TGF-β1、survivin和caspase-3在肝內(nèi)膽管結(jié)石相關性肝內(nèi)膽管癌中的表達及臨床意義

謝偉選，柏楊，李福利，劉偉偉，朱振成，祝夢嬌，朱慶洲，周志華，趙海濱，羅昆侖,

（1.安徽醫(yī)科大學無錫臨床醫(yī)學院，江蘇 無錫 214044；中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇四醫(yī)院 2.肝膽外科 3.病理科，江蘇 無錫 214044）

肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是一種起源于膽管上皮細胞的原發(fā)性腫瘤，在原發(fā)性肝臟腫瘤中發(fā)病率排名第二[1-2]。近年來，我國ICC發(fā)病率逐步升高，其發(fā)病原因可能與膽管結(jié)石、肝炎病毒、膽管囊腫及肝硬化等因素有關。肝內(nèi)膽管結(jié)石能夠誘發(fā)ICC，其具體機制目前尚不清楚，多數(shù)學者認為結(jié)石的機械性刺激以及膽汁淤積引起的膽管慢性炎癥能誘導ICC的發(fā)生[3-4]。由于ICC起病隱匿，易發(fā)生神經(jīng)浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，該疾病對放化療敏感性低，也缺乏有效的早期診斷標志物，目前，根治性手術切除是治療ICC最重要的方法，但術后易復發(fā)轉(zhuǎn)移、預后差[5-7]。因此，探討ICC術后復發(fā)及轉(zhuǎn)移的相關機制，探索新的監(jiān)測標志物，這對于提高ICC的早期診斷、臨床治療及降低腫瘤病死率有著重大意義。

TGF-β1是一種參與胚胎發(fā)育、器官形成、免疫反應等生理過程的重要細胞因子，也參與創(chuàng)傷后組織修復及組織纖維化過程的調(diào)控。survivin基因是一種具有抑制細胞凋亡并可以通過有絲分裂促進轉(zhuǎn)化細胞異常增殖的凋亡抑制因子[8-9]。caspase-3是caspase家族中控制細胞凋亡的關鍵酶，通過線粒體途徑和Fas/TNFR1介導的受體途徑來控制機體細胞凋亡信號通路[10]。目前，關于TGF-β1、survivin與caspase-3在ICC組織中的研究文獻報道較少。本實驗應用免疫組化方法檢測肝內(nèi)膽管結(jié)石相關ICC組織中TGF-β1、survivin與caspase-3的表達及相關性，并探討其與ICC臨床病理特征及預后的關系，旨在為臨床上治療肝內(nèi)膽管結(jié)石相關ICC的治療尋找新的思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集我院病理科2013—2019年肝內(nèi)膽管組織蠟塊標本共112例，其中為肝內(nèi)膽管結(jié)石并ICC的膽管組織標本（腫瘤組），包括男23例，女 29例；平均年齡和中位年齡分別為61.77歲和62歲，年齡范圍為39～89歲。30例為肝內(nèi)膽管結(jié)石切除的肝內(nèi)膽管組織且鏡下僅發(fā)現(xiàn)慢性炎癥的膽管組織標本（炎癥組），包括男17例，女13例；平均年齡和中位年齡分別為55.77歲和56.5歲，年齡范圍為30～84歲。取同期因肝臟損傷手術切除的30例患者正常肝膽管組織標本作為對照（正常組），包括男14例，女16例；平均年齡和中位年齡分別為52.43歲和54歲，年齡范圍為26～82歲。3組患者性別、年齡比較無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。所有標本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，分別作HE及免疫組化染色。HE切片由2名專業(yè)水平較高的病理科主治醫(yī)師復診證實。

1.2 試劑和儀器

免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；濃縮型兔抗人TGF-β1抗體、濃縮型兔抗人caspase-3抗體購自ABclonal公司；濃縮型兔抗人survivin單克隆抗體購自Abcam公司；光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法（SP法） 石蠟標本切片，每份標本取4份切片，切片厚度為4 μm，常規(guī)烤片、脫蠟、梯度酒精脫水。3%H2O2孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；蒸餾水沖洗，PBS沖洗5 min×3次；切片至于EDTA緩沖液中行高壓抗原熱修復預處理，分別加入一抗工作液，其中TGF-β1一抗按1:100稀釋，survivin一抗按1:50稀釋，caspase-3一抗按1:100稀釋，4 ℃恒溫下過夜，同時設立陰性對照組（以PBS代替），滴加生物素標記的二抗工作液后常溫避光孵育 30 min，經(jīng)PBS沖洗5 min×3次；滴加DAB顯色劑，顯微鏡下觀察顯色情況，蒸餾水沖洗終止顯色；蘇木素復染5 min，蒸餾水沖洗后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，以中性樹膠封片，于光學顯微鏡下判定染色結(jié)果。

1.3.2 結(jié)果判定標準[11-12]TGF-β1陽性判斷標準：細胞質(zhì)和/或核呈淡黃色細顆粒者明顯高于背景色；survivin陽性判斷標準：細胞質(zhì)和/或核呈淡黃色細顆粒者明顯高于背景色。caspase-3陽性判斷標準：細胞質(zhì)和/或核呈淡黃色細顆粒者明顯高于背景色。由專業(yè)水平較高的病理科主治醫(yī)師進行切片觀察，并對免疫組化結(jié)果進行評價，醫(yī)師僅作為觀察者，不告知切片病理情況。采用半定量積分法判定結(jié)果：染色強度評分為4級，0分，無著色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。陽性細胞所占百分比：顯微鏡下隨機選取 10個高倍鏡視野，每個視野計數(shù)100個細胞，取10個視野的百分比平均數(shù)。0分，陽性細胞＜10%；1分，陽性細胞：10%～25%；2分，陽性細胞：26%～50%；3分，陽性細胞：51%～75%；4分，陽性細胞：＞75%；染色強度評分與陽性細胞所占百分比評分相乘，＜2分為陰性（-），≥2分為陽性（+）。

1.4 隨訪

術后通過門診隨訪、電話回訪（回訪日期截止2019年2月）了解患者生存、術后并發(fā)癥等情況。截止目前，隨訪時間最短為1個月，最長為66個月。其中失訪患者有6例，失訪患者未納入研究。

1.5 統(tǒng)計學處理

選取SPSS 19.0來分析數(shù)據(jù)，各組陽性表達情況比較選取χ2檢驗，兩兩比較選取χ2分割法，各組樣本間計量資料比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化檢測結(jié)果分析

各種蛋白在3種組織中均有不同程度的表達（圖1）。半定量分析顯示，各組間TGF-β1表達率有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；腫瘤組與炎癥組比較（χ2=8.747）、腫瘤組與正常組比較（χ2=24.273）、炎癥組與正常對照組比較（χ2=4.022），兩兩比較均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05）；TGF-β1的表達強弱關系為：腫瘤組＞炎癥組＞正常組。各組間survivin表達率有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；腫瘤組與炎癥組比較（χ2=5.306）、腫瘤組與正常對照組比較（χ2=21.026）、炎癥組與正常組比較（χ2=5.079），兩兩比較均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05）；survivin的表達強弱關系為：腫瘤組＞炎癥組＞正常組。各組間caspase-3表達率有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；腫瘤組與炎癥組比較（χ2=4.518）、腫瘤組與正常對照組比較（χ2=17.994）、炎癥組與正常組比較（χ2=4.812），兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；caspase-3的表達強弱關系為：腫瘤組＜炎癥組＜正常組（表1）。

圖1 免疫組化檢測TGF-β1、survivin與caspase-3的表達（×200）Figure1 Immunohistological staining for the expressions of TGF-β1,survivin and caspase-3 (×200)

表1 各組TGF-β1、survivin與caspase-3表達的比較[n（%）]Table1 Comparison of the expressions of TGF-β1,survivin and caspase-3 among groups [n (%)]

2.2 ICC組織中TGF-β1、survivin和caspase-3蛋白陽性表達率的相關性

ICC組織中TGF-β1表達與caspase-3蛋白表達呈明顯負相關（r=-0.890，P＜0.01），TGF-β1表達與survivin表達呈明顯正相關（r=0.917，P＜0.01），survivin表達與caspase-3表達呈明顯負相關（r=-0.894，P＜0.01）（圖2）。

圖2 TGF-β1、survivin與caspase-3表達相關性分析Figure2 Analysis of the correlations among the expression of TGF-β1,surviving and caspase-3

2.3 TGF-β1、survivin與caspase-3蛋白表達與ICC臨床病理特征的關系

TGF-β1、survivin與caspase-3陽性表達均與患者的年齡、性別、HbsAg表達情況、CA19-9水平、膽道結(jié)石等因素無關（均P＞0.05）；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化程度、AFP水平、腫瘤最大直徑有關（均P＜0.05）。其中，TGF-β1與caspase-3陽性表達與患者的腫瘤是否侵犯血管有關（均P＜0.05）（表2）。

表2 TGF-β1、survivin與caspase-3表達與52例ICC患者臨床病理特征的關系[n（%）]Table2 Relations of the expressions of of TGF-β1,surviving and caspase-3 with clinicopathologic features of the 52 ICC patients [n (%)]

2.4 ICC患者預后與各種臨床病理參數(shù)關系的單因素分析

單因素分析顯示，ICC患者術后預后與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化情況、血管侵犯、腫瘤最大直徑、R0切除、CA19-9、AFP、TGF-β1、survivin及caspase-3表達等因素有關（均P＜0.05）；與年齡、性別、肝硬化、膽道結(jié)石、HbsAg表達等因素無關（均P＞0.05）（表3）。

表3 ICC患者預后與各種臨床病理參數(shù)關系的單因素分析Table3 Univariate analysis of the relations of the clinicopathologic parameters with the prognosis of the ICC patients

2.5 ICC患者預后與各種臨床病理參數(shù)關系的多因素分析

Cox比例風險模型分析表明是否R0切除、腫瘤分化情況、TGF-β1、survivin及caspase-3表達等因素是ICC患者術后生存期的獨立影響因素（均P＜0.05）（表4）。

表4 ICC患者預后與各種臨床病理參數(shù)關系的多因素分析Table4 Multivariate analysis of the relations of the clinicopathologic parameters with the prognosis of the ICC patients

2.6 TGF-β1、survivin及caspase-3表 達 與ICC患者術后預后的關系

對52例ICC患者采用電話方式進行隨訪，隨訪時間自患者接受手術之日起至2019年3月，患者死亡或失訪日期（失訪8例）。分析結(jié)果顯示，TGF-β1陽性表達患者的生存率明顯低于TGF-β1陰性表達患者（χ2=13.192，P=0.001）；survivin陽性表達患者的生存率明顯低于survivin陰性表達患者（χ2=10.536，P=0.002）；caspase-3陽性表達患者的生存率明顯高于caspase-3陰性表達患者（χ2=5.469，P=0.023）（圖3）。

圖3 不同TGF-β1、survivin與caspase-3表達狀態(tài)ICC患者生存曲線Figure3 The survival curves of ICC patients with different expression statuses of TGF-β1,surviving and caspase-3

3 討 論

ICC的發(fā)生和發(fā)展是由多種因素共同參與、多步驟、多階段的一個復雜過程。ICC由于解剖位置特殊，起病不易發(fā)現(xiàn)，惡性程度高，預后差，與肝細胞肝癌相比更易發(fā)生早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與術后復發(fā)[13]。近年來，ICC的發(fā)病率逐年升高，由于該腫瘤異質(zhì)性強，早期診斷困難，外科手術是當前可能治愈ICC的唯一的方法，但由于缺少有效的早期診斷方法，只有大約10%～15%的膽管癌患者適合手術治療[14]。然而術后總體預后較差，針對ICC早期診斷和早期治療的研究一直是臨床上的重要難題[15-17]。

TGF-β1在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著雙重作用，在腫瘤起始階段，可抑制腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，但是在腫瘤進展期，則通過多種信號通路調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），促進新生血管形成和腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。有文獻[18]報道，TGF-β1異常表達可影響ICC的惡性生物學行為，是判斷預后的重要指標，同時還可以促進EMT的發(fā)生，影響膽管癌的發(fā)生發(fā)展[19]。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1在正常組、炎癥組和腫瘤組中均有表達，各組平均陽性表達率分別是16.67%、40.0%、73.08%，TGF-β1陽性表達率在3組肝內(nèi)膽管組織中存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05），且本文通過多因素分析發(fā)現(xiàn)TGF-β1表達水平是ICC患者術后生存期的不良獨立預后因素，TGF-β1陽性表達與陰性表達患者生存曲線差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=13.192，P=0.001），以上結(jié)果表明TGF-β1可作為ICC患者術后預后情況的獨立指標之一。

survivin是目前已知最強的凋亡抑制因子，其表達跟腫瘤的分期及生物學功能有著重要聯(lián)系[20]。國內(nèi)學者秦興雷等[21]通過檢測膽管癌組織和癌旁組織中survivin蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)肝外膽管癌組織中survivin蛋白陽性表達率要遠遠高于癌旁組織，兩者陽性表達率分別為67.8%、20.0%。本研究結(jié)果顯示，ICC組織中的survivin蛋白陽性表達率遠高于炎癥組和正常組患者，分別為69.23%、43.33%、16.67%，這與以上報道結(jié)果相一致。另外，許鵬等[22]研究發(fā)現(xiàn)，survivin蛋白的表達水平還與腫瘤的TNM分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤呈正相關，與腫瘤的分化程度呈負相關。Grabowski等[23]和Rohayem等[24]報道顯示，survivin蛋白的表達與腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)行為呈正相關，可作為監(jiān)測膽管癌患者術后預后情況的獨立指標。這與本研究結(jié)果相一致，survivin陽性表達與陰性表達患者生存曲線差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=10.536，P=0.002），且通過多因素分析發(fā)現(xiàn)，survivin蛋白表達水平是ICC患者術后生存期的不良獨立預后因素。然而survivin是如何抑制腫瘤細胞凋亡的具體作用機制至今仍存在巨大爭議，有研究[24-25]表明，survivin可能通過直接抑制凋亡終末效應器caspase-3和caspase-7的活性阻斷各種刺激誘導的細胞凋亡過程[26]；caspase-3是細胞凋亡通路中重要的執(zhí)行分子之一，也是凋亡級聯(lián)反應的最終效應蛋白，被認為是各種凋亡刺激因子激活的關鍵酶。在正常狀況下，細胞胞質(zhì)中的caspase-3無活性，但當細胞接受凋亡刺激時，它才會被激活，進而誘導細胞發(fā)生凋亡[27]。Friman[28]研究發(fā)現(xiàn)caspase-3與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，是腫瘤惡性轉(zhuǎn)移的重要原因。本實驗結(jié)果顯示，caspase-3蛋白在正常組膽管組織胞質(zhì)中表達，而在炎癥組和腫瘤組膽管組織陽性表達率則明顯降低，在正常組、炎癥組、腫瘤組中平均陽性表達率分別為90.0%、66.67%、42.31%，三者之間比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），本研究結(jié)果還顯示，caspase-3陽性表達與陰性表達患者生存曲線差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=5.469，P=0.023），survivin表達與caspase-3表達呈顯著負相關（r= -0.894，P＜0.01）。這與李楊鈞等[29]研究結(jié)果相一致，他們認為 survivin在膽管細胞癌中的陽性表達率較高，但caspase-3較低，兩者呈負相關，考慮可能是survivin抑制了caspase-3介導的細胞凋亡。以上研究結(jié)果表明survivin和caspase3的表達與ICC的發(fā)生存在密切關系，提示兩者在ICC中的惡性轉(zhuǎn)化及發(fā)生、發(fā)展機制中起關鍵作用。這與盧昕等[30]研究結(jié)果相一致，他們認為caspase-3和caspase-9在膽管癌組織中的表達水平和活性較低，這有利于膽管癌細胞逃逸，維持較高的增殖活性，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，其中，survivin可以通過促進procaspase-9的活化來阻止caspase-3的激活，從而抑制腫瘤細胞凋亡。

綜上所述，在肝內(nèi)膽管結(jié)石相關性ICC中TGF-β1、survivin陽性表達率升高，兩者呈正相關，caspase-3陽性表達率降低，與前兩者呈負相關。TGF-β1、survivin與caspase-3基因在ICC中的臨床應用價值得期待，有望成為ICC分子標記物和治療靶點。監(jiān)測ICC組織中TGF-β1、survivin與caspase-3的水平，有助于判斷患者的預后。但是，關于三者在ICC發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機制，仍需進一步研究。