紅花黃色素對缺血性腦室周圍白質(zhì)軟化新生鼠腦保護(hù)作用及機(jī)制研究*

李裴裴，彭金霞

（1.濮陽市中醫(yī)院藥劑科，濮陽 457000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院燒傷整形科，十堰 442000）

腦室周圍白質(zhì)軟化（PVL）屬于早產(chǎn)兒腦損傷中較常見的一種類型，也是早產(chǎn)兒發(fā)生死亡或發(fā)育出現(xiàn)障礙的主要原因[1]。研究證實(shí)[2]，少突膠質(zhì)細(xì)胞（OL）及其前體在早產(chǎn)兒PVL發(fā)病中起著非常關(guān)鍵的作用。早產(chǎn)兒腦白質(zhì)對因缺血缺氧導(dǎo)致的損傷非常敏感，是早產(chǎn)兒發(fā)生PVL的重要原因，而氧化應(yīng)激、相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)水平變化在損傷及PVL形成中起著誘導(dǎo)的作用。迄今，PVL的治療仍無有效的方法，紅花黃色素是紅花花瓣中提取的一種天然黃色素，有研究表明[3]，其對抗血栓、降血脂、抗動脈粥樣硬化、擴(kuò)張冠狀動脈方面效果顯著；也有研究顯示，其在大鼠腦缺血性疾病的治療中有一定的保護(hù)作用。但其在新生鼠腦損傷的影響研究較少，特別是對新生鼠腦室周圍白質(zhì)軟化的作用及機(jī)制研究更少，因此，本研究以新生7日鼠為實(shí)驗(yàn)對象，探討其對PVL新生鼠的腦保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動物及分組 新生7日齡SD大鼠60只，清潔級，性別無要求，體質(zhì)量12～17 g，由上海西普爾動物有限公司提供，許可證：SCXK（滬2013-0002），新生鼠均在室溫下母鼠喂養(yǎng)，濕度為60%～70%。將新生鼠根據(jù)數(shù)字表法進(jìn)行分組：假手術(shù)組、模型組、陽性對照組、紅花組各15只。

1.2 儀器及試藥 倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司，型號：CX41-12C02）；全波長酶標(biāo)儀、垂直電泳儀由Bio-Rad公司提供；石蠟切片機(jī)、包埋機(jī)（德國Leica公司提供）。恒溫冰凍切片機(jī)由德國Lecia公司提供。O4單抗體、髓鞘堿性蛋白（MBP）單抗體、縫隙連接蛋白（Cx47）、巢蛋白（Nestin）試劑盒由北京博奧森生物公司提供；山羊抗兔IgG由上?；鹂萍脊咎峁籗ABC免疫組化試劑盒由北京中杉公司提供；谷胱甘肽過氧化酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及過氧化物酶（CAT）由南京建成生物公司提供。

1.3 PVL（缺血型）模型制備及用藥 新生大鼠稱質(zhì)量后用乙醚進(jìn)行麻醉，取仰臥位固定，頸部皮膚消毒（75%乙醇），切口沿正中線皮膚，結(jié)扎（6.0號線）雙側(cè)頸總動脈，皮膚縫合后涂抹火棉膠后，放在母鼠身邊恢復(fù)至麻醉蘇醒2 h，再放置于濕度70%左右、溫度37℃的恒溫常壓缺氧箱中，并注入混合氣體（92%N2和 8%O2，流量 1～2.5 L/min）缺氧 30 min，然后將動物放回母鼠的身邊。假手術(shù)組游離兩側(cè)頸總動脈后不結(jié)扎直接進(jìn)行縫合，不給予缺氧、用藥處理；其他組均建造新生鼠PVL模型，陽性對照組造模成功后立即給予重組促紅細(xì)胞生成素（rEPO）5 000 U/kg，紅花組造模成功后立即給予紅花黃色素3 mg/kg，模型組不給予用藥處理。48 h后處死新生鼠，完整取出腦組織由4%多聚甲醛固定待用。

1.4 病理檢測 腦組織標(biāo)本將視交叉與乳頭體的中部作為切面進(jìn)行腦冠狀切片，其厚度3～4 mm，用石蠟包埋切片后，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光鏡下進(jìn)行腦室周圍白質(zhì)病理評估。根據(jù)Chen N[4]的評分標(biāo)準(zhǔn)，對白質(zhì)損傷進(jìn)行評價：正常為0度；神經(jīng)纖維表現(xiàn)輕度異常（排列不整齊），白質(zhì)表現(xiàn)輕度疏松，為Ⅰ度；神經(jīng)纖維表現(xiàn)重度異常，形成凝固性壞死及囊腔，排列不整齊，白質(zhì)表現(xiàn)嚴(yán)重疏松，為Ⅱ度。

1.5 免疫組化法 常規(guī)制作免疫組化法分析標(biāo)本，將O4、MBP、Cx47、Nestin單抗工作液濃度均為1∶100，將磷酸鹽緩沖液（PBS）作為陰性對照。倒置顯微鏡（Olympus）下進(jìn)行觀察，Image-Pro Plus5.0軟件對圖像進(jìn)行分析。同一部位（腦室周圍）隨機(jī)抽取5個視野（200倍鏡下觀察），計算IOD值。

1.6 腦組織抗氧化、氧化物質(zhì)檢測 大鼠處死后迅速將腦組織取出，以視交叉與乳頭體的中部作為切片進(jìn)行冠狀切片，將其稱質(zhì)量后以1∶10的體積比例加入勻漿液，勻漿后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)試劑盒中的說明書進(jìn)行操作，用分光光度法對SOD、CAT、GSH-Px、MDA及GSH的含量進(jìn)行檢測。

1.7 細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白檢測 使用免疫印跡法對細(xì) 胞 凋 亡 相 關(guān) 蛋 白 Bax、Bcl-2、Caspase-9 及Caspase3活化片段進(jìn)行檢測。提取組織蛋白質(zhì)后，用二喹啉甲酸（BCA）對總蛋白量進(jìn)行測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對蛋白濃度進(jìn)行計算，經(jīng)蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濕法轉(zhuǎn)膜，分別用兔抗鼠Bax、Bcl-2、Caspase-9 及 Caspase3 多抗（1∶1 000）孵育并過夜，然后與山羊抗兔IgG（濃度為1∶5 000）反應(yīng)，用增加化學(xué)發(fā)光進(jìn)行顯色，在X線片下曝光顯影。圖像處理儀作灰度掃描分析。以β-Tublin為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析。計量資料表示用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s），多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)；等級資料用秩和檢驗(yàn)，兩兩比較用秩和檢驗(yàn)的Nemenyi法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦白質(zhì)損傷病理情況 各組大鼠造模過程中及造模48 h內(nèi)均無死亡，在用藥48 h后進(jìn)行腦病理檢測，結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠未發(fā)現(xiàn)病理改變（神經(jīng)纖維走向整齊，排列致密），模型組大鼠腦室周圍白質(zhì)及腦皮質(zhì)下病理均明顯改變，組織疏松壞死，結(jié)構(gòu)模糊，神經(jīng)纖維呈網(wǎng)狀或條索狀，走向紊亂，部分可見有囊性空洞；陽性對照組及紅花組大鼠腦損傷情況與模型組比較，神經(jīng)纖維排列紊亂情況及白質(zhì)疏松情況均有明顯好轉(zhuǎn)，可見部分白質(zhì)結(jié)構(gòu)趨于正常。見圖1。陽性對照組、紅花組腦白質(zhì)整體損傷程度明顯輕于模型組（P＜0.05）。見表1。

圖1 各組大鼠腦白質(zhì)損傷病理情況（HE×200）

表1 各組大鼠腦白質(zhì)損傷病理情況分析 例（%）

2.2 各組腦白質(zhì)損傷標(biāo)志物陽性表達(dá)情況 模型組大鼠O4（標(biāo)記OL前體細(xì)胞）、MBP（標(biāo)記成熟OL細(xì)胞）、CX47陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于假手術(shù)組，Nestin陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于假手術(shù)組（均達(dá)到P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、紅花組O4、MBP、CX47及Nestin陽性細(xì)胞數(shù)均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；紅花組各項(xiàng)指標(biāo)與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 2、圖 2。

表2 各組腦白質(zhì)損傷標(biāo)志物陽性表達(dá)情況（x±s）IOD×103

圖2 各組大鼠免疫組化圖片（×200）

2.3 各組大鼠抗氧化、氧化物質(zhì)指標(biāo)情況分析 模型組大鼠GPx、SOD、CAT及GSH水平明顯低于假手術(shù)組，MDA水平明顯高于假手術(shù)組（均達(dá)到P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、紅花組GPx、SOD、CAT及GSH水平均明顯升高，MDA水平明顯降低（均達(dá)到P＜0.05）；紅花組各項(xiàng)指標(biāo)與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠抗氧化、氧化物質(zhì)指標(biāo)情況分析（x±s）

2.4 各組相關(guān)凋亡因子表達(dá)情況 與假手術(shù)組比較，模型組Bax表達(dá)明顯升高，Bcl-2表達(dá)明顯降低，Caspase-9及 Caspase-3激活均明顯增加（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組及紅花組Bax表達(dá)明顯降低，Bcl2表達(dá)明顯升高，Cleaved Caspase-9及Cleaved Caspase-3激活均明顯降低（P＜0.05）。見圖3、圖 4。

圖3 各組相關(guān)凋亡因子表達(dá)情況

圖4 各組相關(guān)凋亡因子表達(dá)情況

3 討論

研究證實(shí)[5-6]，PVL是早產(chǎn)兒發(fā)生認(rèn)識障礙或腦癱的主要原因之一。對PVL的治療目前仍無特有效的方法。紅花為臨床上常用的活血化瘀性藥物，其中主要成分包括黃酮醇類及查爾酮類，紅花黃色素則為查爾酮類的有效部位群，是紅花中有效成分（具有水溶性）的混合物，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。研究證實(shí)，其抗氧化性與其分子中有多個酚羥基有關(guān)。多年來，其在抗動脈粥樣硬化、抗血栓、降血脂的治療中廣泛應(yīng)用。廖金明[7]的研究顯示，其能夠清除體內(nèi)自由基，阻滯脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，從而發(fā)揮活血化瘀作用。歐芹[8]對衰老模型小鼠的腦細(xì)胞凋亡因子進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紅花黃色素使腦細(xì)胞凋亡率明顯降低。但這些研究均局限于對成人的研究，其對新生兒腦缺血缺氧損傷的保護(hù)作用研究臨床上還很少，對其作用機(jī)制尚不清楚，由此，設(shè)計本研究對臨床新生兒腦缺血性疾病的治療意義重大。

OL前體是引起腦白質(zhì)損傷的重要靶細(xì)胞，常用O4標(biāo)記OL前體，用MBP標(biāo)記成熟的OL細(xì)胞；CX47則為縫隙連接蛋白的一種，特定性地表達(dá)于少突膠質(zhì)細(xì)胞，并與髓鞘基因有平行調(diào)節(jié)作用，當(dāng)CX47敲除后髓鞘化則無法正常進(jìn)行；Nestin為中間絲蛋白的一種，正常情況下，成熟腦組織中的Nestin表達(dá)較少，當(dāng)腦組織缺血缺氧時，其能夠促進(jìn)中樞神經(jīng)細(xì)胞再生及神經(jīng)細(xì)胞原位增殖；同樣，正常腦白質(zhì)區(qū)，nestin表達(dá)水平也很低，但出現(xiàn)損傷后則其表達(dá)有明顯升高，以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞再生[9]。本研究用石蠟病理切片、MBP、O4、CX47及Nestin表達(dá)對腦白質(zhì)損傷情況進(jìn)行評估，結(jié)果顯示，7日新生鼠在雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎、缺氧處理后均能導(dǎo)致腦白質(zhì)廣泛損傷，表現(xiàn)神經(jīng)纖維紊亂排列、白質(zhì)出現(xiàn)疏松，大量MBP、O4陽性O(shè)Ls丟失，CX47表達(dá)降低，Nestin表達(dá)升高，由此證實(shí)缺血缺氧導(dǎo)致大鼠腦白質(zhì)發(fā)生損傷，證實(shí)造模是成功的。但與模型組比較，陽性對照組、紅花組MBP、O4陽性細(xì)胞數(shù)均有明顯升高，CX47、Nestin陽性表達(dá)有明顯升高，由此說明，rEPO（在新生兒缺血缺氧腦病中應(yīng)用廣泛，具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，能夠改善患兒近期及遠(yuǎn)期的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀及認(rèn)知功能[9]）及紅花黃色素均能改善腦白質(zhì)損傷狀況，對腦白質(zhì)損傷有一定的保護(hù)作用。但本研究只探討了紅花黃色素對缺血缺氧新生鼠腦白質(zhì)損傷的短期保護(hù)作用，其對新生鼠缺血缺氧腦損傷是否有長期的效果及能否改善新生鼠缺血缺氧導(dǎo)致的行為缺陷，有待下一步進(jìn)行研究。

研究證實(shí)[10]，缺血缺氧導(dǎo)致的白質(zhì)損傷與體內(nèi)的氧化應(yīng)激關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示，新生鼠缺血缺氧后腦組織中的GPx、CAT、GSH水平明顯降低，而MDA水平明顯升高，提示腦缺血缺氧導(dǎo)致一系列活性氧簇（ROS）產(chǎn)生過多，從而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。而使用紅花黃色素及rEPO的紅花組及陽性對照組均能降低MDA水平，升高GPx、CAT、GSH水平，由此提示，紅花黃色素能夠減少腦缺血缺氧后發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，對缺血缺氧腦白質(zhì)有保護(hù)作用。此結(jié)果與廖金明[11]的研究一致。本研究還對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-9及Caspase3活化片段進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，紅花黃色素能夠抑制Caspase-9及Caspase3活化，并抑制Bax蛋白表達(dá)，同時提高Bcl-2表達(dá)，由此提示，紅花黃色素對缺血缺氧導(dǎo)致的腦白質(zhì)損傷的保護(hù)作用可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，紅花黃色素對新生鼠缺血性腦室周圍白質(zhì)軟化有保護(hù)作用，其作用機(jī)制不僅與調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)有關(guān)，還與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子有關(guān)。