UPLC-Q-TOF-MS/MS法快速定性分析通脈養(yǎng)心丸中的化學(xué)成分*

魏 娟，姚廣哲，歐陽慧子，常艷旭，何 俊

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

通脈養(yǎng)心丸是在《傷寒論》里“炙甘草湯”基礎(chǔ)上由天津名老中醫(yī)董曉初先生改造為院內(nèi)制劑，后經(jīng)過天津中醫(yī)藥大學(xué)心血管專家阮士怡教授進(jìn)一步完善的一種中成藥[1]，由地黃、雞血藤、麥冬、甘草、制何首烏、五味子、黨參、桂枝等11味中藥組成，具有養(yǎng)心補(bǔ)血，通脈止痛的功效。臨床主要用于治療胸痹心痛、心悸怔忡和氣陰兩虛型冠心病等病癥[2-5]，并可與β受體阻滯劑聯(lián)合用藥用于治療心律失常、心絞痛[6-9]。雖已有文獻(xiàn)報道對通脈養(yǎng)心丸中某些化學(xué)成分進(jìn)行了定量研究[10-11]，但還不足以全面反映通脈養(yǎng)心丸的質(zhì)量。通脈養(yǎng)心丸成分復(fù)雜，因而有必要全面研究其化學(xué)成分，以保證其質(zhì)量的安全有效。

超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術(shù)具有“三高”（高效率、高靈敏度、高分辨率）的特點(diǎn)，同時還能得到化合物的分子量、元素組成以及離子碎片等信息，可快速確定化合物的結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對通脈養(yǎng)心丸中的化學(xué)成分進(jìn)行快速、全面地定性分析，最終鑒定出了32個化合物，為通脈養(yǎng)心丸化學(xué)成分的研究及其藥效成分的確定提供了參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1290超高效液相色譜儀串聯(lián)Agilent Q-TOF 6520 質(zhì)譜儀（Agilent，USA）；Agilent Mass Hunter分析軟件（Agilent，USA）；AX205型十萬分之一分析天平（Mettler Toledo，Switzerland）；Milli-Q超純水儀（天津信睿生物科技有限公司）；5424R 型低溫高速離心機(jī)（eppendorf，Germany）；G3KT18273型微型旋渦混合儀（賽默飛世爾科技有限公司）。ZZ-L6DT超聲波清洗機(jī)（天津知著科技有限公司）。

1.2 試藥 對照品甘草酸（批號：MUST-16070805）、甘草素（批號：MUST-16070805）、異甘草素（批號：MUST-16012503）、二苯乙烯苷（批號：110844-201411）、甘草苷（批號：111610-201106）、大黃素（110756-200110）、毛蕊花糖苷（MUST-17020715）、沒食子酸（批號：MUST-16022801）、五味子醇甲（批號：110857-201412）購于成都領(lǐng)航者生物科技有限公司；芒柄花苷（批號：20160512）購于天津士蘭科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，購于Fisher公司；無水乙醇（色譜純）購于康科德科技有限公司。超純水由Milli-Q超純水儀（購于天津信睿生物科技有限公司）制備。通脈養(yǎng)心丸購于天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18柱（2.1×100mm，1.7μm）；流動相：0.1%甲酸水（A相）-乙腈（B相）；梯度洗脫，洗脫條件如下：負(fù)離子模式下，0～2 min，5%～15%B；2～27 min，15%～55%B；27～30 min，55%～70%B；30～38 min，70%～95%B；38～40min，95%～95%B；正離子模式下，0～5min，15%～30%B；5～30 min，30%～65%B；30～38 min，65%～95%B；38～40 min，95%～95%B；流速：0.3 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5μL。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子及正離子模式監(jiān)測，干燥氣溫度（Gas Temp）：310℃；干燥氣流速（Gas Flow）：9 L/min；霧化器壓力（Nebulizer）：30 psi；裂解電壓（Fragmentor）：135 V；碰撞電壓（Collision energy）：20 V；掃描范圍 m/z：0～2 000。

2.3 對照品溶液的制備 分別稱取大黃素、二苯乙烯苷、甘草酸、甘草苷、甘草素、異甘草素、芒柄花苷、毛蕊花糖苷、沒食子酸和五味子醇甲對照品各2 mg，精密稱定，加入甲醇溶解并定容，配制成濃度為1 mg/mL的對照品原液，均于4℃冰箱保存待用。

2.4 供試品溶液的制備 將通脈養(yǎng)心丸樣品粉碎后研細(xì)，精密稱取0.2 g置10 mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度線，超聲提?。üβ?80 W，頻率40 KHz）20 min，搖勻，取 1 mL 該溶液，14 000 r/min離心10 min，取上清溶液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，即得。

3 結(jié)果與分析

通脈養(yǎng)心丸樣品按照“2.1”和“2.2”所述的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，采集得到通脈養(yǎng)心丸樣品在負(fù)離子和正離子模式下的總離子流圖，見圖1?；衔锏蔫b定方法為：利用Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis分析軟件，分別提取正、負(fù)離子模式下采集的樣品溶液的總離子流圖（TIC），根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰，確定化合物分子式，有對照品的成分再結(jié)合二級質(zhì)譜碎片與其對照品裂解規(guī)律進(jìn)行比對，無對照品的成分參照相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對，共鑒定出了32個化合物，具體鑒定結(jié)果見表1。

化合物1：正離子檢測模式下，tR為5.59 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 419.134 2，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z257.081 2，由元素組成分析，其分子式為C21H22O9；對照品tR為5.60 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 419.136 5，二級裂解離子碎片m/z257.080 4[M+H-glucose]+。對比對照品鑒定化合物1為甘草苷，來源于甘草。

圖1 UPLC-Q-TOF-MS/MS正、負(fù)離子總離子流圖

表1 通脈養(yǎng)心丸UPLC-Q-TOF-MS/MS成分鑒定結(jié)果

化合物2：正離子檢測模式下，tR為5.60 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z147.044 2，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片，m/z 121.050 9，由元素組成分析，其分子式為C9H6O2。參照文獻(xiàn)[12]，相對分子質(zhì)量為416.143，推測化合物2為香豆素，來源于桂枝。

化合物3：正離子檢測模式下，tR為5.78 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z431.131 2，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z269.078 5，由元素組成分析，其分子式為C22H22O9；對照品tR為5.79 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 431.134 9，二級裂解離子碎片m/z269.080 6[M+H-glucose]+。對比對照品鑒定化合物3為芒柄花苷，來源于雞血藤。

化合物4和8：正離子檢測模式下，tR分別為6.31 min和10.09 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 257.080 9，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z 137.022 4，由元素組成分析，其分子式為C15H12O4；對照品tR分別為6.34 min和10.09 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z257.081 9，二級裂解離子碎片m/z 137.022 6[M+H-C7H4O2]+。對比對照品鑒定化合物4和8分別為甘草素和異甘草素。

化合物5：正離子檢測模式下，tR為7.97 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 985.462 4，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z823.405 7，由元素組成分析，其分子式為C48H72O21；參照文獻(xiàn)[13]，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z985.467 8[M+H-glucose]+，推測化合物5為甘草皂苷A3，來源于甘草。

化合物6：正離子檢測模式下，tR為8.08 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 285.076 9，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z121.050 9，由元素組成分析，其分子式為C16H12O5；參照文獻(xiàn)[14]，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z285.071 1，推測化合物6為毛蕊異黃酮，來源于地黃。

化合物7：正離子檢測模式下，tR為9.42 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 271.060 7，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片 m/z 253.050 2、169.012 3、123.007 3，由元素組成分析，其分子式為C15H10O5；對照品tR=9.42 min，一級離子化產(chǎn)生 [M+H]+峰，m/z 271.058 8，二級裂解離子碎片 253.049 8、169.013 3、123.006 6。對比對照品鑒定化合物7為大黃素，來源于制何首烏。

化合物9：正離子檢測模式下，tR為10.50 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 269.081 0，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z 254.057 0、253.049 7、237.054 8、226.061 6、225.056 4、213.090 7 和 197.060 1，由元素組成分析，其分子式為C16H12O4；參照文獻(xiàn)[15]，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 269.080 6，二級裂解離子碎片m/z254.055 4[M+H-CH3]+、253.046 2[M+H-CH3]+、237.054 4[M+H-CH3OH]+、226.059 7[M+H-CH3-CO]+、225.052 0[M+H-CO2]+、213.088 7[M+H-2CO]+和 197.061 2[M+H-CO2-CO]+，推測化合物9為芒柄花黃素，來源于雞血藤。

化合物10：正離子檢測模式下，tR為12.14 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 823.412 7，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z647.378 1，471.346 4，由元素組成分析，其分子式為C42H62O16；對照品tR為12.09 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+，m/z 823.403 3，二級裂解碎片m/z647.373 6[M+H-glucuronideacid]+、471.342 5[M+H-2glucuronide acid]+。對比對照品鑒定化合物10為甘草酸，來源于甘草。

化合物11：正離子檢測模式下，tR為13.88 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 433.224 0，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z 415.211 6，384.1933，369.169 2，由元素組成分析，該化合物的分子式為C24H32O7；對照品tR為13.85 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，二級裂解碎片 m/z 415.212 8[M+H-H2O]+，384.192 8[M+H-OCH3]+，369.171 4[M+H-OCH3-CH3]+。對比對照品鑒定化合物11為五味子醇甲，來源于五味子。

化合物12：正離子檢測模式下，tR為15.54 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 369.133 8，由元素組成分析，該化合物的分子式為C21H20O6；參照文獻(xiàn)[13，16]，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 369.131 7，推測化合物12為甘草寧B，來源于甘草。

化合物13：正離子檢測模式下，tR為18.14 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z355.117 1，由元素組成分析，其分子式為C20H18O6；參照文獻(xiàn)[17]，一級離子化產(chǎn)生 [M+H]+峰，m/z 355.118 0，推測此化合13為甘草寧C，來源于甘草。

化合物14：正離子檢測模式下，tR為18.71 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z401.196 9，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z386.172 4和370.177 0，由元素組成分析，其分子式為C23H28O6；參照文獻(xiàn)[18]，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 401.1966，二級裂解碎片m/z 386.173 0[M+H-CH3]+和370.176 9[M+H-OCH3]+，推測此化合物14為五味子乙素，來源于五味子。

化合物15：正離子檢測模式下，tR為21.52 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z383.149 8，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z369.141 1[M+H-CH2]+，355.142 9[M+H-C2H4]+，由元素組成分析，其分子式為C22H22O6；參照文獻(xiàn)[17]，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z383.150 4，二級裂解碎片m/z369[M+H-CH2]+和355，推測化合物15為甘草利酮，來源于甘草。

化合物16：正離子檢測模式下，tR為27.08 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z149.062 8，由元素組成分析，該化合物的分子式為C9H8O2；參照文獻(xiàn)[19]，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 149.059 9，推測化合物16為桂皮酸，來源于桂枝。

化合物17：正離子檢測模式下，tR為27.40 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z417.228 6，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z355.145 5，由元素組成分析，其分子式為C23H28O6；參照文獻(xiàn)[18]，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 417.227 4，二級裂解碎片m/z 355.153 7，推測化合物17為五味子甲素，來源于五味子。

化合物18：正離子檢測模式下，tR為27.42 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 353.138 9，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z 337.273和297.076，由元素組成分析，其分子式為C21H20O5；參照文獻(xiàn)[17]，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 353.018 6，二級裂解碎片 m/z337[M+H-CH4]+和 297[M+H-C4H8]+，推測化合物18為甘草寧A，來源于甘草。

化合物19：正離子檢測模式下，tR為27.74 min，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 385.164 5，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z353.139 6和330.106 2，由元素組成分析，其分子式為C22H24O6；參照文獻(xiàn)[17]，一級離子化產(chǎn)生[M+H]+峰，m/z 385.164 3 二級裂解碎片m/z353.138 1[M+H-OH-CH4]+和330.105 0[M+H-C4H7]+，推測化合物19為五味子丙素，來源于五味子。

化合物20：負(fù)離子檢測模式下，tR為1.76 min，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 169.014 3，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z125.024 5，由元素組成分析，其分子式為C7H6O5；對照品tR為1.75 min，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 169.014 5，二級裂解碎片m/z125.024 4[M-H-CO2]-。對比對照品鑒定化合物20為沒食子酸，來源于制何首烏。

化合物21：負(fù)離子檢測模式下，tR為3.51 min，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 165.055 9，由元素組成分析，其分子式為C9H10O3；參照文獻(xiàn)[20]，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 165.055 2，推測化合物21為對羥基苯甲酸，來源于甘草。

化合物22：負(fù)離子檢測模式下，tR為3.65 min，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 175.061 4，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z157.040 0，由元素組成分析，其分子式為C7H12O5；參照文獻(xiàn)[21]，一級離子化產(chǎn)生 [M-H]-峰m/z175.058 5，二級裂解碎片m/z 157.049 6[M-H-H2O]-，推測化合物22為羥甲基戊二酸，來源于甘草。

化合物23：負(fù)離子檢測模式下，tR為5.65 min，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 577.161 8，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z549.166 9和119.035 6，由元素組成分析，其分子式為C27H30O14；參照文獻(xiàn)[22]，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z577.155 5，二級裂解碎片m/z549[M-H-H2O]-和119[M-H-C19H22O13]-，推測化合物23為異佛來心苷，來源于甘草。

化合物24：負(fù)離子檢測模式下，tR為6.12 min，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 549.166 6，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z 254.059 6和119.049 7，由元素組成分析，其分子式為C26H30O13，參照文獻(xiàn)[22]，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 549.163 4，二級裂解碎片m/z254.057 9和119.048 8，推測化合物24為甘草己糖，來源于甘草。

化合物25：負(fù)離子檢測模式下，tR為6.29 min，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 405.124 2，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z243.068 5，由元素組成分析，其分子式為C20H22O9；對照品tR為6.29 min，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 405.122 9，二級裂解碎片m/z243.067 2[M-H-C6H10O5]-。對比對照品鑒定化合物25為二苯乙烯苷，來源于制何首烏。

化合物26：負(fù)離子檢測模式下，tR為6.58 min，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 623.202 0，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z 461.170 1，161.024 4，由元素組成分析，其分子式為C29H36O15；對照品tR為 6.60 min，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z623.201 9，二級裂解碎片m/z 461.165 9[M-H-glucose]-和161.046 2[M-H-C20H30O12]-。對比對照品鑒定化合物26為毛蕊花糖苷，來源于地黃。

化合物27：負(fù)離子檢測模式下，tR為8.30 min，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 137.024 2，由元素組成分析，其分子式為C7H6O3；參照文獻(xiàn)[23]，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 137.024 4，推測化合物27為原兒茶醛，來源于雞血藤。

化合物28：負(fù)離子檢測模式下，tR為9.50 min，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 417.123 2，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z 255.0674，213.056 1，由元素組成分析，其分子式為C21H22O9；參照文獻(xiàn)[20]，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 417.117 5，二級裂解碎片m/z 255.066 7[M-H-glucose]-和213.056 1[M-HC2H2O]-，推測化合物28為何首烏乙素，來源于制何首烏。

化合物29：負(fù)離子檢測模式下，tR為10.13 min，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 651.233 8，由元素組成分析，其分子式為C31H40O15；參照文獻(xiàn)[24]，一級離子化產(chǎn)生 [M-H]-峰，m/z651.230 2，推測化合物29為地黃苷，來源于地黃。

化合物30：負(fù)離子檢測模式下，tR為14.77 min，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 299.059 0，由元素組成分析，其分子式為C16H12O6；參照文獻(xiàn)[20]，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 29 9.057 8，推測化合物30為8-甲基醚-檸檬香豆素，來源于制何首烏。

化合物31：負(fù)離子檢測模式下，tR為16.52 min，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 837.398 1[M-H]-，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z 351.060 0，由元素組成分析，其分子式為C42H62O17；[M-H]-離子的相對質(zhì)量理論值為837.391 4，參照文獻(xiàn)[22]，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 837.3918，二級裂解碎片m/z 351，推測化合物31為甘草皂苷G2，來源于甘草。

化合物32：負(fù)離子檢測模式下，tR為18.44 min，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 283.063 0，二級掃描裂解產(chǎn)生特征離子碎片m/z269.077 4和213.870 1，由元素組成分析，其分子式為C16H12O5；參照文獻(xiàn)[20]，一級離子化產(chǎn)生[M-H]-峰，m/z 283.0612，二級裂解碎片m/z269.043 1[M-H-CH2]-和213.063 7，推測化合物32為大黃素甲醚，來源于制何首烏。

4 討論

為全面研究通脈養(yǎng)心丸中的化學(xué)成分，實(shí)驗(yàn)分別對提取溶劑、方式及時間進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，50%乙醇超聲提取20 min為最佳提取條件。對流動相進(jìn)行考察時，對比甲醇、乙腈，結(jié)果表明樣品中的化合物在乙腈中的分離度更高。水相中加少量酸，可以改善各化合物的峰形并能增加其質(zhì)譜響應(yīng)，因此流動相最終確定為乙腈-水（0.1%甲酸）。通脈養(yǎng)心丸中化學(xué)成分種類較多，為全面鑒定其中的化合物，實(shí)驗(yàn)采用正、負(fù)離子兩種質(zhì)譜掃描模式對其進(jìn)行定性分析。調(diào)節(jié)質(zhì)譜裂解電壓為135 V時，通脈養(yǎng)心丸中的化學(xué)成分可得到穩(wěn)定的母離子峰，且產(chǎn)生相應(yīng)成分的碎片離子，有利于對其進(jìn)行定性分析。

實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，通過對ESI正、負(fù)離子模式下的質(zhì)譜信息及元素組成分析，并與部分標(biāo)準(zhǔn)品及參考文獻(xiàn)中相應(yīng)化合物的裂解碎片信息進(jìn)行比對，共鑒定出通脈養(yǎng)心丸中32種化合物，包括12種黃酮類、5種有機(jī)酸類、4種木脂素類、3種皂苷類、2種蒽醌類、2種香豆素類、1種苯丙素類和3種其他類，基本明確了通脈養(yǎng)心丸的化學(xué)組成，有助于進(jìn)一步對其藥效成分進(jìn)行深入探索，為通脈養(yǎng)心丸的質(zhì)量控制、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明提供了科學(xué)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中的UPLC-Q-TOF-MS/MS方法較普通液相法更為快速、準(zhǔn)確，且充分體現(xiàn)了其在中藥復(fù)方多成分鑒定中的優(yōu)勢，為中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了一種快速、有效的分析方法。