腦心通膠囊對Ⅱ型糖尿病小鼠傷口愈合的作用*

宋 敏 ，陳 璐 ，李春曉 ，房志銳 ，張璐莎 ，Joel Wake Coffie，張麗媛 ，馬璐璐，王 虹

（1.方劑學教育部重點實驗室，天津市中藥藥理學重點實驗室，天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，天津 301617）

糖尿病足潰瘍（DFU）是糖尿病的并發(fā)癥之一，在世界范圍內發(fā)病率很高，近年來，世界上有近30%的人口患有糖尿病，其中650萬人患有慢性皮膚潰瘍[1]。DFU的發(fā)病機制復雜，其中由糖尿病引起的緩慢的傷口愈合是糖尿病壞疽的主要原因[2]。在過去的幾十年中，在預防DFU患者的發(fā)病率和治療方面幾乎沒有取得突破，此外，目前用于DFU的治療藥物大多是生長因子，這使得治療成本增加。因此，對于DFU的預防和治療，迫切需要更有效、更特異的藥物[3]。腦心通膠囊（NaoXinTong，NXT）是含有11種中草藥，2種樹脂藥和3種動物藥的精粉混合物[4]?，F(xiàn)代藥理學的研究表明，NXT能通過抑制小鼠樹突狀細胞的成熟、巨噬細胞一氧化氮吸入（iNO）和一氧化氮（NO）的生成來減少動脈粥樣硬化[5-8]。而且腦心通能改善糖尿病小鼠的糖/脂代謝、維持組織結構完整性、降低糖尿病引起的腎功能障礙來抑制糖尿病腎病[9]。課題組前期研究研究結果顯示NXT能促進心肌缺血小鼠心功能恢復，減小心肌梗死面積，其機制與促進心肌缺血邊緣區(qū)血管新生有關[10]。但NXT是否可以促進糖尿病小鼠傷口愈合及血管新生不清楚，本研究采用db/db小鼠切除傷口夾板模型探討了NXT對Ⅱ型糖尿病小鼠傷口愈合的作用及其可能的作用機制。

1 材料

1.1 動物 8～12周SPF級雄性C57BL/6JNju（db/+）和 BKS.Cg-Dock7m+/+Lepr db/JNju（db/db）小鼠由南京大學南京生物醫(yī)學研究所提供。小鼠體內實驗方案由天津中醫(yī)藥大學倫理委員會批準。小鼠在中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學動物研究所（天津）于溫度22～25℃和相對濕度50%～60%條件下飼養(yǎng)。

1.2 藥物 腦心通超微粉末由陜西步長制藥有限公司提供，由黃芪、赤芍、丹參、當歸、川芎、桃仁、紅花、制乳香、制沒藥、雞血藤、牛膝、桂枝、桑枝、地龍、全蝎、水蛭組成。將腦心通超微粉末加入生理鹽水中配制成0.07 g/mL溶液，分裝備用。

1.3 試劑 avertin（美國 Sigma公司）；RIPA（北京索萊寶科技有限公司）；蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑和 PMSF（瑞典巴塞爾羅氏集團）；β-actin、PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT（美國 Cell Signaling Technology有限公司）；其他抗體，包括VEGF，eNOS/p-eNOS（上海Abcam有限公司）；血糖儀和血糖試紙（瑞典巴塞爾羅氏集團）；甲醇等其他常用試劑為國產(chǎn)分析純，實驗用水為去離子水。

2 方法

2.1 造模 小鼠腹腔注射Avertin（16.5 mL/kg），在麻醉下從背部表面去除毛發(fā)后，在小鼠中線上創(chuàng)建一個6 mm的全層切除皮膚傷口。用粘合劑硅膠板固定在傷口周圍，并用5-0縫合線縫合。在傷口上滴下慶大霉素后，用無菌透明敷料覆蓋傷口，每2日更換1次。

2.2 分組及給藥 將db/db和db/+小鼠按體重隨機分為 3組：db/+Saline組、db/db Saline組、db/db NXT組[腦心通0.7 g/（kg·d）]。給藥組給予相應的腦心通藥液，模型組給予等量的生理鹽水，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥17 d。

2.3 傷口愈合分析 用照相機對傷口閉合區(qū)進行追蹤，每2天追蹤1次。用Image J軟件對創(chuàng)面閉合度進行量化，以創(chuàng)面愈合面積百分比表示，計算為：[1-（day X創(chuàng)面面積/day 0天創(chuàng)面面積）]×100%。

2.4 HE染色 創(chuàng)面皮膚組織用4%聚甲醛固定，石蠟包埋，切片（5μm）。石蠟切片加熱60℃過夜，然后通過二甲苯和一系列分級乙醇溶液脫蠟。然后進行蘇木精染色，鹽酸分化，流水沖洗后酒精脫水，伊紅溶液染色。最后梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。HE染色后，體式顯微鏡拍片，用Image J計算肉芽組織面積和上皮化程度。

2.5 免疫熒光評價 小鼠在處死前30 min靜脈注射50μL的Griffonia Simpli-cifolia Lectin I（1mLHKS緩沖液稀釋）。創(chuàng)面皮膚組織用4%聚甲醛固定，石蠟包埋，切片（5μm）。石蠟切片加熱60℃過夜，然后通過二甲苯和一系列分級乙醇溶液脫蠟。切片用預熱抗原修復液孵育10 min，在PBS中洗滌3次后，用5%胎牛血清在PBS中室溫下封閉1 h。將一抗ANTI-SOYBEANAGGLUTININ（PBS緩沖液稀釋1∶100）與切片在4℃下隔夜孵育，二抗DyLight?594 ANTI-GOATIgG（H+L）（PBS 緩沖液稀釋 1∶200）在室溫黑暗環(huán)境中孵育20 min。用抗熒光衰退淬滅劑封片，在倒置熒光顯微鏡下觀察。

2.6 Western blotting 將組織放入預冷的裂解液中（10 mL裂解液：10 mL RIPA+0.1 g蛋白酶抑制劑+0.1 g磷酸酶抑制劑+50μL PMSF），研磨破碎，4℃離心，12 000 r/min共15 min，吸取上層上清液，BCA法測定蛋白濃度，定量。在10%SDS-PAGE上分離每個樣品，并將其轉移到PVDF膜上。在TBST中用5%牛血清白蛋白或脫脂牛奶（TBS中用0.1%Tween-20）封閉3 h后，在4℃下與各自的一抗孵育過夜，后用TBST徹底洗滌。然后，將膜與二抗辣根過氧化物酶（1∶10 000）在室溫下孵育1 h。用增強的化學發(fā)光檢測試劑進行印跡檢測。用Image J量化蛋白條帶的灰度強度，并與每個樣品中的β-actin進行歸一化。

2.7 統(tǒng)計分析 統(tǒng)計分析使用SPSS軟件進行。實驗的結果用x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 腦心通膠囊對Ⅱ型糖尿病小鼠傷口愈合的影響 術后給藥16 d后，與正常小鼠的傷口愈合相比，糖尿病模型組小鼠在組織損傷后的傷口愈合速率明顯降低（P＜0.05或 P＜0.01），在糖尿病小鼠中，腦心通組與模型組相比較，損傷后10～14 d傷口愈合率腦心通組明顯高于模型組（P＜0.05），說明腦心通能明顯促進糖尿病小鼠的傷口愈合速率，見圖1。

3.2 腦心通膠囊對Ⅱ型糖尿病小鼠傷口邊緣肉芽組織的形成和上皮化的影響 術后7，16 d，HE免疫組化染色，觀察傷口邊緣組織形態(tài)。如圖2所示：在術后7 d，3組小鼠都處于傷口愈合期，傷口邊緣組織中能觀察到明顯的肉芽組織和上皮化，與db/+Saline小鼠相比，db/db Saline小鼠傷口組織邊緣肉芽組織面積和上皮化程度明顯降低，而與db/db Saline相比，db/db NXT組小鼠傷口邊緣上皮化明顯增加，肉芽組織的面積無明顯變化。術后16 d，db/+Saline小鼠傷口完全愈合，傷口組織邊緣肉芽組織和上皮化退化，角質層形成，與db/+Saline小鼠相比，db/db Saline小鼠傷口組織邊緣肉芽組織和上皮化明顯，而在db/db小鼠中，傷口仍處于愈合階段，傷口組織邊緣能觀察到明顯的肉芽組織和上皮化，但與db/db Saline相比，db/db NXT組小鼠傷口邊緣肉芽組織的面積增加和上皮化降低。

3.3 腦心通對糖尿病小鼠的體質量、空腹血糖的影響 如圖3所示，與db/+相比較，db/db小鼠的體質量和血糖均高于db/+小鼠，而腦心通給藥組與db/db模型組相比，體質量和血糖均沒有明顯變化。

3.4 腦心通對傷口邊緣血管密度和VEGF的表達的影響 如圖4～6所示，與正常的小鼠相比，db/db Saline組傷口周圍的血管密度和毛細血管密度明顯降低（P＜0.01），而 db/db NXT組與 db/db Saline組相比，傷口周圍的血管密度和毛細血管密度也明顯增加（P＜0.05），Western blotting的結果顯示，與正常組小鼠相比，在組織損傷7 d時，db/db Saline組VEGF表達量明顯降低，而db/db NXT組與db/db Saline組相比，VEGF的表達量明顯增加。

3.5 腦心通對PI3K/AKT/eNOS信號通路的影響在圖7中，與正常小鼠相比，db/db Saline組的PI3K磷酸化明顯降低（P＜0.05），而db/db NXT組與db/db Saline相比PI3K、AKT和eNOS磷酸化明顯增加（#P＜0.05 and##P＜0.01），說明腦心通能促進 PI3K、AKT和eNOS的磷酸化，從而激活PI3K/AKT/eNOS信號通路。

圖1 腦心通對Ⅱ型糖尿病小鼠傷口愈合的影響

圖2 腦心通對Ⅱ型糖尿病小鼠傷口處肉芽組織形成和上皮化的影響

圖3 腦心通Ⅱ型糖尿病小鼠體質量、空腹血糖的影響

4 討論

圖4 腦心通對Ⅱ型糖尿病小鼠傷口邊緣血管密度的影響（n＝6）

圖5 腦心通對Ⅱ型糖尿病小鼠傷口邊緣毛細血管的影響

圖6 腦心通對Ⅱ型糖尿病小鼠傷口周圍組織VEGF表達的影響

圖7 腦心通對PI3K/AKT/eNOS信號通路的影響

糖尿病傷口愈合遲緩或者不愈合是導致DFU的主要原因[2]。目前，臨床上用于治療糖尿病傷口愈合的方法主要有加強傷口護理，降低局部壓力，改善微循環(huán)和控制炎癥反應等，但在臨床應用中只能達到很低的愈合率。近年來干細胞技術、生長因子治療、氧療等雖然應用于實驗室和臨床，但仍存在治療效果短暫和成本較高等弊端[11]。因此，對于DFU的治療，需要更有效、更特異的藥物。NXT是在經(jīng)方補陽還五湯的基礎上加入乳香、沒藥、丹參、雞血藤增加其活血化瘀作用，臨床上主要用來治療缺血性心腦血管疾病。在本研究中，我們使用Ⅱ型糖尿病小鼠，建立切除性創(chuàng)面夾板模型，該模型將夾板緊密地貼附在創(chuàng)面周圍的皮膚上，通過減少由于皮膚收縮和創(chuàng)面敷料引起的變化，實現(xiàn)創(chuàng)面均勻閉合，使傷口愈合的過程更接近于Ⅱ型糖尿病人傷口愈合的過程[12]。筆者研究結果顯示NXT可以促進Ⅱ型糖尿病小鼠傷口愈合，提示NXT可以用于治療糖尿病并發(fā)癥。

組織損傷時釋放出多種損傷相關分子，引發(fā)急性促炎反應，導致各種促炎介質（如細胞因子和趨化因子）的釋放，這些介質誘導炎癥細胞募集，分泌細胞因子、生長因子等促進細胞外基質的降解，以及各種細胞，主要是成纖維纖維細胞的增殖和遷移，形成肉芽組織，最后肉芽組織變薄，細胞外基質的聚集和沉積形成瘢痕[13-16]。在肉芽組織的形成過程中，細胞的增殖和遷移所需的氧氣和營養(yǎng)物質需要血管的運輸，因此血管新生在肉芽組織的形成過程中發(fā)揮了很大的作用。但是在糖尿病患者中，高糖環(huán)境和持續(xù)的炎癥反應使內皮細胞的數(shù)量減少，其增殖、遷移、黏附、血管新生的能力減弱，微血管損傷，血管新生受損，傷口愈合推遲[17]。筆者以前的研究表明，NXT能減小急性心肌梗死小鼠心肌梗死面積，促進心功能恢復，其機制與促進缺血組織血管新生有[18]。本研究采用Ⅱ型糖尿病小鼠傷口愈合模型進一證實NXT可以促進損傷組織血管新生及肉芽組織形成，加速傷口愈合。

傷口愈合中的血管新生依賴于促血管生長因子的作用，血管內皮生長因子（VEGF）是已知最強的促進血管新生因子，VEGF與其受體結合后可促進內皮細胞增殖遷移，從而促進血管新生，但是在糖尿病環(huán)境下，VEGF的表達下調，內皮細胞增殖和粘附的能力減弱，血管新生受到抑制[19-20]。PI3K/AKT/eNOS信號通路是激活酪氨酸激酶信號通路，當VEGF與內皮細胞表面受體的結合能激活細胞內酪氨酸激酶，觸發(fā)多種促進血管生成的下游信號，大量的證據(jù)表明PI3K/AKT/eNOS相關的信號通路參與內皮細胞的存活與增殖，從而促進血管新，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的磷酸化能刺激誘導下游蛋白絲氨酸蘇氨酸激酶（AKT）的磷酸化，磷酸化的AKT導致其下游一氧化氮合酶 （eNOS）底物的激活，從而促進NO的產(chǎn)生，NO是維持內皮細胞生物學功能的基本分子[10，21]。筆者結果表明腦心通能促進PI3K、AKT和eNOS磷酸化，從而激活PI3K/AKT/eNOS信號通路，增加VEGF的表達，促進血管新生和傷口愈合。筆者以前的研究顯示腦心通能激活VEGF/eNOS信號通路增加缺血區(qū)毛細血管密度促進心肌缺血小鼠心功能恢復[21]。本研究結果顯示在傷口愈合的過程中腦心通能激活PI3K/AKT/eNOS信號通路，增加VEGF的表達，促進血管新生從而促進肉芽組織的形成，加速Ⅱ型糖尿病小鼠傷口愈合。

綜上所述，腦心通膠囊能促進Ⅱ型糖尿病小鼠傷口愈合，其作用機制與激活PI3K/AKT/eNOS信號通路、上調VEGF的表達從而促進組織血管新生有關。本研究為NXT應用于糖尿病并發(fā)癥的治療提供了實驗依據(jù)。然而NXT成分復雜，其促進Ⅱ型糖尿病傷口愈合多靶點作用機制還有待進一步探討。