• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    TGF-β1、survivin和caspase-3在肝內(nèi)膽管結(jié)石相關性肝內(nèi)膽管癌中的表達及臨床意義

    2019-09-07 02:34:26謝偉選柏楊李福利劉偉偉朱振成祝夢嬌朱慶洲周志華趙海濱羅昆侖
    中國普通外科雜志 2019年8期
    關鍵詞:膽管癌膽管免疫組化

    謝偉選,柏楊,李福利,劉偉偉,朱振成,祝夢嬌,朱慶洲,周志華,趙海濱,羅昆侖,

    (1.安徽醫(yī)科大學無錫臨床醫(yī)學院,江蘇 無錫 214044;中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇四醫(yī)院 2.肝膽外科 3.病理科,江蘇 無錫 214044)

    肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是一種起源于膽管上皮細胞的原發(fā)性腫瘤,在原發(fā)性肝臟腫瘤中發(fā)病率排名第二[1-2]。近年來,我國ICC發(fā)病率逐步升高,其發(fā)病原因可能與膽管結(jié)石、肝炎病毒、膽管囊腫及肝硬化等因素有關。肝內(nèi)膽管結(jié)石能夠誘發(fā)ICC,其具體機制目前尚不清楚,多數(shù)學者認為結(jié)石的機械性刺激以及膽汁淤積引起的膽管慢性炎癥能誘導ICC的發(fā)生[3-4]。由于ICC起病隱匿,易發(fā)生神經(jīng)浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,該疾病對放化療敏感性低,也缺乏有效的早期診斷標志物,目前,根治性手術切除是治療ICC最重要的方法,但術后易復發(fā)轉(zhuǎn)移、預后差[5-7]。因此,探討ICC術后復發(fā)及轉(zhuǎn)移的相關機制,探索新的監(jiān)測標志物,這對于提高ICC的早期診斷、臨床治療及降低腫瘤病死率有著重大意義。

    TGF-β1是一種參與胚胎發(fā)育、器官形成、免疫反應等生理過程的重要細胞因子,也參與創(chuàng)傷后組織修復及組織纖維化過程的調(diào)控。survivin基因是一種具有抑制細胞凋亡并可以通過有絲分裂促進轉(zhuǎn)化細胞異常增殖的凋亡抑制因子[8-9]。caspase-3是caspase家族中控制細胞凋亡的關鍵酶,通過線粒體途徑和Fas/TNFR1介導的受體途徑來控制機體細胞凋亡信號通路[10]。目前,關于TGF-β1、survivin與caspase-3在ICC組織中的研究文獻報道較少。本實驗應用免疫組化方法檢測肝內(nèi)膽管結(jié)石相關ICC組織中TGF-β1、survivin與caspase-3的表達及相關性,并探討其與ICC臨床病理特征及預后的關系,旨在為臨床上治療肝內(nèi)膽管結(jié)石相關ICC的治療尋找新的思路。

    1 材料與方法

    1.1 一般資料

    收集我院病理科2013—2019年肝內(nèi)膽管組織蠟塊標本共112例,其中為肝內(nèi)膽管結(jié)石并ICC的膽管組織標本(腫瘤組),包括男23例,女 29例;平均年齡和中位年齡分別為61.77歲和62歲,年齡范圍為39~89歲。30例為肝內(nèi)膽管結(jié)石切除的肝內(nèi)膽管組織且鏡下僅發(fā)現(xiàn)慢性炎癥的膽管組織標本(炎癥組),包括男17例,女13例;平均年齡和中位年齡分別為55.77歲和56.5歲,年齡范圍為30~84歲。取同期因肝臟損傷手術切除的30例患者正常肝膽管組織標本作為對照(正常組),包括男14例,女16例;平均年齡和中位年齡分別為52.43歲和54歲,年齡范圍為26~82歲。3組患者性別、年齡比較無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)。所有標本均經(jīng)10%甲醛固定,石蠟包埋,4 μm連續(xù)切片,分別作HE及免疫組化染色。HE切片由2名專業(yè)水平較高的病理科主治醫(yī)師復診證實。

    1.2 試劑和儀器

    免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司;濃縮型兔抗人TGF-β1抗體、濃縮型兔抗人caspase-3抗體購自ABclonal公司;濃縮型兔抗人survivin單克隆抗體購自Abcam公司;光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

    1.3 方法

    1.3.1 免疫組化法(SP法) 石蠟標本切片,每份標本取4份切片,切片厚度為4 μm,常規(guī)烤片、脫蠟、梯度酒精脫水。3%H2O2孵育10 min,消除內(nèi)源性過氧化物酶活性;蒸餾水沖洗,PBS沖洗5 min×3次;切片至于EDTA緩沖液中行高壓抗原熱修復預處理,分別加入一抗工作液,其中TGF-β1一抗按1:100稀釋,survivin一抗按1:50稀釋,caspase-3一抗按1:100稀釋,4 ℃恒溫下過夜,同時設立陰性對照組(以PBS代替),滴加生物素標記的二抗工作液后常溫避光孵育 30 min,經(jīng)PBS沖洗5 min×3次;滴加DAB顯色劑,顯微鏡下觀察顯色情況,蒸餾水沖洗終止顯色;蘇木素復染5 min,蒸餾水沖洗后,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,以中性樹膠封片,于光學顯微鏡下判定染色結(jié)果。

    1.3.2 結(jié)果判定標準[11-12]TGF-β1陽性判斷標準:細胞質(zhì)和/或核呈淡黃色細顆粒者明顯高于背景色;survivin陽性判斷標準:細胞質(zhì)和/或核呈淡黃色細顆粒者明顯高于背景色。caspase-3陽性判斷標準:細胞質(zhì)和/或核呈淡黃色細顆粒者明顯高于背景色。由專業(yè)水平較高的病理科主治醫(yī)師進行切片觀察,并對免疫組化結(jié)果進行評價,醫(yī)師僅作為觀察者,不告知切片病理情況。采用半定量積分法判定結(jié)果:染色強度評分為4級,0分,無著色;1分,淡黃色;2分,棕黃色;3分,棕褐色。陽性細胞所占百分比:顯微鏡下隨機選取 10個高倍鏡視野,每個視野計數(shù)100個細胞,取10個視野的百分比平均數(shù)。0分,陽性細胞<10%;1分,陽性細胞:10%~25%;2分,陽性細胞:26%~50%;3分,陽性細胞:51%~75%;4分,陽性細胞:>75%;染色強度評分與陽性細胞所占百分比評分相乘,<2分為陰性(-),≥2分為陽性(+)。

    1.4 隨訪

    術后通過門診隨訪、電話回訪(回訪日期截止2019年2月)了解患者生存、術后并發(fā)癥等情況。截止目前,隨訪時間最短為1個月,最長為66個月。其中失訪患者有6例,失訪患者未納入研究。

    1.5 統(tǒng)計學處理

    選取SPSS 19.0來分析數(shù)據(jù),各組陽性表達情況比較選取χ2檢驗,兩兩比較選取χ2分割法,各組樣本間計量資料比較采用Kruskal-Wallis H檢驗,相關性分析采用Spearman等級相關分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 免疫組化檢測結(jié)果分析

    各種蛋白在3種組織中均有不同程度的表達(圖1)。半定量分析顯示,各組間TGF-β1表達率有統(tǒng)計學差異(P<0.05);腫瘤組與炎癥組比較(χ2=8.747)、腫瘤組與正常組比較(χ2=24.273)、炎癥組與正常對照組比較(χ2=4.022),兩兩比較均有統(tǒng)計學差異(均P<0.05);TGF-β1的表達強弱關系為:腫瘤組>炎癥組>正常組。各組間survivin表達率有統(tǒng)計學差異(P<0.05);腫瘤組與炎癥組比較(χ2=5.306)、腫瘤組與正常對照組比較(χ2=21.026)、炎癥組與正常組比較(χ2=5.079),兩兩比較均有統(tǒng)計學差異(均P<0.05);survivin的表達強弱關系為:腫瘤組>炎癥組>正常組。各組間caspase-3表達率有統(tǒng)計學差異(P<0.05);腫瘤組與炎癥組比較(χ2=4.518)、腫瘤組與正常對照組比較(χ2=17.994)、炎癥組與正常組比較(χ2=4.812),兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05);caspase-3的表達強弱關系為:腫瘤組<炎癥組<正常組(表1)。

    圖1 免疫組化檢測TGF-β1、survivin與caspase-3的表達(×200)Figure1 Immunohistological staining for the expressions of TGF-β1,survivin and caspase-3 (×200)

    表1 各組TGF-β1、survivin與caspase-3表達的比較[n(%)]Table1 Comparison of the expressions of TGF-β1,survivin and caspase-3 among groups [n (%)]

    2.2 ICC組織中TGF-β1、survivin和caspase-3蛋白陽性表達率的相關性

    ICC組織中TGF-β1表達與caspase-3蛋白表達呈明顯負相關(r=-0.890,P<0.01),TGF-β1表達與survivin表達呈明顯正相關(r=0.917,P<0.01),survivin表達與caspase-3表達呈明顯負相關(r=-0.894,P<0.01)(圖2)。

    圖2 TGF-β1、survivin與caspase-3表達相關性分析Figure2 Analysis of the correlations among the expression of TGF-β1,surviving and caspase-3

    2.3 TGF-β1、survivin與caspase-3蛋白表達與ICC臨床病理特征的關系

    TGF-β1、survivin與caspase-3陽性表達均與患者的年齡、性別、HbsAg表達情況、CA19-9水平、膽道結(jié)石等因素無關(均P>0.05);與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化程度、AFP水平、腫瘤最大直徑有關(均P<0.05)。其中,TGF-β1與caspase-3陽性表達與患者的腫瘤是否侵犯血管有關(均P<0.05)(表2)。

    表2 TGF-β1、survivin與caspase-3表達與52例ICC患者臨床病理特征的關系[n(%)]Table2 Relations of the expressions of of TGF-β1,surviving and caspase-3 with clinicopathologic features of the 52 ICC patients [n (%)]

    2.4 ICC患者預后與各種臨床病理參數(shù)關系的單因素分析

    單因素分析顯示,ICC患者術后預后與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化情況、血管侵犯、腫瘤最大直徑、R0切除、CA19-9、AFP、TGF-β1、survivin及caspase-3表達等因素有關(均P<0.05);與年齡、性別、肝硬化、膽道結(jié)石、HbsAg表達等因素無關(均P>0.05)(表3)。

    表3 ICC患者預后與各種臨床病理參數(shù)關系的單因素分析Table3 Univariate analysis of the relations of the clinicopathologic parameters with the prognosis of the ICC patients

    2.5 ICC患者預后與各種臨床病理參數(shù)關系的多因素分析

    Cox比例風險模型分析表明是否R0切除、腫瘤分化情況、TGF-β1、survivin及caspase-3表達等因素是ICC患者術后生存期的獨立影響因素(均P<0.05)(表4)。

    表4 ICC患者預后與各種臨床病理參數(shù)關系的多因素分析Table4 Multivariate analysis of the relations of the clinicopathologic parameters with the prognosis of the ICC patients

    2.6 TGF-β1、survivin及caspase-3表 達 與ICC患者術后預后的關系

    對52例ICC患者采用電話方式進行隨訪,隨訪時間自患者接受手術之日起至2019年3月,患者死亡或失訪日期(失訪8例)。分析結(jié)果顯示,TGF-β1陽性表達患者的生存率明顯低于TGF-β1陰性表達患者(χ2=13.192,P=0.001);survivin陽性表達患者的生存率明顯低于survivin陰性表達患者(χ2=10.536,P=0.002);caspase-3陽性表達患者的生存率明顯高于caspase-3陰性表達患者(χ2=5.469,P=0.023)(圖3)。

    圖3 不同TGF-β1、survivin與caspase-3表達狀態(tài)ICC患者生存曲線Figure3 The survival curves of ICC patients with different expression statuses of TGF-β1,surviving and caspase-3

    3 討 論

    ICC的發(fā)生和發(fā)展是由多種因素共同參與、多步驟、多階段的一個復雜過程。ICC由于解剖位置特殊,起病不易發(fā)現(xiàn),惡性程度高,預后差,與肝細胞肝癌相比更易發(fā)生早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與術后復發(fā)[13]。近年來,ICC的發(fā)病率逐年升高,由于該腫瘤異質(zhì)性強,早期診斷困難,外科手術是當前可能治愈ICC的唯一的方法,但由于缺少有效的早期診斷方法,只有大約10%~15%的膽管癌患者適合手術治療[14]。然而術后總體預后較差,針對ICC早期診斷和早期治療的研究一直是臨床上的重要難題[15-17]。

    TGF-β1在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著雙重作用,在腫瘤起始階段,可抑制腫瘤細胞的增殖,誘導腫瘤細胞凋亡,但是在腫瘤進展期,則通過多種信號通路調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),促進新生血管形成和腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。有文獻[18]報道,TGF-β1異常表達可影響ICC的惡性生物學行為,是判斷預后的重要指標,同時還可以促進EMT的發(fā)生,影響膽管癌的發(fā)生發(fā)展[19]。本研究結(jié)果顯示,TGF-β1在正常組、炎癥組和腫瘤組中均有表達,各組平均陽性表達率分別是16.67%、40.0%、73.08%,TGF-β1陽性表達率在3組肝內(nèi)膽管組織中存在統(tǒng)計學差異(P<0.05),且本文通過多因素分析發(fā)現(xiàn)TGF-β1表達水平是ICC患者術后生存期的不良獨立預后因素,TGF-β1陽性表達與陰性表達患者生存曲線差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=13.192,P=0.001),以上結(jié)果表明TGF-β1可作為ICC患者術后預后情況的獨立指標之一。

    survivin是目前已知最強的凋亡抑制因子,其表達跟腫瘤的分期及生物學功能有著重要聯(lián)系[20]。國內(nèi)學者秦興雷等[21]通過檢測膽管癌組織和癌旁組織中survivin蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)肝外膽管癌組織中survivin蛋白陽性表達率要遠遠高于癌旁組織,兩者陽性表達率分別為67.8%、20.0%。本研究結(jié)果顯示,ICC組織中的survivin蛋白陽性表達率遠高于炎癥組和正常組患者,分別為69.23%、43.33%、16.67%,這與以上報道結(jié)果相一致。另外,許鵬等[22]研究發(fā)現(xiàn),survivin蛋白的表達水平還與腫瘤的TNM分期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤呈正相關,與腫瘤的分化程度呈負相關。Grabowski等[23]和Rohayem等[24]報道顯示,survivin蛋白的表達與腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)行為呈正相關,可作為監(jiān)測膽管癌患者術后預后情況的獨立指標。這與本研究結(jié)果相一致,survivin陽性表達與陰性表達患者生存曲線差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=10.536,P=0.002),且通過多因素分析發(fā)現(xiàn),survivin蛋白表達水平是ICC患者術后生存期的不良獨立預后因素。然而survivin是如何抑制腫瘤細胞凋亡的具體作用機制至今仍存在巨大爭議,有研究[24-25]表明,survivin可能通過直接抑制凋亡終末效應器caspase-3和caspase-7的活性阻斷各種刺激誘導的細胞凋亡過程[26];caspase-3是細胞凋亡通路中重要的執(zhí)行分子之一,也是凋亡級聯(lián)反應的最終效應蛋白,被認為是各種凋亡刺激因子激活的關鍵酶。在正常狀況下,細胞胞質(zhì)中的caspase-3無活性,但當細胞接受凋亡刺激時,它才會被激活,進而誘導細胞發(fā)生凋亡[27]。Friman[28]研究發(fā)現(xiàn)caspase-3與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關,是腫瘤惡性轉(zhuǎn)移的重要原因。本實驗結(jié)果顯示,caspase-3蛋白在正常組膽管組織胞質(zhì)中表達,而在炎癥組和腫瘤組膽管組織陽性表達率則明顯降低,在正常組、炎癥組、腫瘤組中平均陽性表達率分別為90.0%、66.67%、42.31%,三者之間比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05),本研究結(jié)果還顯示,caspase-3陽性表達與陰性表達患者生存曲線差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=5.469,P=0.023),survivin表達與caspase-3表達呈顯著負相關(r= -0.894,P<0.01)。這與李楊鈞等[29]研究結(jié)果相一致,他們認為 survivin在膽管細胞癌中的陽性表達率較高,但caspase-3較低,兩者呈負相關,考慮可能是survivin抑制了caspase-3介導的細胞凋亡。以上研究結(jié)果表明survivin和caspase3的表達與ICC的發(fā)生存在密切關系,提示兩者在ICC中的惡性轉(zhuǎn)化及發(fā)生、發(fā)展機制中起關鍵作用。這與盧昕等[30]研究結(jié)果相一致,他們認為caspase-3和caspase-9在膽管癌組織中的表達水平和活性較低,這有利于膽管癌細胞逃逸,維持較高的增殖活性,促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,其中,survivin可以通過促進procaspase-9的活化來阻止caspase-3的激活,從而抑制腫瘤細胞凋亡。

    綜上所述,在肝內(nèi)膽管結(jié)石相關性ICC中TGF-β1、survivin陽性表達率升高,兩者呈正相關,caspase-3陽性表達率降低,與前兩者呈負相關。TGF-β1、survivin與caspase-3基因在ICC中的臨床應用價值得期待,有望成為ICC分子標記物和治療靶點。監(jiān)測ICC組織中TGF-β1、survivin與caspase-3的水平,有助于判斷患者的預后。但是,關于三者在ICC發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機制,仍需進一步研究。

    猜你喜歡
    膽管癌膽管免疫組化
    肝臟里的膽管癌
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:49:00
    B7-H4在肝內(nèi)膽管癌的表達及臨床意義
    夏枯草水提液對實驗性自身免疫性甲狀腺炎的治療作用及機制研究
    嬰幼兒原始黏液樣間葉性腫瘤一例及文獻復習
    結(jié)直腸癌組織中SOX9與RUNX1表達及其臨床意義
    CT及MRI對肝內(nèi)周圍型膽管癌綜合診斷研究
    子宮瘢痕妊娠的病理免疫組化特點分析
    CXCL12在膽管癌組織中的表達及意義
    腹腔鏡膽囊切除術膽管損傷12例
    膽管支氣管瘺1例
    狂野欧美激情性bbbbbb| 午夜av观看不卡| 久久久久久久大尺度免费视频| 有码 亚洲区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲国产精品国产精品| 久久综合国产亚洲精品| 久久99精品国语久久久| 波野结衣二区三区在线| 日本欧美视频一区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 天美传媒精品一区二区| 日韩伦理黄色片| av福利片在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 午夜av观看不卡| 大陆偷拍与自拍| 亚洲三级黄色毛片| 少妇人妻精品综合一区二区| 免费大片18禁| 国产 一区精品| 高清黄色对白视频在线免费看 | 亚洲熟女精品中文字幕| 国产熟女欧美一区二区| 蜜桃在线观看..| 韩国av在线不卡| 99久久综合免费| 日本与韩国留学比较| 国产高清不卡午夜福利| 国产欧美日韩精品一区二区| 成年av动漫网址| a 毛片基地| 久久久久人妻精品一区果冻| av福利片在线| 免费观看在线日韩| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 人妻一区二区av| 看免费成人av毛片| 久久狼人影院| 国产一级毛片在线| videossex国产| 亚洲情色 制服丝袜| 一级毛片 在线播放| 久久久午夜欧美精品| av.在线天堂| 在线精品无人区一区二区三| 婷婷色av中文字幕| 下体分泌物呈黄色| 久久韩国三级中文字幕| 免费av中文字幕在线| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产成人午夜福利电影在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 另类精品久久| 少妇熟女欧美另类| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲国产精品一区三区| 欧美精品一区二区免费开放| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲av免费高清在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产成人精品婷婷| 26uuu在线亚洲综合色| 久久热精品热| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲,欧美,日韩| 精品久久久噜噜| 欧美成人精品欧美一级黄| 日韩亚洲欧美综合| 免费观看无遮挡的男女| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产 精品1| 激情五月婷婷亚洲| 中国三级夫妇交换| av在线观看视频网站免费| 欧美xxⅹ黑人| h日本视频在线播放| 免费看不卡的av| 中文在线观看免费www的网站| 国产精品伦人一区二区| 人妻人人澡人人爽人人| 一级毛片久久久久久久久女| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲av.av天堂| 深夜a级毛片| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| av在线老鸭窝| 高清不卡的av网站| 最近最新中文字幕免费大全7| 欧美日韩视频精品一区| 免费观看在线日韩| 九九在线视频观看精品| 免费看光身美女| tube8黄色片| 久久99蜜桃精品久久| 丰满少妇做爰视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 国产精品一区www在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 高清不卡的av网站| 久久国产亚洲av麻豆专区| 午夜免费鲁丝| 久久久久久久精品精品| 青青草视频在线视频观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 精品一区在线观看国产| 夫妻午夜视频| 日韩av免费高清视频| 一级a做视频免费观看| 一边亲一边摸免费视频| 91精品国产国语对白视频| 久久久久久久精品精品| 色视频在线一区二区三区| 一级二级三级毛片免费看| 国产精品女同一区二区软件| 视频中文字幕在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产精品女同一区二区软件| 免费大片18禁| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 色视频在线一区二区三区| 黄色怎么调成土黄色| 观看美女的网站| 91在线精品国自产拍蜜月| 91在线精品国自产拍蜜月| 高清不卡的av网站| 91精品伊人久久大香线蕉| 欧美日韩av久久| 亚洲精品日本国产第一区| 热re99久久国产66热| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产亚洲最大av| 国产男女内射视频| √禁漫天堂资源中文www| 日韩av免费高清视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 一级毛片 在线播放| 最新中文字幕久久久久| 国产 一区精品| 国产精品偷伦视频观看了| 日韩一本色道免费dvd| 日韩欧美 国产精品| 寂寞人妻少妇视频99o| 制服丝袜香蕉在线| av.在线天堂| 国产免费福利视频在线观看| 免费观看在线日韩| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 三级经典国产精品| 精品酒店卫生间| 伦理电影大哥的女人| 国产成人一区二区在线| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 精品熟女少妇av免费看| 日本黄大片高清| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产极品天堂在线| 成人黄色视频免费在线看| 精品国产乱码久久久久久小说| freevideosex欧美| 边亲边吃奶的免费视频| 成年人免费黄色播放视频 | 看十八女毛片水多多多| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 女性生殖器流出的白浆| a级毛片在线看网站| 女人精品久久久久毛片| 一级毛片久久久久久久久女| 一二三四中文在线观看免费高清| 91久久精品国产一区二区成人| 嫩草影院入口| 久久久久精品性色| 久久精品久久久久久久性| 欧美3d第一页| 欧美成人午夜免费资源| 国产色爽女视频免费观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 麻豆成人av视频| 国产成人freesex在线| 国产在线免费精品| 欧美日韩综合久久久久久| 久久热精品热| 3wmmmm亚洲av在线观看| 精品一区二区免费观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久青草综合色| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲av免费高清在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 久久久久精品性色| a级毛色黄片| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产在线一区二区三区精| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 夜夜爽夜夜爽视频| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 国产探花极品一区二区| 久久鲁丝午夜福利片| 色网站视频免费| av.在线天堂| 在线观看av片永久免费下载| 久久99蜜桃精品久久| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产视频首页在线观看| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲国产精品成人久久小说| 免费在线观看成人毛片| 三上悠亚av全集在线观看 | 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产极品天堂在线| 最黄视频免费看| 99热网站在线观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 高清av免费在线| 色哟哟·www| 国产亚洲最大av| 国产精品女同一区二区软件| 久久午夜福利片| 国产精品熟女久久久久浪| 曰老女人黄片| a 毛片基地| 成人二区视频| 精品亚洲成国产av| 99久久精品一区二区三区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 在线精品无人区一区二区三| 国产高清不卡午夜福利| 天天操日日干夜夜撸| 中文欧美无线码| 亚洲av男天堂| av一本久久久久| av国产精品久久久久影院| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲精品第二区| 亚洲av不卡在线观看| 国产成人精品一,二区| a级片在线免费高清观看视频| 看十八女毛片水多多多| 边亲边吃奶的免费视频| 久久国产乱子免费精品| 色吧在线观看| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲高清免费不卡视频| 老司机影院成人| 欧美 日韩 精品 国产| 午夜影院在线不卡| 久久久欧美国产精品| 欧美最新免费一区二区三区| 欧美xxⅹ黑人| 国产亚洲5aaaaa淫片| 日本色播在线视频| 久久久久久伊人网av| 国产av码专区亚洲av| av福利片在线| 亚洲人与动物交配视频| 高清午夜精品一区二区三区| 亚洲成人手机| 大香蕉久久网| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 99热这里只有是精品在线观看| 高清午夜精品一区二区三区| 美女内射精品一级片tv| 大香蕉久久网| 最近中文字幕高清免费大全6| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 少妇高潮的动态图| 搡老乐熟女国产| av在线老鸭窝| 久久久久久伊人网av| 美女视频免费永久观看网站| 国产黄频视频在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说| h日本视频在线播放| 亚洲国产精品一区三区| 日韩电影二区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 日韩av免费高清视频| 亚洲国产精品国产精品| 欧美日韩精品成人综合77777| 下体分泌物呈黄色| 国产精品一区二区性色av| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久av网站| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 高清视频免费观看一区二区| 高清黄色对白视频在线免费看 | 蜜臀久久99精品久久宅男| 人人妻人人澡人人看| 精品一区在线观看国产| 人妻系列 视频| 欧美区成人在线视频| 亚洲欧美精品专区久久| 精品少妇内射三级| 久久毛片免费看一区二区三区| 又大又黄又爽视频免费| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 男人添女人高潮全过程视频| 国产极品天堂在线| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 伊人久久精品亚洲午夜| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲无线观看免费| 深夜a级毛片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美成人午夜免费资源| 国产av精品麻豆| 成人影院久久| 国产精品蜜桃在线观看| 少妇高潮的动态图| 我要看日韩黄色一级片| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产av精品麻豆| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧美xxxx性猛交bbbb| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 成人特级av手机在线观看| 亚洲不卡免费看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 9色porny在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲精品亚洲一区二区| 多毛熟女@视频| 高清在线视频一区二区三区| 国产黄色免费在线视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产精品蜜桃在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久久国产亚洲av麻豆专区| 丝袜喷水一区| 婷婷色麻豆天堂久久| 免费大片18禁| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产精品三级大全| 极品教师在线视频| 高清黄色对白视频在线免费看 | 亚洲不卡免费看| 大香蕉久久网| 精品久久国产蜜桃| 久久久久久久大尺度免费视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 青青草视频在线视频观看| 男女无遮挡免费网站观看| 国产精品一区二区性色av| 男男h啪啪无遮挡| 国产精品人妻久久久久久| 女人精品久久久久毛片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 日本免费在线观看一区| 中文字幕av电影在线播放| tube8黄色片| 少妇丰满av| 亚洲精品国产av成人精品| 在线精品无人区一区二区三| 久久ye,这里只有精品| 国产爽快片一区二区三区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 一区二区三区四区激情视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲伊人久久精品综合| 国产视频内射| 全区人妻精品视频| 在线观看国产h片| av黄色大香蕉| 国产极品天堂在线| 黄色毛片三级朝国网站 | 中国三级夫妇交换| 一本大道久久a久久精品| 在线观看人妻少妇| 在线天堂最新版资源| 日本wwww免费看| av国产久精品久网站免费入址| 国产精品不卡视频一区二区| 少妇人妻 视频| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲va在线va天堂va国产| 少妇的逼水好多| 精品国产乱码久久久久久小说| 婷婷色综合www| 中国美白少妇内射xxxbb| 女人精品久久久久毛片| 国产在线一区二区三区精| 日本色播在线视频| 国产淫片久久久久久久久| 黑丝袜美女国产一区| 一本久久精品| 永久网站在线| 久久精品夜色国产| 国产一区二区三区av在线| 国产精品久久久久久久久免| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚州av有码| 美女中出高潮动态图| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 日韩成人av中文字幕在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 91精品伊人久久大香线蕉| h日本视频在线播放| 亚洲欧美日韩东京热| 精品少妇久久久久久888优播| 国产在线视频一区二区| 六月丁香七月| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 春色校园在线视频观看| 中文天堂在线官网| 久久精品久久久久久久性| 美女主播在线视频| 91成人精品电影| 久久人人爽人人爽人人片va| 91精品一卡2卡3卡4卡| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产欧美亚洲国产| 午夜91福利影院| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产成人a∨麻豆精品| 波野结衣二区三区在线| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产精品一区二区在线观看99| 国产免费一区二区三区四区乱码| 寂寞人妻少妇视频99o| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 黑人高潮一二区| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 伊人久久精品亚洲午夜| 一区二区三区乱码不卡18| 成人毛片60女人毛片免费| 久久人人爽人人片av| 一区在线观看完整版| 国产在线一区二区三区精| 各种免费的搞黄视频| 日韩电影二区| 视频中文字幕在线观看| 久久国产精品大桥未久av | 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产欧美亚洲国产| 亚洲欧美清纯卡通| 国产永久视频网站| 嘟嘟电影网在线观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产色爽女视频免费观看| 国产精品欧美亚洲77777| 人妻一区二区av| 久久韩国三级中文字幕| 高清黄色对白视频在线免费看 | 国产一区二区在线观看av| 少妇精品久久久久久久| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久久久国产网址| 国产成人一区二区在线| 99热6这里只有精品| 国产免费福利视频在线观看| 一区二区三区免费毛片| 久久鲁丝午夜福利片| 成人影院久久| h视频一区二区三区| 亚洲av男天堂| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产 一区精品| 国产乱来视频区| 一级,二级,三级黄色视频| 女性被躁到高潮视频| 国产有黄有色有爽视频| 美女福利国产在线| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 91精品一卡2卡3卡4卡| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 久久久久国产网址| 国内精品宾馆在线| 欧美精品一区二区免费开放| 精品亚洲成a人片在线观看| 夫妻午夜视频| 亚洲中文av在线| 男人和女人高潮做爰伦理| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产亚洲91精品色在线| 在线精品无人区一区二区三| 国产在视频线精品| 亚洲真实伦在线观看| av线在线观看网站| 欧美另类一区| 女性生殖器流出的白浆| 下体分泌物呈黄色| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 黄色欧美视频在线观看| 视频中文字幕在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 欧美丝袜亚洲另类| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久毛片免费看一区二区三区| 日日爽夜夜爽网站| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 一个人免费看片子| 精品久久久久久久久av| www.av在线官网国产| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲天堂av无毛| 99热这里只有是精品50| 校园人妻丝袜中文字幕| 精品熟女少妇av免费看| 国产精品久久久久久精品古装| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久久欧美国产精品| 美女内射精品一级片tv| 男人舔奶头视频| 久久精品国产亚洲av天美| √禁漫天堂资源中文www| av有码第一页| 国产成人aa在线观看| 最新中文字幕久久久久| a级一级毛片免费在线观看| 欧美性感艳星| 伊人久久精品亚洲午夜| 精品少妇久久久久久888优播| 日韩成人伦理影院| av一本久久久久| 一级毛片aaaaaa免费看小| 日本vs欧美在线观看视频 | 国产女主播在线喷水免费视频网站| 日韩亚洲欧美综合| 两个人的视频大全免费| 简卡轻食公司| 日韩人妻高清精品专区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲av国产av综合av卡| 久久精品国产亚洲网站| 国产精品福利在线免费观看| 丝袜在线中文字幕| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产乱人偷精品视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 国产精品三级大全| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 青青草视频在线视频观看| 国产在线免费精品| 性色avwww在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 乱系列少妇在线播放| 国产精品福利在线免费观看| 中文字幕亚洲精品专区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 在线观看人妻少妇| 一级a做视频免费观看| 中文资源天堂在线| 久久青草综合色| www.av在线官网国产| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产一区二区三区综合在线观看 | 伦理电影大哥的女人| 热re99久久国产66热| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久国内精品自在自线图片| av网站免费在线观看视频| 99热这里只有是精品在线观看| av免费观看日本| 亚洲国产精品国产精品| 777米奇影视久久| 97超碰精品成人国产| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲成色77777| 日本欧美国产在线视频| 亚洲精品自拍成人| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲怡红院男人天堂| 成人综合一区亚洲| 亚洲国产精品一区三区| 女人久久www免费人成看片| 婷婷色综合www| 视频区图区小说| 亚洲第一av免费看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 我的老师免费观看完整版| 丝瓜视频免费看黄片| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 永久免费av网站大全| av线在线观看网站| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 成人毛片60女人毛片免费| 久久精品国产a三级三级三级| 偷拍熟女少妇极品色| 边亲边吃奶的免费视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 天美传媒精品一区二区| 男女边摸边吃奶| 欧美精品高潮呻吟av久久| 美女福利国产在线| 国产精品成人在线| 青春草视频在线免费观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 欧美日韩视频精品一区|