile，but not in the fermentation of arisaema cum bile. Conclusion： TLC and HPLC-ELSD can be used to identify the fermented and mixed distilled products of arisaema cum bile which can provide the basis for the quality control of arisaema cum bile.

Key Words? Arisaema cum bile; Bile acid components; TLC identification; HPLC-ELSD characteristic map; Processing; Fermentation; Steaming

中圖分類號：R282.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.006

《中華人民共和國藥典》2015版收載膽南星（Arisaema cum bile）制法為制天南星的細(xì)粉與牛、羊或豬膽汁經(jīng)加工而成，或?yàn)樯炷闲羌?xì)粉與牛、羊或豬膽汁經(jīng)發(fā)酵加工而成[1]。具有清熱化痰，息風(fēng)定驚的功效，臨床上多用于小兒百日咳、癲癇病、中風(fēng)等疾病的治療[1]。通過查閱全國及各省市炮制規(guī)范，膽南星的炮制方法主要有發(fā)酵法和混合蒸制法2種。全國各地2種炮制方法的炮制工藝差異較大，并且炮制輔料膽汁用量也存在很大差異。本課題組前期以豬膽汁為原料，按照《全國中藥炮制規(guī)范》（1988版） 中膽南星項(xiàng)下2種炮制方法自制膽南星，通過對膽南星2種炮制品炮制前后的成分分析，發(fā)現(xiàn)膽汁酸類成分發(fā)生明顯變化[2-3]。由于膽南星的原藥材為天南星或制天南星，天南星味苦，辛溫，為有毒中藥[4-7]，膽南星為其炮制品之一，用膽汁炮制后的2種膽南星炮制品均可達(dá)到減毒存效的作用[8-11]，且膽汁具有調(diào)節(jié)免疫力、鎮(zhèn)靜安神的功效，膽汁中的膽汁酸類成分被認(rèn)為是其主要藥效成分[12-14]。因此，本文以膽南星2種炮制品中所含膽汁酸類成分為指標(biāo)性成分，采用薄層色譜鑒別法（TLC）和高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法（HPLC-ELSD）對膽南星2種炮制品中膽汁酸類成分進(jìn)行分析鑒別。建立切實(shí)可行、操作簡單的鑒別方法，為膽南星的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 BP211D電子天平（德國Sartorius公司）;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 （上海維誠儀器有限公司）;Milli-Q純水儀（南京耀靈生物科技有限公司）;打粉機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）;四號篩網(wǎng)（江蘇南京市雄晨篩網(wǎng)廠）;超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。ZF7三用紫外分析儀（上海康華生化儀器制造有限公司）;DB-2型不銹鋼電熱板（江蘇金壇市金城園勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）。Waters 2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司），配Waters 2996型ELSD 2000ES（美國Alltech公司）檢測器，Empower色譜工作站;移液管;容量瓶;注射器;0.45 μm微孔濾膜（天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;圓底燒瓶。

1.2 試劑 乙醇（分析純，批號170308076K）、冰醋酸（分析純，批號151009910E）均購自南京化學(xué)試劑有限公司;石油醚（分析純，批號20160818）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;丙酮（分析純，批號Lot.No.20180105）、硫酸（分析純，批號Lot.No.20161026）均購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;水為超純水;膽汁購自南京市棲霞區(qū)農(nóng)貿(mào)市場的新鮮豬膽囊，經(jīng)紗布過濾，去除絮狀物，于-20 ℃保存，備用。

對照品：豬膽酸（Hyocholic Acid，HCA，大于98%）購自甄準(zhǔn)生物科技有限公司;豬去氧膽酸（Hyodeoxycholic Acid，HDCA，大于98%）、鵝去氧膽酸（Chenodeoxycholic Acid，CDCA，大于98%）、甘氨豬去氧膽（Glycohyodeoxycholic Acid，GHDCA，大于97%）、甘氨鵝去氧膽酸（Glycochenodeoxycholic Acid，GCDCA，大于97%）均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 分析樣品 天南星藥材由四川仟源中藥飲片有限公司提供，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為天南星科植物天南星（ Arisaematis rhizoma）的干燥塊莖;制天南星（Arisaematis rhizoma preparatum ）采用生天南星按照《中華人民共和國藥典》2015年版制天南星項(xiàng)下的炮制方法自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 膽南星樣品制備 發(fā)酵法：按照《全國中藥炮制規(guī)范-1988》：取生天南星粉末，加入凈膽汁（天南星：膽汁=1∶ 4），攪拌拌勻，放溫暖處，發(fā)酵7～15 d后，再連續(xù)蒸或隔水燉9晝夜，每2 h攪拌1次，除去腥臭氣。至呈黑色浸膏狀，口嘗無麻味為度，取出，晾干。再蒸軟，趁熱制成小塊。

混合蒸制法：按照《全國中藥炮制規(guī)范-1988》：取生天南星粉末，加入凈膽汁（天南星：膽汁=1∶ 4）拌勻，蒸60 min至透，取出放涼，制成小塊，干燥。

2.2 膽南星中膽汁酸類成分的薄層色譜鑒別

2.2.1 薄層色譜條件 按照2015年版《中華人民共和國藥典》第4部（通則0502）項(xiàng)下薄層色譜法操作，吸取上述對照品溶液和供試品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚：丙酮：冰醋酸（11∶ 8∶ 0.8）為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外燈下（365 nm）檢視。在膽南星供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，結(jié)果見圖1。

2.2.2 對照品溶液的制備 取豬膽酸（HCA）、豬去氧膽酸（HDCA）、鵝去氧膽酸（CDCA）、甘氨豬去氧膽酸（GHDCA）和甘氨鵝去氧膽酸（GCDCA）對照品適量，精密稱定，加80%乙醇分別制成每1 mL含豬膽酸0.44 mg、豬去氧膽酸1.894 mg、鵝去氧膽酸1.026 mg、甘氨豬去氧膽酸1.108 mg、甘氨鵝去氧膽酸1.048 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取膽南星粉末（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加80%乙醇20 mL，加熱回流30 min，放冷，過濾，濾渣再加80%乙醇20 mL繼續(xù)回流30 min，放冷，過濾，合并2次濾液，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加80%乙醇定容至刻度。

3 膽汁酸類成分的HPLC特征圖譜鑒別

3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流速：1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL;流動相：乙腈（A）-0.1%乙酸（B）;梯度洗脫程序：0～2 min，25% ～33%乙腈;2～20 min，33% ～62%乙腈;20～25 min，62% ～25%乙腈;25～26 min，25% ～25%乙腈。

ELSD條件：載氣流速2.5 mL/min，漂移管溫度：105 ℃。

3.2 對照品溶液的制備 同“2.2.2”項(xiàng)下方法。

3.3 供試品溶液的制備 同“2.2.3”項(xiàng)下方法。

3.4 樣品測定法 分別精密吸取對照提取物溶液與供試品溶液各10 μL，注人液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，即得。

3.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取自制發(fā)酵膽南星和自制混合蒸制膽南星粉末（過四號篩），按照上述供試品溶液制備方法，制備供試品溶液，按照上述檢測方法進(jìn)行測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，各共有峰保留時(shí)間與峰面積的 RSD 值均小于5.0%，表明儀器精密度良好，符合特征圖譜研究要求。

3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批取自制發(fā)酵膽南星和自制混合蒸制膽南星粉末（過四號篩），按照上述供試品溶液制備方法，重復(fù)制備供試品溶液6份。分別進(jìn)行檢測，結(jié)果色譜圖中各共有峰保留時(shí)間與峰面積的 RSD 值均小于5.0%，表明重復(fù)性良好，符合特征圖譜研究要求。

3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取自制發(fā)酵膽南星和自制混合蒸制膽南星粉末（過四號篩），按照上述供試品溶液制備方法，制備供試品溶液，按照上述檢測方法分別在0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h進(jìn)行檢測，記錄各色譜峰的各共有峰保留時(shí)間與峰面積的 RSD 值均小于5.0%，表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性較好，符合特征圖譜研究要求。

3.8 膽南星膽汁酸類成分特征圖譜的建立

結(jié)果表明，膽南星的發(fā)酵制品與混合蒸制品中所含膽汁酸類成分差異較大，因此，對膽南星的發(fā)酵制品與混合蒸制品分別建立膽汁酸類成分HPLC特征圖譜，結(jié)果見圖2。通過各廠家膽南星與自制發(fā)酵膽南星和自制混合蒸制膽南星比較，發(fā)現(xiàn)四川千方、四川輔正、四川弘升、四川仟源4個(gè)廠家的膽南星樣品與發(fā)酵制膽南星的特征成分相一致，經(jīng)國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)A版軟件”（2012版），自動匹配分析，標(biāo)定5共有峰，其中峰3、4、5與對照品對照，分別定性為游離型膽汁酸類成分豬膽酸（HCA）、豬去氧膽酸（HDCA）、鵝去氧膽酸（CDCA），結(jié)果見圖2-A。上海同濟(jì)堂、內(nèi)江良輝、上海雷允上、四川百勝、重慶亞峰、湖北天濟(jì)六個(gè)廠家的膽南星樣品與混合蒸制膽南星的特征成分相一致，經(jīng)自行匹配，標(biāo)定6個(gè)共有峰，其中峰2、3與對照品對照，分別定性為結(jié)合型膽汁酸類成分甘氨豬去氧膽酸（GHDCA）、甘氨鵝去氧膽酸（GCDCA），結(jié)果見圖2-B。

因此，在膽南星發(fā)酵制品中可檢測到游離型膽汁酸類成分豬膽酸（HCA）、豬去氧膽酸（HDCA）和鵝去氧膽酸（CDCA）3個(gè)特征峰，而在膽南星混合蒸制品中檢測不到;在膽南星混合蒸制品中可檢測到結(jié)合型膽汁酸類成分甘氨豬去氧膽酸（GHDCA）和甘氨鵝去氧膽酸（GCDCA）2個(gè)特征峰，而在膽南星發(fā)酵制品中未檢測到相應(yīng)特征峰。見圖2。

4 討論

膽南星是批準(zhǔn)文號管理的飲片。根據(jù)市場調(diào)研發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有生產(chǎn)膽南星的廠家使用的膽南星主要以豬膽汁為輔料。本文以豬膽汁中膽汁酸類成分作為膽南星鑒別的指標(biāo)性成分，為膽南星質(zhì)量控制提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

本文以自制發(fā)酵膽南星和自制混合蒸制膽南星與膽汁酸類成分的混合對照品對照，TCL及HPLC法均顯示發(fā)酵法膽南星中可檢出游離型膽汁酸類成分豬膽酸（HCA）、豬去氧膽酸（HDCA）、鵝去氧膽酸（CDCA）成分，混合蒸制膽南星中可檢出結(jié)合型膽汁酸類成分甘氨豬去氧膽酸（GHDCA）、甘氨鵝去氧膽酸（GCDCA）。因此，以膽汁酸類成分作為膽南星的指標(biāo)性成分，分別建立膽汁酸類成分的薄層鑒別和HPLC特征圖譜，可有效鑒別并區(qū)分市售膽南星的2種炮制品，并控制膽南星質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)市售膽南星中有廠家中的膽汁酸類成分含量極低，幾乎檢不出，此原因可能與廠家在炮制過程中所加膽汁的量及炮制工藝有關(guān)[15-16]，本文建議《中華人民共和國藥典》中膽南星制備方法中規(guī)定輔料膽汁的用量及增加膽南星膽汁酸類成分的鑒別。

本文前期實(shí)驗(yàn)對環(huán)己烷：乙酸乙酯：冰醋酸（8∶ 8∶ 0.8）、石油醚：丙酮：冰醋酸（11∶ 8∶ 0.8）、正己烷：乙酸乙酯：冰醋酸：甲醇（20∶ 25∶ 2∶ 0.8）這3種不同的展開劑體系[17-18]，結(jié)果表明石油醚：丙酮：冰醋酸（11∶ 8∶ 0.8）的展開效果較好，Rf值適中;分別以10%硫酸乙醇溶液和香草醛2種為顯色劑，結(jié)果顯示2種顯色劑均能使游離型膽汁酸類各成分在紫外熒光下斑點(diǎn)更清晰;對不同批號薄層板和不同廠家薄層板進(jìn)行了重現(xiàn)性考察，結(jié)果在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，均顯示相同顏色的斑點(diǎn)，顯示不同批號和不同廠家的薄層板重現(xiàn)性較好;分別考察了高溫（40 ℃）和低溫（4 ℃）的展開效果，結(jié)果顯示高低溫的分離效果相近，受到溫度的影響較小，在高低溫度均可鑒別;通過以硫酸與水不同比例調(diào)節(jié)濕度，分別考察了高濕（88%）和低濕（18%）的展開效果，結(jié)果表明，低濕的分離效果較好，高濕濕的環(huán)境含水量大，導(dǎo)致Rf值整體偏高，影響分離效果。因此，在鑒別時(shí)需要控制濕度，不能過高。

本文前期實(shí)驗(yàn)考察了不同的流動相體系（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%乙酸水）的分析條件，根據(jù)色譜圖比較分析顯示，乙腈-0.1%乙酸水體系的梯度洗脫均可使所有成分達(dá)到有效分離，故選擇乙腈-0.1%乙酸水體系進(jìn)行梯度洗脫。本文對不同流動相梯度體系進(jìn)行比較，通過色譜圖比較，最終確定了在膽汁酸類各指標(biāo)成分分離度好且分析時(shí)間適中的梯度體系。

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