• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    賴氨酰氧化酶樣蛋白2在膽管癌中的表達以及與血管內(nèi)皮生長因子A及血管生成的關(guān)系

    2019-09-07 02:34:20彭滔李大江王曙光
    中國普通外科雜志 2019年8期
    關(guān)鍵詞:膽管癌胞外基質(zhì)培養(yǎng)基

    彭滔,李大江,王曙光

    (1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽外科研究所,重慶 400038;2.長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肝膽外科,湖北 荊州 434000)

    膽管癌(cholangiocarcinoma,CCA)是起源于肝內(nèi)外膽樹上皮且具有高度侵襲性的惡性腫瘤,盡管發(fā)生率不高,但是病死率高[1-2]。盡管在手術(shù)方面取得了很大進步,但是5年生存率仍然較低[3]。因此尋找新的靶點為治療膽管癌提供新的策略。賴氨酰氧化酶樣蛋白2(lysyl oxidase-like 2,LOXL2)是細胞外基質(zhì)修飾酶的賴氨酰氧化酶家族成員之一。LOXL2最初是從人成纖維細胞分離出來,并參與細胞外基質(zhì)的重塑。各項研究表明LOXL2高表達促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移以及與患者的預(yù)后密切相關(guān)[4-6]。課題組先前通過免疫組化證實了LOXL2在膽管癌組織中高表達,并促進了膽管癌的侵襲轉(zhuǎn)移[4],但是其下游機制不是很清楚,為了探索LOXL2在膽管癌中的作用機制,本研究進一步通過GEO數(shù)據(jù)庫證實LOXL2在膽管癌中表達情況,利用GSEA分析LOXL2與血管形成的關(guān)系,在GEO數(shù)據(jù)中分析LOXL2與血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)表達的關(guān)系,并在體外實驗通過干預(yù)LOXL2觀察VEGA的表達變化及其分泌水平對血管形成影響。

    1 材料與方法

    1.1 數(shù)據(jù)庫分析

    1.1.1 數(shù)據(jù)來源 膽管癌數(shù)據(jù)從公共數(shù)據(jù)庫GEO下載(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo,GSE76297,GSE107943,GSE26566,GSE89749)。

    1.1.2 基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA) GSEA用來評估一個預(yù)先定義的基因集的基因在與表型相關(guān)度排序的基因表中的分布趨勢,從而判斷其對表型的貢獻[7]。根據(jù)GSE76297數(shù)據(jù)庫中癌組織LOXL2 mRNA的表達中位數(shù)劃分為高低兩組,選取MsiDB(Molecular Signatures Database v6.2)中與血管生成相關(guān)的基 因 集(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)。GSEA分析使用GSEA2.0.9(http://www.broadinstitute.org/gsea)。根 據(jù) 劃分的LOXL2 mRNA高低兩組通過GSEA軟件鑒別LOXL2與血管生成之間的關(guān)系。

    1.2 細胞實驗

    1.2.1 細胞培養(yǎng)及病毒轉(zhuǎn)染 QBC939和RBE膽管癌細胞系由本實驗室儲存,人臍靜脈內(nèi)皮細 胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)購自美國ATCC細胞庫,培養(yǎng)基為含10%胎牛血清(ZETA,日本)的RPMI 1640,細胞培養(yǎng)在5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中。靶向LOXL2的干擾病毒和過表達病毒購自吉瑪公司(上海)。細胞鋪6孔板過夜后,加入107(100 μL)病毒懸液過夜后擴增轉(zhuǎn)染的細胞經(jīng)流式篩選(mCherry 熒光)。

    1.2.2 Western blot檢測 使用加有蛋白酶抑制劑(羅氏,美國)RIPA裂解液(Sigma-Aldrich,美國)提取細胞總蛋白,細胞刮收集貼壁細胞,冰上裂解15 min,14 000 r/min,4 ℃離心15 min,棄沉淀,收集上清。BCA法測定濃度,100 ℃變性 10 min。經(jīng)SDS-PAGE轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,分別加入GAPHD一抗(1:10 000,三 鷹)、LOXL2(1:2 000,Abcam)、VEGFA (1:2 000,Abcam)4 ℃封閉過夜,PBST漂洗10 min× 3次,加入二抗(1:4 000,Abcam)室溫孵育2 h,PBST漂洗10 min×3次。ECL發(fā)光顯影成像。

    1.2.3 實時定量PCR(qRT-PCR)檢測 總RNA提取根據(jù)Eastep Super試劑盒方案進行(Promega,USA)。在CFX96實時定量儀器(Bio-Rad,美國)中使用SYBR試劑(Takara,日本)進行實時定量PCR。實驗重復(fù)3次。LOXL2正 向 引 物:5'-TCC TCA ATG CGG AGA TGG TG-3',反 向 引 物:5'-CTG TGA CAG TCG TGC CAG AT-3';VEGFA正 向 引 物:5'-GGG CAG AAT CAT CAC GAA GT-3',反向引物:5'-TGG TGA TGT TGG ACT CCT CA-3';GAPDH正向引物:5'-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3',反向引物:5'-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3'。

    1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 將膽管癌細胞接種于6孔板中,過夜后在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,收集條件培養(yǎng)基,根據(jù)VEGFA ELISA試劑盒(Abebio,美國)方案進行。

    1.2.5 血管形成檢測 將基質(zhì)膠加入到24孔板中,含有1x105個HUVECs的條件培養(yǎng)基500 μL加入到每孔中,培養(yǎng)箱中孵育8 h。倒置顯微鏡觀察形成的血管數(shù)并拍照(100倍),每個樣品隨機選取3個不同的視野拍照,用ImageJ軟件計算形成的血管數(shù),并比較各組之間的差異。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

    實驗結(jié)果均采用IBM SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。連續(xù)性變量采用雙尾t檢驗。LOXL2和VEGFA之間的相關(guān)性分析采用線性回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 LOXL2在人膽管癌組織中的表達

    通過下載GEO數(shù)據(jù),進行分析膽管癌和癌旁LOXL2的表達關(guān)系,在GSE76297和GSE107943數(shù)據(jù)庫中分析發(fā)現(xiàn),LOXL2在膽管癌組織中明顯高于癌旁組織(均P<0.0001)。并且在成對的癌和癌旁樣本中,癌組織中的LOXL2也明顯高于癌旁組織(均P<0.0001)(圖1)。

    2.2 GSEA分析

    下載GSE76297數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù),通過GSEA分析LOXL2參與血管形成相關(guān)的基因集,發(fā)現(xiàn)LOXL2參與兩個血管形成的基因集(NES=1.583,名義P=0.012;NES=1.632,名義P=0.002)(圖2)。

    2.3 LOXL2的表達與VEGFA表達相關(guān)性分析

    通過GSE26566、GSE76297、GSE89749和GSE107943數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),LOXL2的表達與VEGFA的表達正相關(guān)(r=0.320、0.243、0.234、0.665,均P<0.05)(圖3)。

    圖1 LOXL2在膽管癌和癌旁組織中的表達 Figure1 Expressions of LOXL2 in CCA and tumor adjacent tissues

    圖2 GSE76297數(shù)據(jù)的GSEA分析Figure2 GSEA analysis using GSE76297 data

    圖3 在GEO數(shù)據(jù)中LOXL2和VEGFA的表達關(guān)系Figure3 Correlation between LOXL2 and VEGFA in GEO datasets

    2.4 干預(yù)LOXL2后VEGFA的表達的變化

    分析GEO數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)LOXL2與VEGFA的正相關(guān),故推測LOXL2可能調(diào)控VEGFA的表達,筆者前期的研究表明LOXL2蛋白在QBC939比RBE細胞要高[7]。因此選擇了在QBC939細胞轉(zhuǎn)染干擾LOXL2病毒,RBE細胞轉(zhuǎn)染過表達LOXL2病毒,為了提高轉(zhuǎn)染效率,過表達和干擾的細胞經(jīng)過流式篩選,熒光顯微鏡觀察過表達和干擾的細胞熒光(圖4)。通過Western blot和RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)在QBC939細胞干擾LOXL2后,VEGFA的蛋白和mRNA表達明顯下調(diào)(均P<0.01),在RBE細胞過表達LOXL2后,VEGFA的蛋白和mRNA表達明顯上調(diào)(均P<0.01)(圖5)。

    2.5 干預(yù)LOXL2后膽管癌細胞VEGFA的分泌水平

    進一步通過ELISA實驗檢測干預(yù)LOXL2后對VEGFA的分泌影響,發(fā)現(xiàn)在QBC939細胞干擾LOXL2后,與對照組比較,VEGFA的分泌水平明顯減少(P<0.01),而在RBE細胞過表達LOXL2后,與對照組比較,VEGFA的分泌水平明顯增加(P<0.01)(圖6)。

    圖4 熒光顯微鏡觀察病毒轉(zhuǎn)染的RBE細胞和QBC939(×400)Figure4 RBE and QBC939 cells transfected with the lentivirus observed under fluorescence microscopy (×400)

    圖5 干預(yù)LOXL2后膽管癌細胞VEGFA的表達情況mRNA表達Figure5 VEGFA expressions in CCA cells after LOXL2 interventions

    圖6 干預(yù)LOXL2后膽管癌細胞VEGFA的分泌水平 Figure6 Secretion levels of VEGFA in CCA cells after LOXL2 interwentions

    2.6 干預(yù)LOXL2后對血管形成的影響

    收集膽管癌細胞各處理的條件培養(yǎng)基組進行血管形成實驗,結(jié)果顯示,過表達LOXL2的RBE細胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的HUVECs與對照組比較,管腔形成數(shù)明顯增加(P<0.01),而干擾LOXL2的QBC939細胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的HUVECs與對照組比較,管腔形成數(shù)明顯減少(P<0.01)(圖7)。

    圖7 血管形成實驗結(jié)果 Figure7 Results of the angiogenesis assay

    3 討 論

    血管生成在人類生殖、器官形成、傷口愈合以及組織修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用,同樣在各種疾病如腫瘤進展中也起著關(guān)鍵角色[8]。目前血管生成已經(jīng)成為惡性腫瘤公認的標志之一,腫瘤的血管通過提供營養(yǎng)和氧來維持腫瘤的侵襲性生長和轉(zhuǎn)移[9]。多種生長因子通過不同的機制激活血管生成,其中VEGFA是最主要的生長因子,激活信號通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖和遷移,促進內(nèi)皮細胞出芽以及管腔形成[10-11]。盡管目前抗血管生成藥物已用于臨床,但是在治療膽管癌方面作用有限以及臨床副作用多[12],因此有必要深入理解膽管癌血管生成的分子機制。本研究通過數(shù)據(jù)庫分析及細胞水平驗證,LOXL2通過上調(diào)VEGFA促進膽管癌血管生成,從而促進膽管癌的進展。

    LOXL2是賴氨酰氧化酶家族5個成員(LOX、LOXL1、LOXL2、LOXL3、LOXL4)中的一員。賴氨酰氧化酶家族蛋白失調(diào)與纖維結(jié)締組織疾病、心血管疾病以及腫瘤密切相關(guān)[13]。LOXL2在各種腫瘤中高表達,參與了腫瘤的進展過程,包括乳腺癌、肺癌[5,14]。筆者先前的研究[7]通過免疫組化發(fā)現(xiàn)LOXL2蛋白水平在膽管癌組織高表達,參與了膽管癌的進展,減少了患者的總體生存率以及無病進展期生存率。在GEO數(shù)據(jù)庫分析,進一步證實了LOXL2的mRNA水平在膽管癌組織高表達。LOXL2通過不同的作用機制促進了腫瘤的進展。LOXL2可被腫瘤細胞分泌到細胞外,發(fā)揮的主要功能是催化細胞外基質(zhì)膠原蛋白和彈性蛋白的交聯(lián)及硬化[15],細胞外基質(zhì)的改變不僅為腫瘤細胞的生存和遷移提供了良好的微環(huán)境,還可以通過整合素等信號通路促進了腫瘤細胞的遷移和轉(zhuǎn)移[16]。細胞內(nèi)的LOXL2發(fā)揮的作用表現(xiàn)在兩方面,一方面在核內(nèi)與一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而促進腫瘤的進展[17-18],另一方面還參與了一些信號通路的激活[19]。

    Zaffryar-Eilot等[20]使用LOXL2單克隆抗體(AB0023)抑制了卵巢癌、肺癌以及乳腺癌的血管形成。同時Wang等[21]發(fā)現(xiàn)在肝細胞肝癌HIF-1α誘導(dǎo)血管形成是經(jīng)過LOXL2介導(dǎo)形成。但是LOXL2誘導(dǎo)血管形成的機制還不是很清楚,本研究通過GSEA分析發(fā)現(xiàn) LOXL2也可能參與了膽管癌的血管形成。由于VEGFA在血管形成中起主要作用,本研究隨后在GEO數(shù)據(jù)庫分析LOXL2與VEGFA的表達關(guān)系,發(fā)現(xiàn)兩者的表達在多個樣本庫中密切相關(guān),在體外實驗,通過干預(yù)LOXL2觀察對VEGFA的表達影響,證實LOXL2能夠調(diào)節(jié)VEGFA的表達和分泌,并且影響血管形成。最新研究表面,LOXL2在肝、肺、腎[22]以及心臟纖維化的過程中起主要作用,并且LOXL2單克隆抗體在動物實驗?zāi)軌蛞种聘卫w維化[23-25]。因此LOXL2可能成為膽管癌治療的一個新靶標。

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),LOXL2在膽管癌中高表達,通過上調(diào)VEGFA促進了腫瘤的血管形成,為LOXL2成為膽管癌治療的靶點提供理論依據(jù)。

    猜你喜歡
    膽管癌胞外基質(zhì)培養(yǎng)基
    肝臟里的膽管癌
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:49:00
    脫細胞外基質(zhì)制備與應(yīng)用的研究現(xiàn)狀
    B7-H4在肝內(nèi)膽管癌的表達及臨床意義
    關(guān)于經(jīng)絡(luò)是一種細胞外基質(zhì)通道的假說
    CT及MRI對肝內(nèi)周圍型膽管癌綜合診斷研究
    蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選
    各種培養(yǎng)基制作應(yīng)注意的幾個事項
    KBM581培養(yǎng)基:人T細胞誘導(dǎo)與擴增培養(yǎng)基應(yīng)用指南
    CXCL12在膽管癌組織中的表達及意義
    水螅細胞外基質(zhì)及其在發(fā)生和再生中的作用
    日韩不卡一区二区三区视频在线| 日产精品乱码卡一卡2卡三| av国产精品久久久久影院| 亚洲国产精品一区三区| 久久青草综合色| av电影中文网址| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 男人舔女人的私密视频| 国产精品久久久久久久久免| 成年av动漫网址| 另类亚洲欧美激情| 人妻一区二区av| 香蕉丝袜av| 国产精品成人在线| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 中文欧美无线码| 日本黄大片高清| 男女下面插进去视频免费观看 | 人人澡人人妻人| 亚洲 欧美一区二区三区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲国产最新在线播放| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 大话2 男鬼变身卡| 国产永久视频网站| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 伦理电影大哥的女人| 国产精品成人在线| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美3d第一页| av有码第一页| 亚洲av.av天堂| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久久久久久国产电影| 伦理电影大哥的女人| 看非洲黑人一级黄片| 免费观看性生交大片5| 丰满饥渴人妻一区二区三| 少妇的逼水好多| 精品熟女少妇av免费看| 国产精品一国产av| 国产麻豆69| 又大又黄又爽视频免费| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲综合色网址| 人人澡人人妻人| 最近手机中文字幕大全| 欧美精品亚洲一区二区| 如何舔出高潮| 国产色爽女视频免费观看| 久久这里有精品视频免费| av有码第一页| 国产精品 国内视频| 国产麻豆69| videossex国产| 久久精品国产a三级三级三级| av有码第一页| xxx大片免费视频| 精品一区二区三区视频在线| 国产精品人妻久久久久久| 婷婷色麻豆天堂久久| 精品一区在线观看国产| 亚洲精品一区蜜桃| 女人久久www免费人成看片| 中文字幕人妻熟女乱码| 最近手机中文字幕大全| 精品视频人人做人人爽| 视频在线观看一区二区三区| 久久99热这里只频精品6学生| 婷婷成人精品国产| 亚洲人成77777在线视频| 国产麻豆69| 午夜老司机福利剧场| 亚洲伊人色综图| 久久久久久久久久人人人人人人| 最近最新中文字幕免费大全7| 咕卡用的链子| 精品一品国产午夜福利视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 自线自在国产av| 国产精品一区二区在线观看99| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 99久久综合免费| 国产乱人偷精品视频| 日本免费在线观看一区| 一级毛片电影观看| 中文字幕免费在线视频6| videosex国产| 国产男人的电影天堂91| 三级国产精品片| 亚洲性久久影院| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 久久久精品免费免费高清| 蜜臀久久99精品久久宅男| 精品第一国产精品| 欧美成人午夜免费资源| 高清黄色对白视频在线免费看| 日韩av免费高清视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | av免费观看日本| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日日啪夜夜爽| 久久免费观看电影| 久久97久久精品| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲精品aⅴ在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 另类精品久久| 亚洲人成77777在线视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产黄色视频一区二区在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 成人国产麻豆网| 咕卡用的链子| 国产精品国产av在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 99九九在线精品视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 一区二区三区精品91| 观看美女的网站| 老熟女久久久| 国产黄色免费在线视频| 嫩草影院入口| 久久久精品免费免费高清| 日本av免费视频播放| 毛片一级片免费看久久久久| 国产午夜精品一二区理论片| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 五月天丁香电影| 亚洲人成网站在线观看播放| 91aial.com中文字幕在线观看| 国精品久久久久久国模美| 新久久久久国产一级毛片| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲国产精品一区三区| 国产爽快片一区二区三区| 久久国产精品大桥未久av| 日韩中文字幕视频在线看片| 妹子高潮喷水视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产精品免费大片| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产永久视频网站| 99久久综合免费| 成人综合一区亚洲| 日本午夜av视频| 久久午夜福利片| 久久久久久久亚洲中文字幕| 街头女战士在线观看网站| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日本91视频免费播放| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 天堂8中文在线网| 丝瓜视频免费看黄片| 满18在线观看网站| 视频中文字幕在线观看| 午夜影院在线不卡| 观看av在线不卡| 精品久久久精品久久久| 日韩成人伦理影院| 中国三级夫妇交换| 国产精品久久久久久精品古装| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久久精品94久久精品| 97在线人人人人妻| 久久99精品国语久久久| 午夜福利影视在线免费观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产一区二区在线观看av| 在现免费观看毛片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产精品人妻久久久影院| 51国产日韩欧美| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美精品国产亚洲| 成年av动漫网址| 欧美精品一区二区大全| 9191精品国产免费久久| 熟女av电影| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲国产精品国产精品| 国产 一区精品| av电影中文网址| 亚洲精品一二三| 少妇人妻 视频| 熟女人妻精品中文字幕| 成人亚洲欧美一区二区av| 有码 亚洲区| 18禁观看日本| 91国产中文字幕| 精品国产国语对白av| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 国产片内射在线| 免费黄网站久久成人精品| 欧美精品一区二区大全| 美国免费a级毛片| 尾随美女入室| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 毛片一级片免费看久久久久| 国产精品人妻久久久影院| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 岛国毛片在线播放| 久久ye,这里只有精品| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产极品天堂在线| 日韩免费高清中文字幕av| 97超碰精品成人国产| 精品国产一区二区久久| 在线观看www视频免费| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 精品视频人人做人人爽| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产高清不卡午夜福利| 精品少妇久久久久久888优播| 国产一区有黄有色的免费视频| 免费观看a级毛片全部| 日本欧美国产在线视频| 90打野战视频偷拍视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产日韩欧美在线精品| 国产成人91sexporn| 丰满饥渴人妻一区二区三| 成年美女黄网站色视频大全免费| 美女内射精品一级片tv| 日韩在线高清观看一区二区三区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 午夜福利,免费看| 99久久中文字幕三级久久日本| 韩国高清视频一区二区三区| 精品福利永久在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 国产精品一区二区在线观看99| 制服人妻中文乱码| 赤兔流量卡办理| 五月伊人婷婷丁香| 麻豆乱淫一区二区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 色视频在线一区二区三区| 亚洲第一av免费看| 国产成人91sexporn| 婷婷色av中文字幕| 22中文网久久字幕| 亚洲四区av| 五月开心婷婷网| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 日日啪夜夜爽| 草草在线视频免费看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产综合精华液| 午夜福利乱码中文字幕| 桃花免费在线播放| 久久久久久人妻| 丝袜人妻中文字幕| 黄色视频在线播放观看不卡| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 黄色毛片三级朝国网站| 久久久久精品人妻al黑| 在线观看国产h片| 国产高清三级在线| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 男的添女的下面高潮视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 欧美激情 高清一区二区三区| 午夜激情久久久久久久| 老女人水多毛片| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产精品蜜桃在线观看| 日本色播在线视频| 久久久精品区二区三区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 欧美xxxx性猛交bbbb| 精品国产露脸久久av麻豆| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲,欧美精品.| 啦啦啦在线观看免费高清www| 久久精品国产a三级三级三级| 日本与韩国留学比较| 成年人午夜在线观看视频| 最近中文字幕2019免费版| 黄色怎么调成土黄色| 久久久精品免费免费高清| 日韩中文字幕视频在线看片| 欧美精品高潮呻吟av久久| 精品国产乱码久久久久久小说| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲国产色片| 亚洲av欧美aⅴ国产| 最后的刺客免费高清国语| 岛国毛片在线播放| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美激情国产日韩精品一区| 多毛熟女@视频| 伊人久久国产一区二区| 亚洲伊人久久精品综合| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日韩制服骚丝袜av| 久久久久久人妻| 一区在线观看完整版| 少妇熟女欧美另类| 免费高清在线观看视频在线观看| 免费黄色在线免费观看| freevideosex欧美| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 中文天堂在线官网| 日韩 亚洲 欧美在线| 成年美女黄网站色视频大全免费| 日本欧美国产在线视频| 在线看a的网站| 大片免费播放器 马上看| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 最近中文字幕2019免费版| 在线观看免费高清a一片| 免费大片黄手机在线观看| 色视频在线一区二区三区| 亚洲,欧美精品.| 欧美精品av麻豆av| 国产伦理片在线播放av一区| 夫妻午夜视频| 另类亚洲欧美激情| 伦理电影免费视频| 18+在线观看网站| 国产激情久久老熟女| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日韩制服骚丝袜av| 丝瓜视频免费看黄片| 美女主播在线视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美日韩视频精品一区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 制服诱惑二区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久精品国产自在天天线| 亚洲精品中文字幕在线视频| 99香蕉大伊视频| 蜜桃国产av成人99| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久久久久久大尺度免费视频| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲av综合色区一区| 只有这里有精品99| 国产精品久久久久久久久免| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 日韩精品有码人妻一区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产麻豆69| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲国产av新网站| av在线老鸭窝| 日韩av免费高清视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 欧美国产精品一级二级三级| a级片在线免费高清观看视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产午夜精品一二区理论片| 久久久久人妻精品一区果冻| 午夜福利,免费看| 免费大片18禁| av有码第一页| 精品久久久精品久久久| 满18在线观看网站| 一二三四在线观看免费中文在 | 我要看黄色一级片免费的| 国产av码专区亚洲av| 丰满少妇做爰视频| 亚洲av日韩在线播放| 免费日韩欧美在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 97人妻天天添夜夜摸| 1024视频免费在线观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久人人爽人人片av| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久久久久人人人人人| 一区二区av电影网| 亚洲欧美色中文字幕在线| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 成年女人在线观看亚洲视频| 男女国产视频网站| 国产探花极品一区二区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产有黄有色有爽视频| 老司机影院成人| 午夜福利网站1000一区二区三区| 欧美精品亚洲一区二区| 两性夫妻黄色片 | 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 欧美成人午夜精品| 国产一区二区在线观看日韩| 乱人伦中国视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久久国产一区二区| av视频免费观看在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久 成人 亚洲| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一区二区三区乱码不卡18| 免费观看av网站的网址| 久久精品夜色国产| 欧美精品一区二区免费开放| av线在线观看网站| 黑人高潮一二区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 最近手机中文字幕大全| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲精品第二区| 两性夫妻黄色片 | 中文欧美无线码| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 少妇精品久久久久久久| 精品一区在线观看国产| 黄色配什么色好看| av电影中文网址| 欧美精品一区二区大全| 妹子高潮喷水视频| 亚洲国产精品专区欧美| 秋霞伦理黄片| 精品少妇久久久久久888优播| 久久久国产精品麻豆| 最后的刺客免费高清国语| 男女下面插进去视频免费观看 | 日韩制服骚丝袜av| 免费人成在线观看视频色| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 欧美老熟妇乱子伦牲交| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产精品.久久久| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 18禁观看日本| 五月玫瑰六月丁香| 久久av网站| 国产精品久久久久久av不卡| 久久99一区二区三区| 国产成人aa在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 性色av一级| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 乱码一卡2卡4卡精品| 夫妻午夜视频| 九草在线视频观看| 婷婷色综合www| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 午夜精品国产一区二区电影| 777米奇影视久久| 国产午夜精品一二区理论片| 国产免费视频播放在线视频| 国产成人精品无人区| 性色av一级| www.色视频.com| h视频一区二区三区| 视频中文字幕在线观看| 在线天堂最新版资源| 亚洲人与动物交配视频| 99热国产这里只有精品6| 精品亚洲成国产av| 免费av中文字幕在线| 久久久久国产网址| 一本大道久久a久久精品| 美女大奶头黄色视频| 丝袜在线中文字幕| 色吧在线观看| av视频免费观看在线观看| 国产av国产精品国产| 免费观看在线日韩| 久久精品久久久久久久性| www.色视频.com| 久热这里只有精品99| 天堂8中文在线网| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲人与动物交配视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 精品一品国产午夜福利视频| 一区二区三区四区激情视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 热re99久久精品国产66热6| 又大又黄又爽视频免费| 在线观看免费视频网站a站| 在线观看美女被高潮喷水网站| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 一二三四在线观看免费中文在 | 国产69精品久久久久777片| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 在线观看免费视频网站a站| 日本爱情动作片www.在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 热re99久久精品国产66热6| 桃花免费在线播放| 亚洲,欧美精品.| 最后的刺客免费高清国语| 这个男人来自地球电影免费观看 | 热re99久久精品国产66热6| 桃花免费在线播放| 久久av网站| 午夜福利影视在线免费观看| 国产黄频视频在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 免费观看在线日韩| 欧美亚洲日本最大视频资源| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久毛片免费看一区二区三区| 热re99久久国产66热| a级毛片在线看网站| 飞空精品影院首页| 人妻人人澡人人爽人人| h视频一区二区三区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 男女午夜视频在线观看 | 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲,欧美精品.| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 赤兔流量卡办理| 黄色怎么调成土黄色| 大陆偷拍与自拍| 好男人视频免费观看在线| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 成人无遮挡网站| 最近中文字幕2019免费版| 国产在视频线精品| 天堂中文最新版在线下载| 下体分泌物呈黄色| 2022亚洲国产成人精品| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 欧美3d第一页| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产日韩欧美视频二区| 中文欧美无线码| 飞空精品影院首页| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 精品亚洲成国产av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 日韩欧美一区视频在线观看| 天堂8中文在线网| 成人亚洲欧美一区二区av| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 日韩av不卡免费在线播放| 性色av一级| 日韩精品有码人妻一区| 丁香六月天网| 国产精品免费大片| 尾随美女入室| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 熟女电影av网| 国产 精品1| 这个男人来自地球电影免费观看 | 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产激情久久老熟女| 深夜精品福利| 国产精品熟女久久久久浪| 精品国产乱码久久久久久小说| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 午夜福利影视在线免费观看| 免费观看a级毛片全部| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美国产精品一级二级三级| 成年女人在线观看亚洲视频| 色94色欧美一区二区| 亚洲成人手机| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 日韩av不卡免费在线播放| 99热全是精品| 国产国语露脸激情在线看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久久久人妻精品一区果冻| 欧美日本中文国产一区发布| 美国免费a级毛片| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 美女视频免费永久观看网站| 26uuu在线亚洲综合色| 久久久久久久亚洲中文字幕| av一本久久久久| 亚洲精品美女久久av网站| 精品国产国语对白av| 亚洲av欧美aⅴ国产| 超碰97精品在线观看| 久久久久久伊人网av| 人妻 亚洲 视频| av国产精品久久久久影院| 熟女电影av网| 97精品久久久久久久久久精品| 精品国产乱码久久久久久小说| 午夜影院在线不卡| 亚洲情色 制服丝袜| 色网站视频免费|