RCAS1/EBAG9與P53蛋白在肝內(nèi)膽管癌中的表達(dá)及臨床意義

王逸君，徐自強(qiáng)，王志明，樂(lè)冬友，袁偉杰，許可

（郴州市第一人民醫(yī)院 1.急診科 3.重癥醫(yī)學(xué)科，湖南 郴州 423000；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 普通外科，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）起源于次級(jí)膽管以及分支上皮細(xì)胞的惡性腫瘤[1]，可沿著膽管周?chē)蚩v行浸潤(rùn)生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移及侵襲能力極強(qiáng)[2]，嚴(yán)重危害著人們的身體健康[3]。目前根治手術(shù)仍然是治療ICC的最佳治療方案[4]，但大多數(shù)患者確診時(shí)為時(shí)已晚，無(wú)法手術(shù)治療[5-7]。近年發(fā)現(xiàn)了一種新的癌抗原RCAS1，即表達(dá)于人子宮腺癌細(xì)胞株（SiSo）上的與受體相關(guān)腫瘤抗原，后來(lái)被證實(shí)與雌激素受體結(jié)合片斷相關(guān)基因9（estrogen receptor-binding fragment-associated gene 9，EBAG9）為同種蛋白[8-9]，RCAS1/EBAG9高表達(dá)的患者往往預(yù)后不良，而人類(lèi)惡性腫瘤中多數(shù)存在P53突變，但在ICC中RCAS1/EBAG9與P53蛋白的研究很少。本研究旨在探討RCAS1/EBAG9與P53蛋白在ICC中的表達(dá)及臨床意義，試圖為早期臨床診治ICC提供新的靶點(diǎn)，從而為ICC的診治提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源及分組 ICC組織41例：男23例，女18例；年齡34～74歲,平均（55.35±13.02）歲，術(shù)前均未行放療、化療及免疫治療。標(biāo)本收集于2008年7月—2013年10月湘雅醫(yī)院經(jīng)過(guò)外科手術(shù)患者，按WHO病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分：低分化癌25例，中高分化癌16例；按臨床病理分型：腫塊型26例，管周浸潤(rùn)型6例，混合型9例；按組織學(xué)分型分：腺癌27例，乳頭狀腺癌8例，其他類(lèi)型癌6例；按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分：轉(zhuǎn)移28例，無(wú)轉(zhuǎn)移13例；按肝外侵犯分：侵犯5例，無(wú)侵犯36例；按TNM分期：I～I(xiàn)I期10例，III-IV期31例；按病灶個(gè)數(shù)：?jiǎn)蝹€(gè)34例，多個(gè)7例；按最大直徑分：＞5 cm 24例，＜5 cm 17例；按術(shù)前血清CEA水平：正常26例，升高15例；按術(shù)前血清CA19-9水平分：正常22例，升高例19例；按術(shù)前血清AFP水平分：正常35例，升高6例。正常膽管組9例，標(biāo)本均取自膽管結(jié)石患者行Roux-en-Y膽腸吻合的正常膽管組織，男 4例，女5例；年齡32～71歲，平均（51.61±7.17）歲。上述組織放入10%福爾馬林中固定，并包埋在石蠟塊中，以備免疫組化用，蠟塊作3～4 μm的切片3張，其中1張行HE常規(guī)染色，另2張分別行RCAS1/EBAG9、P53免疫組化檢測(cè)，且HE常規(guī)染色均由湘雅醫(yī)院病理科高年資醫(yī)生病理檢查證實(shí)。

1.1.2 抗體 RCAS1/EBAG9抗體（鼠抗人單克隆抗體22-1-1）購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，適用的稀釋濃度為1:75。小鼠抗人P53單克隆抗體（DO-7），購(gòu)自北京中杉金橋公司,適用的稀釋濃度分別為1:50。免疫組化試劑盒購(gòu)自上海晶美生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)步驟 采用SP法檢測(cè)RCAS1/EBAG9與P53的表達(dá)。檢測(cè)方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用已知陽(yáng)性的正常前列腺組織切片作為RCAS1/EBAG9 的陽(yáng)性對(duì)照。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.2 結(jié)果判斷 每張切片隨機(jī)連續(xù)觀察5個(gè)高倍視野，每處視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：RCAS1/EBAG9免疫組化染色以細(xì)胞漿或/和胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，采用半定量積分法統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10]：⑴ 著色強(qiáng)度:無(wú)著色為0分、淡黃色為1分、黃色為2分、深棕黃色為3分；⑵ 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分、＜25%為1分、25%～50%為2分、＞50%為3分。⑴⑵項(xiàng)相加，0～2分為陰性（-）、3～4分為陽(yáng)性（+）、5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性（++）。P53免疫組化染色以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色物質(zhì)為陽(yáng)性表達(dá)（+），無(wú)棕黃色物質(zhì)為陰性表達(dá)（-）。

1.3 隨訪資料

通過(guò)門(mén)診復(fù)查以及電話聯(lián)系進(jìn)行隨訪。生存時(shí)間以月計(jì)算，自手術(shù)當(dāng)天起開(kāi)始計(jì)算生存時(shí)間。如果死亡原因?yàn)镮CC復(fù)發(fā)導(dǎo)致患者死亡，則以死亡日期為截止日期，若在最后截止日期患者仍然生存則以最后1次隨訪日期為截止日期，另外，將死于ICC以外原因歸為失訪，本研究最后隨訪截止日期2018年10月31日。

圖1 免疫組化檢測(cè)RCAS1/EBAG9與P53蛋白表達(dá)（SP×400） Figure1 Immunohistochemical staining for expressions of RCAS1/EBAG9 and P53

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用四格表資料的χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，雙變量Spearman's相關(guān)分析，Kaplan-Meier法繪制生存曲線及Log-rank檢驗(yàn)對(duì)術(shù)后生存率分析，采用Cox回歸模型進(jìn)行單因素及多因素生存分析。檢驗(yàn)結(jié)果取雙側(cè)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RCAS1/EBAG9蛋白與P53蛋白在ICC組織中的表達(dá)

在41例ICC組織中RCAS1/EBAG9蛋白陽(yáng)性率為78.0%，9例正常膽管組織RCAS1/EBAG9蛋白無(wú)表達(dá)，ICC組織RCAS1/EBAG9蛋白陽(yáng)性率明顯高于正常膽管組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=46.61，P=0.000）；在41例ICC組織P53蛋白陽(yáng)性率為43.9%，9例正常膽管組織P53蛋白無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，ICC組織P53蛋白陽(yáng)性率明顯高于正常膽管組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=23.06，P=0.000）（圖1）（表1）。

表1 RCAS1/EBAG9蛋白與P53蛋白在ICC組織和正常膽管中的陽(yáng)性表達(dá)率比較[n（%）]Table1 Comparison of the positive expression rates of RCAS1/EBAG9 and P53 proteins in ICC and normal bile duct tissue [n (%)]

2.2 RCAS1/EBAG9與P53蛋白表達(dá)與ICC臨床病理特征的關(guān)系

RCAS1/EBAG9蛋白表達(dá)與ICC腫瘤直徑（χ2=4.495，P=0.034）、病理分級(jí)（χ2=5.341，P=0.021）、TNM分期（χ2=4.101，P=0.043）以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=4.604，P=0.032）有關(guān)，與年齡、性別、部位、病理分型、組織學(xué)分型、病灶個(gè)數(shù)、肝外侵犯肝外以及術(shù)前血清CEA、CA19-9與AFP水平無(wú)關(guān)（均P＞0.05）；P53蛋白表達(dá)與ICC腫瘤直徑（χ2=4.894，P=0.027）、病理分級(jí)（χ2=6.740，P=0.009）以及TNM分期（χ2=4.486，P=0.034）有關(guān)，與年齡、性別、部位、病理分型、組織學(xué)分型、TNM病灶個(gè)數(shù)、肝外侵犯以及術(shù)前血清CEA、CA19-9與AFP水平無(wú)關(guān)（均P＞0.05）（表2）。

表2 RCAS1/EBAG9與P53表達(dá)與ICC患者臨床資料的關(guān)系 [n（%）] Table2 Relations of RCAS1/EBAG9 and P53 expressions with clinicopathologic features of ICC patients [n (%)]

表2 RCAS1/EBAG9與P53表達(dá)與ICC患者臨床資料的關(guān)系 [n（%）] （續(xù)）Table2 Relations of RCAS1/EBAG9 and P53 expressions with clinicopathologic features of ICC patients [n (%)] (continued)

2.3 ICC組織中RCAS1/EBAG9與P53蛋白表達(dá)的相關(guān)性

雙變量Spearman's秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，RCAS1/EBAG9與P53蛋白表達(dá)正相關(guān)（r=0.329，P=0.018）（表3）。

表3 ICC組織中RCAS1/EBAG9與P53蛋白表達(dá)之間的關(guān)系Table3 The relationship between RCAS1/EBAG9 and P53 protein expressions in ICC tissue

2.4 RCAS1/EBAG9及P53蛋白表達(dá)與ICC術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系

41例患者中位總生存時(shí)間為29.7個(gè)月。RCAS1/EBAG9陽(yáng)性與陰性表達(dá)的患者中位總生存時(shí)間分別為23.6、43.8個(gè)月，P53陽(yáng)性與陰性表達(dá)的患者中位總生存時(shí)間分別為19.2、34.4個(gè)月。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線及生存曲線Logrank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，RCAS1/EBAG9陽(yáng)性與陰性表達(dá)的患者術(shù)后總生存時(shí)間之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.862，P=0.049），RCAS1/EBAG9陰性表達(dá)患者術(shù)后生存期延長(zhǎng)，同樣，P53陰性表達(dá)患者術(shù)后生存期延長(zhǎng)（χ2=4.977，P=0.026）（圖2）。

采用單因素Cox回歸分析表明，病理分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵犯肝外組織以及RCAS1/EBAG9與P53蛋白表達(dá)均可預(yù)測(cè)ICC患者預(yù)后（均P＜0.05）（表4）；采用多因素Cox回歸分析表明，病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵犯肝外組織以及RCAS1/EBAG9蛋白表達(dá)是ICC患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（均P＜0.05）（表5）。

圖2 ICC患者生存曲線圖Figure2 Survival curves of the ICC patients

表4 41例ICC患者病理資料單因素Cox回歸分析Table4 Univariate Cox analysis of the clinicopathologic data of the 41 ICC patients

表5 多因素Cox回歸模型分析結(jié)果Table5 Results of multivariate Cox regression model analysis

3 討 論

RCAS1/EBAG9是Sonoda等[8-9,11]在1996年發(fā)現(xiàn)一種新的腫瘤抗原，它是通過(guò)CPG（CPG是由CPG二核苷酸序列聚集而成）基因組合克隆出來(lái)，腫瘤細(xì)胞是通過(guò)對(duì)RCAS1/EBAG9的表達(dá)來(lái)逃避免疫攻擊，從而誘導(dǎo)陽(yáng)性受體免疫細(xì)胞凋亡[12]。最新研究表明，RCAS1/EBAG9在多種腫瘤細(xì)胞膜上呈高表達(dá)[13-16]，Enjoji等[17]發(fā)現(xiàn)，膽管腺癌和膽囊癌中均有RCAS1高表達(dá)，Suzuoki等[18]研究發(fā)現(xiàn)，RCAS1在肝外膽管癌高表達(dá)是一個(gè)獨(dú)立的不良預(yù)后因素，而在正常膽道上皮細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)。本研究也發(fā)現(xiàn)，在ICC組織中檢測(cè)到了RCAS1/EBAG9蛋白高表達(dá)，而在正常膽管組織無(wú)表達(dá)，提示了RCAS1/EBAG9蛋白可能是ICC腫瘤標(biāo)志物之一，這對(duì)ICC早發(fā)現(xiàn)早診斷早治療具有臨床指導(dǎo)意義，也為早期外科手術(shù)提供機(jī)遇。

Aoki等[19]發(fā)現(xiàn)在肝非癌組織RCAS1/EBAG9低表達(dá)，而高表達(dá)與腫瘤低分化程度和增殖活性升高相關(guān)；在甲狀腺癌中，RCAS1/EBAG9可能參與甲狀腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[20]。已有大量相關(guān)的研究表明，RCAS1/EBAG9 在膀胱癌[15]、非小細(xì)胞肺癌[21]與膽囊癌[22]中高表達(dá)，并且與腫瘤臨床分期、分化程度、預(yù)后明顯相關(guān)。在本研究也發(fā)現(xiàn)，RCAS1/EBAG9高表達(dá)與ICC腫瘤體積大、低分化、進(jìn)展期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，陰性表達(dá)的患者術(shù)后總生存時(shí)間延長(zhǎng)；經(jīng)過(guò)單因素與多因素Cox回歸分析表明，低分化、肝外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與RCAS1/EBAG9陽(yáng)性表達(dá)等因素是ICC獨(dú)立消極預(yù)后影響因素，推測(cè)RCAS1/EBAG9參與了腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移，是獨(dú)立的消極預(yù)后因素，可作為判斷ICC進(jìn)展與預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

人類(lèi)惡性腫瘤中多數(shù)存在P53突變[23]，P53基因突變可導(dǎo)致缺陷DNA大量復(fù)制，甚至導(dǎo)致惡變[24]。Meng等[25]發(fā)現(xiàn)，膽管癌患者中P53蛋白高表達(dá)，筆者[26]前期研究發(fā)現(xiàn)，肝外膽管癌患者P53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為45.2%（19/42），并且低分化、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者表達(dá)升高，陰性表達(dá)患者術(shù)后總生存時(shí)間延長(zhǎng)，結(jié)合前期研究，P53蛋白也是肝內(nèi)外膽管癌進(jìn)展與預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

目前更精確的RCAS1/EBAG9的細(xì)胞學(xué)活性和生物化學(xué)活性尚不清楚。Wu等[27]實(shí)驗(yàn)表明，P53表達(dá)可能干擾RCAS1/EBAG9表達(dá)，通過(guò)P53敲低RCAS1/EBAG9表達(dá)可顯著降低結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT-29體外增殖能力，RCAS1/EBAG9在體內(nèi)可能是P53的靶基因。本研究結(jié)果顯示ICC組織中RCAS1/EBAG9蛋白與P53蛋白表達(dá)正相關(guān)性，聯(lián)合檢測(cè)RCAS1/EBAG9與P53，可提高ICC診治水平，為判斷ICC進(jìn)展與預(yù)后提供新思路。

綜上所述，本研究中RCAS1/EBAG9與P53在ICC組織中表達(dá)增加,可能是ICC腫瘤標(biāo)志物，并且與患者不良臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)ICC患者預(yù)后因子，可望作為生物學(xué)治療的作用靶點(diǎn)。聯(lián)合檢測(cè)ICC的RCAS1/EBAG9與P53，可為早發(fā)現(xiàn)早診斷早治療提供依據(jù)。但RCAS1/EBAG9和P53蛋白更精確的作用機(jī)制尚有待更進(jìn)一步探索。