刺山柑體外抗腫瘤活性提取物的篩選研究

買(mǎi)地哪木·色迪克，周彥霞，周曉濤，王 梅（.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 800；新疆醫(yī)科大學(xué)研究生院，新疆 烏魯木齊 800；新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 800）

刺山柑（capparis spinosa L.）為山柑科山柑屬藤本植物，又名老鼠瓜、野西瓜，是一種中草藥[1]。主要分布于中東地區(qū)和地中海國(guó)家，在我國(guó)主要分布于新疆、甘肅、西藏等地區(qū)[2]。刺山柑是干旱區(qū)特有植物，抗旱、耐高溫、耐風(fēng)蝕、耐貧瘠，是研究植物抗逆性不可多得的材料[3]。刺山柑含有揮發(fā)油、生物堿類(lèi)、類(lèi)黃酮類(lèi)、萜類(lèi)以及芥子油甙等化學(xué)成分[4]，其葉、果、根皮均可入藥，味辛苦，性溫，具有祛風(fēng)、除濕、通鼻竅、祛瘀止痛活血之功效，在新疆作為一種民族醫(yī)藥而被廣泛應(yīng)用[5]?，F(xiàn)代藥理研究表明刺山柑果實(shí)提取物在抗菌、抗炎、抗氧化、抗高血壓[6]、抗腫瘤、降血糖、調(diào)血酯、利尿、治療痛風(fēng)和風(fēng)濕[7-8]等方面均有一定的功效。有多名國(guó)外學(xué)者報(bào)道了刺山柑對(duì)肺癌、卵巢癌、腸癌、乳腺癌和鼻咽癌均有作用[9-12]。本研究以多種腫瘤細(xì)胞為細(xì)胞模型，探討刺山柑的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 藥品

刺山柑果藥材（購(gòu)自安徽省金芙蓉中藥飲片有限公司，批號(hào)：170401，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天藥/生藥教研室鑒定）；甲醇、乙醇、鹽酸等試劑均為分析純；水為重蒸水；人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3、人前列腺癌細(xì)胞PC-3、人肝癌細(xì)胞Hep-G2、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29，均購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；高糖DMEM培養(yǎng)基（規(guī)格：500 mL，批號(hào)：AD19446264，HyClone公司）；FBS（規(guī)格：100 mL，批號(hào)：M048-6，美國(guó)Sciencell公司）；CCK-8（規(guī)格：1 g，批號(hào)：M2128，美國(guó)Sigma公司）；順鉑（cisplatin，DDP，規(guī)格：25 mg，批號(hào)：SJJMI-IE，東京化成工業(yè)株式會(huì)社）。

1.2 儀器與設(shè)備

DC-NSG型實(shí)驗(yàn)型提取濃縮機(jī)組（上海達(dá)成實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；R-2003型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；HWS24型電子恒溫水浴鍋（上海-恒科學(xué)儀器有限公司）；SHZ-95B 型循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；DZF-6051 型真空干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；BSA124S型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；3111 型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）；DMIL 型倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；CJ-1F型醫(yī)用凈化工作臺(tái)（蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司）；MR-96A型酶標(biāo)儀（深圳邁瑞公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取 取刺山柑干燥果實(shí)5 kg，粉碎成粗粉，裝袋，加入8 倍量85%乙醇回流提取2 次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮（50 ℃），減壓干燥（50 ℃）成乙醇總提取物。取乙醇總提取物800 g，用1 L水溶解后，分別用等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取3次，所得萃取液合并后，減壓濃縮并干燥，得石油醚提取物、氯仿提取物和乙酸乙酯提取物。剩余的水溶液部分減壓濃縮后干燥得水溶性提取物。

1.3.2 細(xì)胞株及培養(yǎng)條件 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3、人前列腺癌細(xì)胞PC-3、人肝癌細(xì)胞Hep-G2、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29，均購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，把DMEM通用培養(yǎng)液配制成含有10%胎牛血清，1%抗生素（100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素）的完全培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)上述六種細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，平均每隔1 ～ 2天更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，用含有0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期備用。

1.3.3 體外抗腫瘤活性測(cè)定 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A549、MCF-7、SK-OV-3、PC-3、Hep-G2、HT-29細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待12 h 細(xì)胞貼壁后，設(shè)置正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照藥（DDP）組、樣品組（5000、1500、500、150、50、15 μg·mL-1），每組5個(gè)復(fù)孔。正常對(duì)照組以完全培養(yǎng)液孵育細(xì)胞，樣品組分別以含終濃度為5000、1500、500、150、50、15 μg·mL-1樣品的完全培養(yǎng)液孵育細(xì)胞，DDP 組分別以含終濃度為100、30、10、3、1、0.3 μmol·L-1樣品的完全培養(yǎng)液孵育細(xì)胞。按上述處理方式孵育細(xì)胞72 h 后在每孔中加入CCK-8 試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后在490 nm 處測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）。以正常對(duì)照組OD值為100%細(xì)胞活力，其余各組OD值與正常對(duì)照組OD值的比值為相對(duì)活力。以相對(duì)活力評(píng)價(jià)樣品對(duì)A549、MCF-7、SK-OV-3、PC-3、Hep-G2、HT-29細(xì)胞的毒性。按下列公式計(jì)算生長(zhǎng)抑制率，采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用Bliss 法計(jì)算IC50。生長(zhǎng)抑制率=（1-用藥組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

2 結(jié)果與分析

刺山柑乙醇總提取物經(jīng)石油醚、氯仿、乙酸乙酯等溶劑萃取，分別得到56.39 g石油醚提取物、141.58 g氯仿提取物和100.76 g乙酸乙酯提取物。細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果表明，刺山柑五個(gè)提取物對(duì)六種人腫瘤細(xì)胞具有不同程度的抑制作用，由表1 可知，不同濃度的刺山柑提取物對(duì)六種人腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均隨含藥量的升高而升高，即呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。由表2 可知，刺山柑各有效提取物對(duì)六種人腫瘤細(xì)胞的體外半數(shù)抑制濃度IC50值在350.503 ～ 1 470.614 μg·mL-1，其中石油醚提取物對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3的IC50值最小，即為350.503 μg·mL-1，其對(duì)應(yīng)的抑制率為95.801%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，石油醚提取物對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3的IC50值最小，即抑制效果最佳。

3 討論

刺山柑作為常見(jiàn)的藥用植物之一，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌、抗氧化、降血糖、抗肝毒、抗腫瘤等多種藥理作用[13]。研究表明，刺山柑果實(shí)中油酸的含量達(dá)到42.93%，油酸可降低血液總膽固醇和有害膽固醇，減少其在血管上的沉積，有預(yù)防動(dòng)脈硬化等作用，卻不降低有益膽固醇，對(duì)心血管疾病和癌癥等都有預(yù)防作用[14]。

表1 刺山柑各有效提取物對(duì)六種人腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率的影響Tab 1 Growth inhibition rate of six human tumor cells by different effective parts of capparis spinosa L.

表2 刺山柑各有效提取物對(duì)六種人腫瘤細(xì)胞的IC50值. μg·mL-1Tab 2 IC50 values of various active parts of capparis spinosa L. on six human tumor cells. μg·mL-1

目前，對(duì)刺山柑抗腫瘤活性的研究較少，近幾年有關(guān)刺山柑的研究主要集中在藥理作用和化學(xué)成分的研究，關(guān)于刺山柑抗腫瘤活性的藥效學(xué)研究并不明確。在本研究中，采用抗腫瘤藥物篩選常用的CCK-8法，以DDP 為陽(yáng)性對(duì)照，基于常見(jiàn)的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3、人前列腺癌細(xì)胞PC-3、人肝癌細(xì)胞Hep-G2和人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29這六種人腫瘤細(xì)胞，考察刺山柑石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、水提物和醇提物的抗腫瘤活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺山柑的五個(gè)有效提取物對(duì)六種人腫瘤細(xì)胞均有生長(zhǎng)抑制作用。其中以石油醚提取物對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3 抑制作用最強(qiáng)，其對(duì)應(yīng)的IC50值和最大抑制率分別為350.503 μg·mL-1和95.801%。本研究評(píng)價(jià)了刺山柑不同提取物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的活性，成功篩選出了活性最強(qiáng)的提取物，為今后刺山柑抗腫瘤活性研究提供了理論參考。然而，有關(guān)刺山柑抗腫瘤的藥效成分物質(zhì)基礎(chǔ)、抗癌機(jī)理等方面仍有待進(jìn)一步的研究。