猴頭菌多糖對潰瘍性結腸炎模型大鼠腸道短鏈脂肪酸含量的影響

楊永剛 王丹丹 張艷秋 王明星

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）20-2763-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.06

摘 要 目的：探討猴頭菌多糖對潰瘍性結腸炎模型大鼠腸道內(nèi)容物中短鏈脂肪酸（SCFAs）含量的影響。方法：取SD大鼠40只，隨機分為空白組、模型組和猴頭菌多糖低、高劑量組（0.5、1.0 g/kg），每組10只。除空白組外，其余組大鼠采用乙酸灌腸建立潰瘍性結腸炎模型。造模后次日，猴頭菌多糖各劑量組大鼠灌胃給予相應藥液，空白組和模型組大鼠灌胃相應體積的水，連續(xù)給藥10 d。取大鼠結腸組織，采用蘇木精-伊紅染色法觀察其結腸組織病理學變化;肉眼觀察大鼠結腸病變情況并進行潰瘍評分，以評價療效。采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用法檢測大鼠腸道內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸等6種SCFAs的含量。結果：與空白組比較，模型組大鼠結腸黏膜上皮組織炎性病變明顯;結腸黏膜潰瘍評分均顯著升高（P<0.01）;結腸內(nèi)容物中除丙酸外的5種SCFAs含量以及SCFAs總量均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，猴頭菌多糖各劑量組大鼠結腸組織病理學損傷程度明顯減輕;結腸黏膜潰瘍評分均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;結腸內(nèi)容物中除丙酸外的5種SCFAs含量以及SCFAs總量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結論：猴頭菌多糖能有效改善潰瘍性結腸炎模型大鼠的腸黏膜病變情況;其對大鼠腸道中SCFAs（尤其是乙酸、丁酸）含量的調(diào)節(jié)作用可能是其治療潰瘍性結腸炎的重要機制。

關鍵詞 猴頭菌多糖;潰瘍性結腸炎;短鏈脂肪酸;機制;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of Hericium erinaceus polysaccharide on the content of short-chain fatty acids （SCFAs） in the intestine of ulcerative colitis model rats. METHODS： A total of 40 SD rats were randomly divided into blank group， model group and H. erinaceus polysaccharide low-dose and high-dose groups （0.5， 1.0 g/kg）， with 10 rats in each group. Except for blank group， other groups were given acetic acid enema to induce ulcerative colitis model. The next day after modeling， H. erinaceus polysaccharide groups were given relevant medicine solution intragastrically; blank group and model group were given relevant volume of water intragastrically， for 10 consecutive days. Colon tissue was collected， and pathological changes of colon tissue were observed by HE staining. The pathological changes of colon in rats were observed with naked eyes and scored so as to evaluate the therapeutic efficacy. The contents of 6 kinds of SCFAs （acetic acid，propionic acid，butyric acid，isobutyric acid，pentanoic acid and isovaleric acid） in intestine of rats were determined by GC-MS. RESULTS： Compared with blank group， inflammatory lesions of colonic mucosal epithelium in model group rats were obvious; colonic mucosal ulcer score increased significantly （P<0.01）; the contents of 5 kinds of SCFAs and the total amount of SCFAs in colon except for propionic acid were decreased significantly （P<0.01）. Compared with model group， the degree of colonic histopathological damage in H. erinaceus polysaccharide groups was significantly reduced; colonic mucosal ulcer scores were significantly reduced （P<0.05 or P<0.01）; the contents of 5 kinds of SCFAs and the total amount of SCFAs in colon except for propionic acid were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： H. erinaceus polysaccharide can effectively improve the pathological condition of ulcerative colitis model rats; its regulation of intestinal SCFAs （especially acetic acid and butyric acid） may be an important mechanism of its anti-ulcerative colitis.

KEYWORDS? ?Hericium erinaceus polysaccharides; Ulcerative colitis; Short-chain fatty acid; Mechanism; Rat

猴頭菌（Hericium erinaceus）又稱猴頭、猴頭菇，是藥食同源的名貴菌類，在胃炎、胃潰瘍、腸炎等消化系統(tǒng)疾病治療方面顯示了獨特的藥用價值[1]。猴頭菌可以作為替代療法的一味重要的藥物用于治療或預防潰瘍性結腸炎，在世界范圍內(nèi)越來越受到研究者的關注[2]。臨床試驗表明，猴頭菌多糖及其制劑在治療潰瘍性結腸炎中具有顯著效果[3];已有藥理學研究也顯示，猴頭菌多糖可能通過調(diào)節(jié)免疫、抗氧化活性、抗炎等不同機制發(fā)揮其治療潰瘍性結腸炎的作用[4]。然而，對猴頭菌多糖的確切活性成分及作用機制尚缺乏深入的研究，一定程度限制了其臨床應用。

本課題組前期制備了猴頭菌多糖，并通過動物模型及細胞模型實驗證實該多糖具有明顯的抗?jié)冃越Y腸炎活性[5]。中藥多糖屬于大分子化合物，一般情況下不能經(jīng)腸黏膜吸收入血，故其藥理作用的發(fā)揮很可能與調(diào)節(jié)腸道內(nèi)細菌種群代謝及其代謝產(chǎn)物有關[6]。腸道菌群中某些特定細菌可將多糖降解為短鏈脂肪酸（SCFAs）這一最終代謝產(chǎn)物形式，主要包括乙酸、丙酸、丁酸等[7]，這些SCFAs被吸收進入機體后可調(diào)節(jié)宿主的生理功能（如乙酸、丁酸等在維持上皮屏障功能、調(diào)節(jié)上皮細胞增殖、調(diào)節(jié)免疫應答、預防結直腸癌等方面發(fā)揮了重要作用[8]）。然而，猴頭菌多糖抗?jié)冃越Y腸炎的活性作用機制是否與其調(diào)節(jié)腸道SCFAs含量有關尚未見相關研究報道?；诖耍狙芯客ㄟ^乙酸灌腸誘導建立潰瘍性結腸炎大鼠模型，考察猴頭菌多糖的抗炎活性;同時，建立大鼠腸道內(nèi)容物中SCFAs的含量測定方法，以探討猴頭菌多糖治療潰瘍性結腸炎與其影響腸道內(nèi)SCFAs含量的相關性，為闡明猴頭菌多糖是否通過調(diào)節(jié)腸道菌群代謝物SCFAs的含量來發(fā)揮抗?jié)冃越Y腸炎的作用機制提供實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器

HT GC-TOFMS型氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（美國Pegasus HT公司）;TG18G型臺式高速冷凍離心機（美國Beckman公司）;BT 125D型電子天平（德國Sartorius儀器有限公司）;PY-45型恒溫振蕩器（中國智城儀器公司）;Milli-Q型超純水機（法國Millipore公司）;CX31型顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

猴頭菌菌絲提取物（山西康欣藥業(yè)有限公司，批號：2018001）;乙酸標準品（批號：71251，純度：>99.5%）、丙酸標準品（批號：402907，純度：>99.5%）、丁酸標準品（批號：19215，純度：>99.5%）、異丁酸標準品（批號：58360，純度：>99.5%）、戊酸標準品（批號：75054，純度：>99.5%）、異戊酸標準品（批號：78651，純度：>99.5%）、 2，4-二硝基苯肼鹽酸鹽溶液（衍生化試劑，批號：18189，濃度：0.005 mol/L）均購自美國Sigma公司;戊巴比妥鈉（成都思天德生物科技有限公司，批號：57-33-0）;蘇木素-伊紅（HE）試劑（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1120）;甲醇、氫氧化鈉為色譜純，其余試劑均為分析純;生理鹽水為本課題組自制，水為超純水。

1.3 動物

清潔級SD大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量200～220 g，購自吉林大學動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）2016-0001。大鼠均在SPF級動物室（室溫為20～25 ℃，濕度為60%～70%，晝夜交替照明）適應性飼養(yǎng)1周，期間給予普通飼料、飲水。本實驗條件和方法已通過長春中醫(yī)藥大學動物實驗中心倫理委員會審查合格。

2 方法

2.1 猴頭菌多糖提取物的制備

取猴頭菌菌絲提取物粉末適量，加5倍量水（mL/g）溶解，在50 ℃條件下持續(xù)攪拌12 h后，以3 000 r/min離心 5 min，取上清液;重復上述操作2次，合并上清液，濃縮;加入95%乙醇直至乙醇終體積分數(shù)為80%，進行沉淀;過濾，取醇沉物，冷凍干燥，粉碎，即得猴頭菌多糖提取物（每1 g提取物相當于原菌絲提取物5 g，收率約為20%）。

2.2 猴頭菌多糖對潰瘍性結腸炎模型大鼠的改善作用考察

2.2.1 分組及給藥 取SD大鼠40只，禁食不禁水24 h后，隨機分為空白組、模型組和猴頭菌多糖低、高劑量組（0.5、1.0 g/kg，以猴頭菌多糖提取物計算;劑量根據(jù)人體用藥劑量按文獻方法[9]折算后制定），每組10只。各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，然后將直徑3 mm的灌腸硅膠管經(jīng)其肛門緩慢插入約8 cm，用注射器緩慢注入生理鹽水（空白組）或10%乙酸溶液（模型組和給藥組）1.5 mL，計時10～15 s后，用生理鹽水灌腸沖洗。大鼠清醒后常規(guī)飼養(yǎng)，次日起給藥組大鼠灌胃猴頭菌多糖提取物溶液（以水為溶劑配制成0.1、0.2 g/mL的藥液，灌胃前混勻），空白組和模型組大鼠灌胃相應體積的水，連續(xù)給藥10 d。

2.2.2 猴頭菌多糖對大鼠結腸組織病理學變化的影響觀察 給藥完畢后次日，各組大鼠在禁食不禁水12 h后，稱定體質(zhì)量，按“2.2.1”項下方法麻醉，迅速剖腹，取其部分結腸組織，用4%甲醛固定24 h以上，然后以HE染色，在顯微鏡下觀察結腸黏膜上皮組織病理學變化。

2.2.3 猴頭菌多糖對大鼠潰瘍性結腸炎的療效評價 取大鼠部分結腸段，用生理鹽水清洗后，以肉眼觀察其黏膜病變情況并進行評分，以評價療效。潰瘍評分標準：結腸段未見損傷、形態(tài)完整，記0分;結腸段充血，記1分;結腸段潰瘍面積小于總腸段面積的25%，記2分;結腸段潰瘍面積占總腸段面積的25%～50%，記3分;結腸段潰瘍面積大于總腸段面積的50%，記4分[10]。

2.3 大鼠結腸內(nèi)容物中SCFAs的含量測定

采用氣相色譜（GC）-質(zhì)譜（MS）聯(lián)用法測定SCFAs含量。

2.3.1 樣品預處理 在進行大鼠解剖的過程中，各組取8只大鼠收集其結腸內(nèi)容物1～2粒，液氮凍存，備用。取腸道內(nèi)容物，冰浴中解凍（減少待測成分的降解），參照文獻方法[11]操作，取樣約50 mg，加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液300 μL勻漿后，在4 ℃下以500 r/min離心20 min;取上清液，與2，4-二硝基苯肼鹽酸鹽進行2次衍生化反應;在4 ℃下以1 000 r/min離心15 min，取上清液，加入等體積氯仿萃取，然后量取0.5 mL氯仿萃取層轉(zhuǎn)移至具蓋頂空進樣瓶中，備測。

2.3.2 色譜條件 色譜柱：Restek RxiTM-5MS色譜柱（30 m×250 μm）;程序升溫（45 ℃保持1 min;從45 ℃以20 ℃/min升至260 ℃;從260 ℃以40 ℃/min升至320 ℃;320 ℃保持2 min）;進樣口溫度：270 ℃;載氣：氦氣;進樣口溫度：270 ℃;流速：1.0 mL/min;頂空進樣。

2.3.3 質(zhì)譜條件 采用電子轟擊離子源;電子轟擊能量：70 eV;離子源溫度：220 ℃;檢測器溫度：270 ℃;檢測電壓：1 450 V;質(zhì)譜圖采集速率：20 spectra/s;質(zhì)譜掃描質(zhì)量范圍：38～550 Da。

2.3.4 方法學考察 參照前期研究方法[12-13]，取乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸標準品適量，以水配制成不同濃度梯度的系列單一標準品溶液（質(zhì)量濃度范圍見表1，臨用現(xiàn)配），按“2.3.1”項下“與2，4-二硝基苯肼鹽酸鹽進行2次衍生化反應……轉(zhuǎn)移至具蓋頂空進樣瓶中”的步驟進行預處理操作，再按“2.3.2”和“2.3.3”項下色譜和質(zhì)譜條件進樣分析。以各待測SCFAs的信號強度（x）為橫坐標、質(zhì)量濃度（ng/mL，y）為縱坐標進行線性回歸，得標準曲線方程，詳見表1。結果顯示，標準曲線方程的R2均大于0.993，表明6種SCFAs在相應質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好。同時，進行精密度、檢出限、穩(wěn)定性、加樣回收率等考察，結果表明該方法可行，可用于大鼠結腸內(nèi)容物中SCFAs的含量測定。

2.4 統(tǒng)計學方法

所有試驗至少獨立重復3次。采用GraphPad Prism 7統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理。大鼠結腸潰瘍評分以x±s表示，SCFAs含量以中位數(shù)（M）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey’s或Dunnett’s檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 猴頭菌多糖對潰瘍性結腸炎模型大鼠的改善作用

3.1.1 大鼠結腸黏膜上皮組織病理學變化 顯微鏡下可見，空白組大鼠結腸黏膜上皮組織完整，杯狀細胞清晰;模型組大鼠結腸黏膜上皮組織和隱窩呈囊性擴張，中性粒細胞和單核炎癥細胞浸潤明顯;猴頭菌多糖各劑量組大鼠結腸黏膜上皮組織中單核炎癥細胞滲透明顯減少，上皮細胞變性和壞死現(xiàn)象明顯改善，詳見圖1。

3.1.2 大鼠結腸黏膜外觀及潰瘍評分 空白組大鼠結腸黏膜完整，無明顯充血或炎癥現(xiàn)象;模型組大鼠結腸黏膜充血，黏膜上皮明顯糜爛;猴頭菌多糖各劑量組大鼠結腸黏膜僅見輕微充血，上皮皺褶基本恢復到無病變狀態(tài)。與空白組比較，模型組大鼠結腸黏膜潰瘍評分顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與模型組比較，猴頭菌多糖各劑量組大鼠結腸黏膜潰瘍評分均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

3.2 大鼠結腸內(nèi)容物中SCFAs的含量測定結果

各組大鼠結腸內(nèi)容物中檢出的SCFAs主要為乙酸、丙酸、丁酸、戊酸，其中乙酸含量最高，丙酸、丁酸次之，戊酸含量最低。以乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸的含量之和計算SCFAs總量。結果，與空白組比較，模型組大鼠腸道內(nèi)容物中除丙酸外的5種SCFAs及SCFAs總量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），其中乙酸、丁酸含量分別下降22.68%、88.74%;與模型組比較，猴頭菌多糖各劑量組大鼠腸道內(nèi)容物中除丙酸外的5種SCFAs及SCFAs總量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），且呈一定的劑量依賴趨勢，其中猴頭菌多糖高劑量組的乙酸含量與空白組最為接近。這提示猴頭菌多糖能夠逆轉(zhuǎn)乙酸誘導的潰瘍性結腸炎模型大鼠腸道內(nèi)容物中各種SCFAs及其總含量的降低。各組大鼠結腸內(nèi)容物中SCFAs的含量測定結果見表3（注：結腸內(nèi)容物中SCFAs含量測定數(shù)據(jù)的離散度較大，故采用中位數(shù)表示結果）。

4 討論

猴頭菌是我國治療消化道疾病常用的傳統(tǒng)菌類藥物，但關于其抗?jié)冃越Y腸炎的藥理活性尚缺少系統(tǒng)的動物模型研究。本研究通過乙酸灌腸誘導建立大鼠潰瘍性結腸炎模型，采用猴頭菌多糖給藥進行干預治療，結果顯示，大鼠結腸黏膜上皮組織病理損傷程度明顯減輕，腸黏膜潰瘍評分顯著下降，提示猴頭菌多糖對大鼠潰瘍性結腸炎有明顯改善作用。

多糖作為碳水化合物類大分子，學界普遍認為其不易經(jīng)腸黏膜吸收入血而發(fā)揮藥效，其藥理活性的發(fā)揮與腸道菌群關系密切[13]。腸道生態(tài)系統(tǒng)的組成是動態(tài)的，易受飲食因素以及炎癥性腸病疾病等的影響，這些因素可能通過影響宿主的營養(yǎng)和健康狀況繼而改變腸道微生物群的代謝活動[14]。近端結腸是一個主要的糖酵解環(huán)境，碳水化合物進入結腸后可被快速發(fā)酵[15]。SCFAs是碳水化合物經(jīng)腸道菌群代謝后與潰瘍性結腸炎的發(fā)生最為密切相關的主要代謝產(chǎn)物，具有促進回腸和結腸的運動、增加腸黏膜血流及氧的攝入、促進腸黏膜上皮細胞增殖、防止腸黏膜上皮細胞和腺體萎縮、促進術后組織修復等作用[16]。SCFAs主要包括乙酸、丙酸、丁酸等，是宿主細胞的重要能量來源，其中丁酸是結腸上皮細胞能量的主要來源[17];乙酸則參與了脂肪生成和糖異生過程[18];乙酸和丁酸還可以激活短鏈脂肪酸受體GPR41和GPR43，從而發(fā)揮抗炎作用[19];丁酸鹽對結腸上皮細胞具有保護作用，而丙酸鹽對肝臟細胞也有保護作用[20]。因此，腸道微生物群發(fā)酵產(chǎn)物SCFAs可能有益于人類腸道內(nèi)環(huán)境的修復及改善潰瘍性結腸炎的癥狀。研究者認為，腸道中產(chǎn)生的SCFAs可以通過降低與炎性腸病和腸癌相關的危險因素來改善宿主健康[21]。基于此，本研究考察了猴頭菌多糖干預治療后，潰瘍性結腸炎模型大鼠結腸中的SCFAs含量變化，旨在揭示猴頭菌多糖的治療靶點。

以往多采用GC法測定SCFAs含量，該方法靈敏度低且樣品制備方法較為繁瑣。而隨著GC-MS聯(lián)用技術的廣泛應用，SCFAs含量的檢測靈敏度和準確度大大提升，使得將SCFAs含量檢測結果作為潰瘍性結腸炎等炎性腸病的篩查及治療指標成為可能。本研究采用GC-MS技術檢測潰瘍性結腸炎模型大鼠腸道內(nèi)容物中SCFAs的含量，該方法靈敏度高、重復性好、分辨性強。結果顯示，潰瘍性結腸炎模型組大鼠結腸內(nèi)容物中以乙酸和丁酸為代表的SCFAs含量較正常組顯著降低;而給予猴頭菌多糖干預則能使大鼠結腸內(nèi)容物中SCFAs的含量（除丙酸外）顯著增加。筆者推測，乙酸、丁酸等SCFAs的增加是猴頭菌多糖發(fā)揮對腸黏膜的保護作用，繼而發(fā)揮預防和治療潰瘍性結腸炎的重要作用機制。

綜上所述，猴頭菌多糖能有效改善潰瘍性結腸炎模型大鼠的腸黏膜組織病變程度和潰瘍評分，能夠調(diào)節(jié)結腸內(nèi)容物中的SCFAs（尤其是乙酸、丁酸）的含量，這可能是猴頭菌多糖抗?jié)冃越Y腸炎的重要機制。但乙酸、丁酸等如何發(fā)揮生理活性及其具體的作用通路尚不清楚，后續(xù)研究可考慮采用細胞或動物模型進一步驗證SCFAs等代謝產(chǎn)物的確切作用通路和蛋白靶點。

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（收稿日期：2019-04-11 修回日期：2019-08-28）

（編輯：段思怡）