化學(xué)原料藥結(jié)構(gòu)確證的常見分析方法及應(yīng)用

劉忠洪 李鵬熙

摘 要：化學(xué)原料藥的結(jié)構(gòu)確證是藥物研發(fā)的基礎(chǔ)。文中主要介紹結(jié)構(gòu)確證的常用分析方法，包括元素分析（elemental analysis）、可見-紫外吸收光譜（ultraviolet and visible absorption spectra，UV）、紅外吸收光譜（infrared absorption spectrum，IR）、核磁共振譜（nuclear magnetic resonance，NMR）、質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）、X-衍射（X-ray diffraction， XRD）、熱分析（Thermal analysis，TA）等，并結(jié)合其應(yīng)用加以討論。

關(guān)鍵詞：原料藥;結(jié)構(gòu)確證;分析方法

根據(jù)《化學(xué)藥物原料藥制備和結(jié)構(gòu)確證研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》[1]，原料藥的結(jié)構(gòu)確證是藥物研發(fā)的基礎(chǔ)，是保證藥學(xué)其它方面研究、藥理毒理和臨床研究能否順利進(jìn)行的決定性因素。進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證時(shí)，首先應(yīng)根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特征制訂科學(xué)、合理、可行的研究方案，并制備符合研究要求的樣品，再進(jìn)行有關(guān)的結(jié)構(gòu)確證分析研究，最后對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行綜合解析，確證測(cè)試品的結(jié)構(gòu)。

通過結(jié)構(gòu)確證，可以明確藥物分子的平面骨架結(jié)構(gòu)，即各原子的連接順序和方式;明確藥物分子的空間構(gòu)型;確定藥物中的結(jié)晶水或結(jié)晶溶劑含量;明確藥物的晶型，即分子在晶體中的排列方式。通過與對(duì)照品進(jìn)行對(duì)比，可綜合分析原料藥樣品與對(duì)照品是否結(jié)構(gòu)一致。

目前，常用的研究分析方法主要包括元素分析、可見-紫外吸收光譜、紅外吸收光譜、核磁共振譜、質(zhì)譜、X-衍射、熱分析等[2]。本綜述就以上常見的分析方法及其應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)和討論。

1.元素分析

通常采用元素分析法，對(duì)原料藥中存在的元素種類進(jìn)行鑒定，并獲得其含量。分析方法可分為經(jīng)典化學(xué)分析和儀器分析兩類。前者主要采用化學(xué)方法達(dá)到分析目的，后者主要采用化學(xué)和物理方法獲取結(jié)果，這類分析方法往往需要應(yīng)用特定的儀器，靈敏度高，操作簡(jiǎn)便快速，發(fā)展迅速，但是經(jīng)典的化學(xué)分析方法仍有其重要意義。

對(duì)于因藥物自身結(jié)構(gòu)特征而難于進(jìn)行元素分析時(shí)，在保證高純度情況下可采用高分辨質(zhì)譜方法獲得藥物元素組成相關(guān)信息[3]。

2. 可見-紫外吸收光譜

采用可見-紫外吸收光譜法，在不同波長(zhǎng)處吸光度的測(cè)定和吸收系數(shù)（特別是摩爾吸收系數(shù)）的計(jì)算，以及對(duì)主要吸收譜帶的歸屬分析（如K 帶、R 帶、E 帶、B 帶），獲得原料藥結(jié)構(gòu)中可能含有的發(fā)色團(tuán)、助色團(tuán)種類以及可能的連接方式等結(jié)構(gòu)信息。當(dāng)發(fā)色團(tuán)上存在酸性或堿性基團(tuán)，則需在酸或堿溶液中（常用0.1mol/L HCl 或0.1mol/L NaOH）測(cè)試最大吸收波長(zhǎng)，觀察其紫移或紅移現(xiàn)象，進(jìn)一步分析酸性或堿性基團(tuán)的存在[4]。另外，采用紫外吸收光譜可檢驗(yàn)具有大共軛體系或發(fā)色官能團(tuán)的化合物，作為其他鑒定方法的補(bǔ)充。

3. 紅外吸收光譜

有時(shí)原料藥在紫外波長(zhǎng)范圍內(nèi)沒有吸收或者吸收微弱，或紫外吸收光譜特征性不強(qiáng)，可采用紅外吸收光譜進(jìn)行分析。紅外吸收光譜是利用一束不同波長(zhǎng)的紅外射線照射到物質(zhì)的分子上，分子中某個(gè)振動(dòng)頻率與紅外光的某一頻率相同時(shí)，分子就吸收此頻率光發(fā)生振動(dòng)能級(jí)躍遷，形成特殊的光譜。

此法可明確各原子的連接順序和方式，推測(cè)出藥物中可能存在的化學(xué)鍵、所含的官能團(tuán)及其初步的連接方式[5]，亦可給出藥物的幾何構(gòu)型、晶型、立體構(gòu)象等信息。紅外吸收光譜具有高度特征性，可與對(duì)照品紅外吸收光譜進(jìn)行對(duì)比分析鑒定。已有匯集成冊(cè)的標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜集出版，可將這些圖譜貯存在計(jì)算機(jī)中，用以對(duì)比和檢索，進(jìn)行分析鑒定。

4.核磁共振譜

在外磁場(chǎng)的作用下，具有磁矩的原子核存在著不同能級(jí)，當(dāng)用一定頻率的射頻照射分子時(shí)，可引起原子核自旋能級(jí)的躍遷，即產(chǎn)生核磁共振。目前應(yīng)用最多的是氫核磁共振譜（簡(jiǎn)稱氫譜，1H-NMR）和碳核磁共振譜（簡(jiǎn)稱碳譜，13C-NMR），此外還有二維核磁共振譜，包括H-Hcosy（氫-氫相關(guān)譜）、HMBC （碳-氫遠(yuǎn)程相關(guān)譜）、HMQC （碳-氫相關(guān)譜）、NOESY（氫-氫化學(xué)位移交換譜）等。氫譜主要提供質(zhì)子類型及其化學(xué)環(huán)境、氫分布、核間關(guān)系，但不能給出不含氫基團(tuán)的共振信號(hào)，難以鑒別化學(xué)環(huán)境近似的烷烴，且經(jīng)常出現(xiàn)譜線重疊。碳-13核磁共振譜可給出豐富的碳骨架及有關(guān)結(jié)構(gòu)和分子運(yùn)動(dòng)的信息，如分子中含有多少個(gè)碳原子，它們各屬于哪些基團(tuán)，可以區(qū)別伯、仲、叔、季碳原子等。所以氫譜和碳譜互為補(bǔ)充。

采用核磁共振可獲得原料藥某些元素在分子中的類型、數(shù)目、相互連接方式、周圍化學(xué)環(huán)境、甚至空間排列構(gòu)型、結(jié)晶水/結(jié)晶溶劑等信息，并推測(cè)出化合物相應(yīng)官能團(tuán)的連接狀況及其初步的結(jié)構(gòu)[6]。

5. 質(zhì)譜

質(zhì)譜是利用多種離子化技術(shù)，將物質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為離子，按其質(zhì)荷比（m/z）的差異分離測(cè)定，進(jìn)行物質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)分析的方法。其應(yīng)用范圍廣，不受原料藥物態(tài)限制，且靈敏度高、分析速度快、信息直觀、解析方便易行。

質(zhì)譜分析中，由高分辨質(zhì)譜獲得分子離子峰的質(zhì)量數(shù)，可分析得到原料藥的精確相對(duì)分子質(zhì)量;從分子離子峰和碎片離子峰的信息可推測(cè)原料藥化合物的裂解方式及其分子結(jié)構(gòu)關(guān)系;通過同位素峰強(qiáng)比及其分布特征可推算分子中Cl、Br、S等原子數(shù);還可與色譜聯(lián)用（GC-MS、LC-MS）或質(zhì)譜聯(lián)用（MS-MS），為分離、鑒別和定量測(cè)定原料藥，提供滿足結(jié)構(gòu)確證的樣品。

6.X-衍射

X-射線衍射方法是研究晶體最有效的工具，對(duì)原料藥晶型的研究非常理想。常用的方法包括粉末X-衍射（XRPD）和單晶X-衍射（XRSD）。

粉末X-衍射是判斷原料藥晶型的首選方法，可用于固態(tài)單一化合物的鑒別與晶型確定、晶態(tài)與非晶態(tài)物質(zhì)的判斷，亦可用于原料藥（晶型）的穩(wěn)定性研究。

單晶X-衍射可獲得原料藥的相對(duì)或絕對(duì)構(gòu)型、藥物晶型以及原料藥中結(jié)晶水/結(jié)晶溶劑及含量等一系列信息。對(duì)于手性原料藥結(jié)構(gòu)分析，采用普通的單晶X-衍射不能區(qū)分對(duì)映體，僅能推導(dǎo)出在空間的相對(duì)位置和藥物的相對(duì)構(gòu)型。

7.熱分析

熱分析法是在程序控制溫度下，研究物質(zhì)隨溫度的變化，發(fā)生的晶型轉(zhuǎn)化、熔融、蒸發(fā)、脫水等物理變化，或熱分解、氧化還原等化學(xué)變化，以及伴隨發(fā)生的溫度、能量或重量改變。

最常用的熱分析方法有差示熱分析（DTA）、熱重分析（TGA）、導(dǎo)數(shù)熱重量法（DTG）、差示掃描量熱法（DSC）、熱機(jī)械分析（TMA）和動(dòng)態(tài)熱機(jī)械分析（DMA）。采用熱分析法處理原料藥，可反映原料藥的晶型、結(jié)晶水/結(jié)晶溶劑、物相轉(zhuǎn)化、相容性、熱分解和穩(wěn)定性等信息[7]。

除上述七種常用的結(jié)構(gòu)確證分析方法外，根據(jù)原料藥結(jié)構(gòu)特征，還可用其他方法加以輔助支持。例如，采用熔點(diǎn)法和光學(xué)顯微鏡法，測(cè)定原料藥晶型;采用比旋度、圓二色譜推導(dǎo)手性原料藥的絕對(duì)構(gòu)型，采用旋光光譜推導(dǎo)相對(duì)構(gòu)型;干燥失重、水分測(cè)定獲得原料藥中的結(jié)晶水或結(jié)晶溶劑、吸附水或溶劑的含量;結(jié)構(gòu)中含有金屬離子以及F、P 等元素的藥物，可進(jìn)行相應(yīng)金屬原子吸收以及F、P 等元素的測(cè)定。原料藥為多肽，可采用氨基酸分析、質(zhì)譜、序列分析以及肽圖測(cè)繪、紫外、紅外、核磁共振、多種流動(dòng)相HPLC、比旋度測(cè)定等獲得合成多肽的結(jié)構(gòu)信息。

最后將每一種結(jié)構(gòu)確證方法提供的信息進(jìn)行綜合且全面的解析，遵循簡(jiǎn)明扼要、有機(jī)、合理、深入的原則，才能得到原料藥完整的結(jié)構(gòu)情況，為原料藥后續(xù)的研究和應(yīng)用提供有力可靠的支持。

參考文獻(xiàn)

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