通絡(luò)止痛方對(duì)不同程度膝骨關(guān)節(jié)炎組織形態(tài)學(xué)和固有免疫的影響*

楊黎黎，王慶甫

（1.北京市隆福醫(yī)院，北京 100010；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029）

膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）是骨傷科的常見(jiàn)疾病之一，其主要病理表現(xiàn)包括軟骨的退行性改變、滑膜的炎癥反應(yīng)、關(guān)節(jié)間隙狹窄和繼發(fā)性骨質(zhì)增生，該病發(fā)病率高，在老年人群中更高達(dá)每年240/10萬(wàn)[1]，對(duì)患者及其家屬生活質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，TLRs/MyD88信號(hào)通路與KOA病程進(jìn)展有著緊密的關(guān)系，該通路上的相關(guān)原件Toll樣受體（TLR）4、NF-κB、MyD88是 TLR 家族重要成員，在促炎癥因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等導(dǎo)致的骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變病理進(jìn)程中起重要的介導(dǎo)作用，對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡具有關(guān)鍵作用。因此，推測(cè)該通路及其相關(guān)原件是干預(yù)KOA滑膜炎癥的癥的重要作用靶點(diǎn)。通絡(luò)止痛處方是筆者導(dǎo)師憑借多年臨床治療KOA的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成的中醫(yī)外治方劑，具有活血化瘀，通絡(luò)止痛的功效，通過(guò)中藥外敷或超聲促透等給藥方式可以避免首過(guò)效應(yīng)，增加局部濃度，提高療效。本研究應(yīng)用超聲促透通絡(luò)止痛方對(duì)差異KOA病程的滑膜及軟骨的組織學(xué)評(píng)估及上述通路上重要蛋白的免疫熒光分析，探討通絡(luò)止痛方通過(guò)調(diào)控TLRs/MyD88信號(hào)通路對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 采用中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買的雄性8周齡Wistar大鼠90只，體質(zhì)量（0.20±0.01）kg。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 多聚甲醛、DAPI染色液、及石蠟、蘇木素－伊紅染色劑（HE）、無(wú)水乙醇、梯度酒精由，北京百諾威生物科技有限公司提供提供；低頻超聲波發(fā)生儀、中藥萃取液，北京諾亞同舟醫(yī)療技術(shù)有限公司。

1.3 動(dòng)物分組 大鼠單側(cè)KOA模型，分為造模2、4、8 周組，每組 30 只；2、4、8 周組每組又隨機(jī)分為3組每組10只，其中10只超聲促透通絡(luò)止痛方干預(yù)，10只通過(guò)超聲促透生理鹽水干預(yù)，另10只不做任何處理。2、4、8周組大鼠模型分別在造模后2、4、8周后給藥，1次/天，持續(xù)給藥一周后取材。超聲促透參數(shù)：超聲頻率：30 KHz，功率30 W，透入速率：40～60μg，每次耗時(shí)15 min。超聲探頭要垂直于皮膚表面，液體和皮膚需緊密接觸。

1.4 KOA大鼠模型制備與樣本收集 采用經(jīng)典Hulth法造成造模，造模后給與青霉素注射預(yù)防感染，常規(guī)顆粒飼料與飲用水飼養(yǎng)。該動(dòng)物研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批。2、4、8周組在干預(yù)后分別對(duì)各組大鼠手術(shù)取材，取材部位為膝關(guān)節(jié)股骨髁（包含軟骨及軟骨下骨）和滑膜組織，標(biāo)號(hào)后放置液氮中備用。

1.5 檢測(cè)內(nèi)容 常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色法染色后，利用Mankin’s評(píng)分對(duì)干預(yù)后KOA病變程度及各階段軟骨組織學(xué)進(jìn)行分級(jí)評(píng)估。雙標(biāo)的免疫熒光染色檢測(cè)干預(yù)后各組樣本滑膜組織中TLR4、MyD88和NF-κB的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)錄入EXCEL表格，統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,多組間差異的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）；以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 按各組取材時(shí)間要求打開(kāi)關(guān)節(jié)腔，2周組中，中藥組、鹽水組與未干預(yù)組軟骨顏色、光澤度與透亮度無(wú)明顯異常，均表現(xiàn)為軟骨外觀形狀無(wú)變化，成白色微透明狀，表面光澤，無(wú)裂紋、軟化及充血表現(xiàn)。鹽水組與未干預(yù)組較中藥組的滑膜組織顏色較暗紅，略有增生，鹽水組與未干預(yù)組滑膜情況相似；4周組中，中藥組、鹽水組與未干預(yù)組軟骨透亮度均有一定程度下降，顏色漸暗，無(wú)潰瘍及骨贅形成，鹽水組與未干預(yù)組軟骨狀態(tài)相似，較中藥組出現(xiàn)少許裂隙及軟化，鹽水組與未干預(yù)組較中藥組的滑膜組織顏色較暗紅，較多增生，鹽水組與未干預(yù)組滑膜情況相似；8周組中，中藥組、鹽水組與未干預(yù)組軟骨暗淡無(wú)光澤，透明度消失，中藥組軟骨有較少量裂紋、潰瘍、骨贅、局部軟骨軟化，股骨內(nèi)側(cè)髁完整度良好，輕度磨損，鹽水組與未干預(yù)組軟骨狀態(tài)相似，較中藥組有明顯局部軟骨軟化，裂紋，潰瘍，骨贅增多，股骨內(nèi)側(cè)髁磨損嚴(yán)重，失去完整度，中藥組滑膜組織增生，充血，鹽水組與未干預(yù)組滑膜情況相似，較中藥組滑膜組織有明顯的大量增生，關(guān)節(jié)腔模糊，滑膜大量充血、水腫。

2.2 組織學(xué)觀察

2.2.1 軟骨的HE染色及組織學(xué)評(píng)分 根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，對(duì)各組軟骨組織片，觀察干預(yù)前后軟骨的病理變化，2周組中，中藥組、鹽水組與未干預(yù)組均表現(xiàn)為正常的軟骨生理結(jié)構(gòu)，表面光滑，細(xì)胞分層及形態(tài)規(guī)則，潮線整齊。鹽水組與未干預(yù)組較中藥組細(xì)胞數(shù)目增多，鹽水組與未干預(yù)組軟骨結(jié)構(gòu)情況相似（見(jiàn)圖1）；4周組中，中藥組軟骨面略粗糙，偶見(jiàn)表層裂隙，潮線整齊，細(xì)胞數(shù)目、密度較2周組中藥組多，鹽水組與未干預(yù)組軟骨表面粗糙，多處裂隙，潮線偶有中端，細(xì)胞數(shù)量及密度較中藥組大，鹽水組與未干預(yù)組軟骨結(jié)構(gòu)情況相似（圖1D、E、F）；8周組中，中藥組較4周組中藥組裂隙加深，細(xì)胞數(shù)量及密度增大，分層尚清晰，潮線多處中斷，鹽水組與未干預(yù)組較中藥組裂隙變深、增寬，表面出現(xiàn)較大范圍被薄層瘢痕纖維組織覆蓋的缺損區(qū)，軟骨細(xì)胞分層不清，潮線完全紊亂或消失，鹽水組與未干預(yù)組軟骨結(jié)構(gòu)情況相似（圖1G、H、I）。

圖1 各組軟骨的HE染色圖

2、4、8各組中，鹽水組、未干預(yù)組與中藥組比較Mankin’s評(píng)分均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），各組中中藥組較鹽水組與未干預(yù)組分值減少（見(jiàn)表1）。

2.2.2 滑膜的HE染色 2周組中，中藥組表現(xiàn)為正常滑膜組織形態(tài)，即主要為滑膜細(xì)胞組成，滑膜襯里層細(xì)胞單層排列，無(wú)增生、肥大及間質(zhì)水腫，疊瓦狀規(guī)則排列的無(wú)基膜包繞的軟組織，鹽水組與未干預(yù)組滑膜結(jié)構(gòu)情況相似，較中藥組出現(xiàn)輕度增生，間質(zhì)水腫（圖 2A、B、C）；4周組中，中藥組較 2周組中藥組滑膜細(xì)胞增生，局部出現(xiàn)細(xì)胞聚集，鹽水組與未干預(yù)組滑膜結(jié)構(gòu)情況相似，較中藥組出現(xiàn)細(xì)胞增多、聚集，滑膜襯里層細(xì)胞層數(shù)增多，間質(zhì)水腫（圖2D、E、F）；8周組中，中藥組較4周組中藥組滑膜細(xì)胞增多，間質(zhì)水腫，偶有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，鹽水組與未干預(yù)組滑膜結(jié)構(gòu)情況相似，與中藥組相比，排列紊亂，肥大，間質(zhì)水腫，細(xì)胞增生，出現(xiàn)增生血管（圖 2G、H、I）。

表1 軟骨的Mankin’s評(píng)分（x±s） 分

圖2 各組滑膜的HE染色圖

2.3 免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)法檢測(cè)TLR4、MyD88和NF-κB表達(dá)及定位的改變 TLR4是一種細(xì)胞膜上的跨膜蛋白，具有介導(dǎo)炎性介質(zhì)釋放等特異性生物學(xué)效應(yīng)，在各組的中藥組中的表達(dá)量較鹽水組與未干預(yù)組中顯著減少，鹽水組與未干預(yù)組TLR4表達(dá)量相似；MyD88是一種在胞質(zhì)中被檢測(cè)到的蛋白，在各組的中藥組中的表達(dá)強(qiáng)度較鹽水組與未干預(yù)組中表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱，鹽水組與未干預(yù)組MyD88表達(dá)強(qiáng)度相似；NF-κB是一種隨KOA病情進(jìn)展由細(xì)胞質(zhì)至細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的蛋白，在各組的中藥組中，可以在細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到NF-κB蛋白，而在鹽水組與未干預(yù)組的細(xì)胞核中可以檢測(cè)到NF-κB蛋白，見(jiàn)圖3。

3 討論

通絡(luò)止痛方是筆者導(dǎo)師憑借多年治療KOA的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成，組成包括：桃仁、紅花、桂枝、白芍、制草烏頭、細(xì)辛、川椒、牛膝、乳香、沒(méi)藥。主要功效包括活血化瘀，通絡(luò)止痛。其中白芍、桂枝為通絡(luò)止痛湯的君藥，桂枝辛甘溫，有溫通經(jīng)脈，助陽(yáng)化氣之功效；白芍苦、酸、微寒，有養(yǎng)血斂陰，柔肝止痛之功效。兩者合用一斂一散，一補(bǔ)一開(kāi)，解肌發(fā)表，調(diào)和營(yíng)衛(wèi)，使發(fā)汗而不傷陰，氣血調(diào)而不傷氣。兩藥合用亦可治療氣血不調(diào)導(dǎo)致的四肢酸楚、麻木、疼痛等。以桃仁、紅花、乳香、沒(méi)藥為臣藥，可活血祛瘀、行氣止痛、舒筋通絡(luò)。紅花、桃仁為活血化瘀常用藥對(duì)。紅花辛溫，主入心、肝經(jīng)，散瘀止痛?！夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》云：“乳香、沒(méi)藥，二藥并用，為宣通臟腑、流通經(jīng)絡(luò)之要藥……具通氣活血之力，又善治風(fēng)寒濕痹，周身麻木，四肢不遂及一切瘡瘍腫疼，或其瘡硬不疼?！边@4味藥可加強(qiáng)行氣活血化瘀的藥力，正所謂“治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅”。制草烏頭、細(xì)辛為本方的佐藥，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)散寒、消腫止痛之效。川椒為為本方的使藥，具有活血祛瘀、祛風(fēng)利濕之效。牛膝“性善下行”，具有良好的引經(jīng)作用，且有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨之功。全方組成嚴(yán)謹(jǐn)，配伍精湛。

膝骨性關(guān)節(jié)炎是是以骨質(zhì)增生和關(guān)節(jié)軟骨退行性改變?yōu)橹饕卣鞯穆约膊?，伴骨贅形成、軟骨下骨變性及滑膜炎癥[2]。研究表明，KOA的病程涉及多種信號(hào)通路及免疫細(xì)胞等的參與，其中，Toll樣受體是以固有免疫系統(tǒng)中一類重要的模式識(shí)別受體（PRRs），廣泛參與病原相關(guān)分子模式（PAMPs）的識(shí)別及內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)相關(guān)分子模式（DAMPs）的感知，進(jìn)而啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答，防御各種病原體入侵的決定性屏障[3-4]。Toll樣受體活化后可通過(guò)一系列反應(yīng)廣泛參與感知DAMPs和識(shí)別PAMPs，誘導(dǎo)多種炎性因子和介質(zhì)的合成與釋放，誘發(fā)或加重KOA[5]。最近有研究表明，固有免疫應(yīng)答在KOA的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中起到關(guān)鍵的作用[6]

圖3 各組免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)法檢測(cè)TLR4、MyD88和NF-κB表達(dá)及定位改變圖

不同的TLR分子與其識(shí)別配體結(jié)合后形成二聚體復(fù)合物，復(fù)合物將含TI R的銜接蛋白募集至TI R區(qū)與銜接蛋白結(jié)合，胞外信號(hào)隨即進(jìn)入胞內(nèi)，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)，TL R s與銜接蛋白結(jié)合后，主要通過(guò)兩條途徑啟動(dòng)下游一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，根據(jù)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中有無(wú)My D88銜接蛋白的參與而分為My D88非依賴途徑和My D88依賴途徑。除TLR3外所有的TL R s介導(dǎo)的信號(hào)通路均可通過(guò)My D88依賴途徑發(fā)揮作用，包括TLR-2在內(nèi)；而TL R4介導(dǎo)的信號(hào)通路則同時(shí)存在于這兩條單獨(dú)的信號(hào)途徑[7]。而這兩種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，最終均需激活NF-κB，引起下游細(xì)胞因子分泌，即無(wú)論哪種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，NF-k B都處于下游信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的中樞地位。

本研究選取了該通路上3個(gè)重要的蛋白TLR4、MyD88及NF-κB，應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)法等方法，在超聲促透通絡(luò)止痛方干預(yù)后，目標(biāo)蛋白表達(dá)量及定位均有一定的改變，結(jié)合形態(tài)學(xué)及組織學(xué)的改變情況，筆者發(fā)現(xiàn)，通絡(luò)止痛方可以通過(guò)調(diào)控TLRs/MyD88信號(hào)通路上重要元件，即TLR4、MyD88及NF-κB，抑制滑膜細(xì)胞增生，及炎癥反應(yīng)，減緩軟骨退變，對(duì)不同程度膝骨性關(guān)節(jié)炎均有療效。KOA的病理發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，并非一兩個(gè)細(xì)胞因子作用的結(jié)果，但是TLRs/MyD88信號(hào)通路有可能成為KOA診斷和治療的一項(xiàng)有用的指標(biāo)，并且可能為KOA的治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。通過(guò)通絡(luò)止痛方干預(yù)TLRs/MyD88信號(hào)通路或抑制其生物活性，將為治療骨性關(guān)節(jié)炎開(kāi)辟一條新的途徑。