苦參素膠囊對小鼠急性酒精性肝損傷的影響

方 慧，魯長俊，呂 悅，鄭珊嬌，俞婷婷，王 寅，鄭 英（.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇三醫(yī)院，浙江 杭州 3003；.河南省直第三人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

酒精性肝病是影響人類健康的重要問題，短時間內(nèi)乙醇的大量攝入可導(dǎo)致肝臟發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷，即急性酒精性肝損傷（alcoholic liver disease，ALD）。目前對于急性酒精性肝病治療沒有特效的藥物，因此，加強(qiáng)對酒精性肝病病因的研究和防治是當(dāng)前面臨的重要課題。苦參素膠囊的主要成分是氧化苦參堿，具有廣泛的生物活性?，F(xiàn)代藥理研究[1]表明氧化苦參堿在穩(wěn)定肝細(xì)胞膜、促進(jìn)受損肝細(xì)胞的修復(fù)方面有一定的作用，同時還具有改善肝臟微循環(huán)、促使膽紅素排泄、抑制肝臟細(xì)胞纖維化因子釋放等作用。苦參素膠囊主要用于治療慢性乙型病毒性肝炎，在治療酒精性肝損傷方面研究報道較少，因此本課題就苦參素膠囊對急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用進(jìn)行研究，初步探討其可能的機(jī)制，進(jìn)一步挖掘苦參素膠囊的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

ICR 雄性小鼠72 只，體質(zhì)量25 ～ 30 g，由浙江省動物醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，動物合格證號：SCXK（浙）20080033。

1.2 藥物及其配制

受試藥：苦參素膠囊（江蘇正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，規(guī)格：0.1 g，批號：140927302），用蒸餾水配制成濃度為0.03 g·mL-1的藥液，4 ℃冷藏保存。

陽性藥：聯(lián)苯雙酯滴丸（浙江萬邦藥業(yè)有限公司，規(guī)格：1.5 mg，批號：A02141125），用蒸餾水配制成濃度為0.375 mg·mL-1的藥液，4 ℃冷藏保存。

造模劑：55 度北京紅星二鍋頭（北京紅星股份有限公司，規(guī)格：500 mL，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號：GB/T20822），4 ℃冷藏保存。

1.3 試劑與儀器

試劑：考馬斯亮藍(lán)、丙二醛（MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，規(guī)格：100T/96 樣；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、甘油三酯（TG）試劑盒均購自杭州唐榮科技有限公司。

儀器：東芝ACCUTETBA-40FR 全自動生化分析儀（東芝三廠醫(yī)療株式會社）；XHF-b 高速分散器 （寧波新芝生物科技股份有限公司）；LXJ-IIB 低速大容量多管離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠制造）；LQA10002 電子天平（杭州友恒稱重設(shè)備有限公司）；Power Wave340酶標(biāo)儀（美國Bio-TEK公司）；Thermo離心機(jī)。

1.4 動物分組及處理

健康ICR雄性小鼠72只，隨機(jī)分為正常組、模型組、聯(lián)苯雙酯滴丸組（陽性組）、苦參素低劑量組、苦參素中劑量組、苦參素高劑量組，共6組，每組12只。正常組給予蒸餾水，體積為0.1 mL·10 g-1體重。除正常組外，其余各組動物均參照成人10 倍量灌胃給予55度二鍋頭，每日灌胃兩次，間隔12 h；造模同時，灌胃給予各受試藥，連續(xù)7 d。

1.5 樣品采集與指標(biāo)檢測

末次給藥后禁食不禁水，12 h后稱體重，摘眼球取血，靜置，離心（3500 r·min-1，10 min）得血清，全自動生化分析儀測定ALT、AST、TC、TG、ALP含量。迅速取出肝臟，稱量肝濕重，計算肝臟系數(shù)（肝臟系數(shù)=肝臟重量/體重×100%）。準(zhǔn)確稱取肝臟0.5 g，用生理鹽水制作成10%的肝勻漿液，靜置，離心（3500 r·min-1，10 min）取上清液，采用相關(guān)試劑盒檢測SOD活性及MDA的含量，具體操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理方法

2 結(jié)果

2.1 一般行為學(xué)觀察

實驗過程中，正常組小鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤，食欲佳，動作自如，反應(yīng)靈敏，無嗜睡現(xiàn)象，排便正常。模型組小鼠均有不同程度的精神萎靡，毛發(fā)無光澤，嗜睡，食欲減退，反應(yīng)遲緩，體重增長緩慢，出現(xiàn)稀便現(xiàn)象?？鄥⑺馗鲃┝拷M小鼠精神狀態(tài)與飲食、體重等情況均較模型組有所改善。

2.2 對急性酒精性肝損傷小鼠體重的影響

表1 顯示，與正常組小鼠比較，模型組小鼠體重從第4天開始逐漸下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組相比，苦參素各劑量組小鼠體重均有所改善。

2.3 對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響

表2 顯示，與正常組比較，模型組小鼠肝臟系數(shù)顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01），表明酒精能導(dǎo)致小鼠肝臟腫大。與模型組比較，苦參素各劑量組均能降低小鼠的肝臟系數(shù)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。表明苦參素膠囊可以緩解急性酒精性肝損傷小鼠的肝臟腫大。

2.4 對急性酒精性肝損傷小鼠血清中ALT、AST活性的影響

表3 顯示，與正常組比較，模型組小鼠血清中ALT，AST顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。與模型組比較，苦參素各劑量組均能降低血清中ALT、AST活性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01）。表明苦參素膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠ALT、AST活性具有一定的改善作用。

表1 對急性酒精性肝損傷小鼠體重的影響. g, x ± s , n = 12Tab 1 Effect of body weight of marine capsule on acute alcoholic liver injury. g, n = 12

表1 對急性酒精性肝損傷小鼠體重的影響. g, x ± s , n = 12Tab 1 Effect of body weight of marine capsule on acute alcoholic liver injury. g, n = 12

注：與正常組相比，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01；與模型組相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01Note: compared with normal group, △P ＜ 0.05, △△P ＜ 0.01； compared with model group, *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天 第8天正常組 26.03±1.98 25.84±1.84 25.73±1.83 26.06±1.86 26.43±2.20 27.43±1.93 27.32±1.89 28.46±2.03模型組 27.21±2.27 25.38±2.20 24.43±3.00 21.73±2.75△ 19.54±6.11△△ 20.75±3.00△△21.30±2.82△△21.47±2.73△△陽性組 26.60±1.61 25.61±2.21 24.01±2.44 22.20±2.89* 22.77±3.56* 22.52±3.46* 22.09±3.35** 22.56±3.59*苦參素低劑量組 26.69±1.63 25.31±1.70 24.46±2.07 23.62±2.82 23.55±2.92 22.59±2.16 22.19±2.35 22.57±1.66苦參素中劑量組 26.57±1.63 24.63±1.88 23.28±2.38 23.87±2.52 24.82±2.45 24.17±2.84 23.93±1.95 23.94±1.94苦參素高劑量組 26.96±1.60 24.99±1.97 24.08±2.56 23.60±3.02 23.14±3.31 22.99±3.33 22.44±3.53 22.65±3.79

表2 對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響. , n = 12 Tab 2 Effect of liver index of marine capsule on acute lcoholic liver injury. n = 12

表2 對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響. , n = 12 Tab 2 Effect of liver index of marine capsule on acute lcoholic liver injury. n = 12

注：與正常組相比，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01；與模型組相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01Note: compared with normal group, △P ＜ 0.05, △△P ＜ 0.01； compared with model group, *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01

組別 劑量/g·kg-1 體質(zhì)量/g 肝重/g 肝臟系數(shù)/%正常組 - 26.85±1.05 1.15±0.14 4.276±0.570模型組 - 19.94±2.45 0.99±0.27 4.916±0.866△△陽性組 3.75×10-3 21.28±2.71 0.93±0.16 4.333±0.482*苦參素低劑量組3.75×10-2 20.54±1.33 0.90±0.11 4.384±0.301*苦參素中劑量組0.075 22.43±2.22 1.05±0.17 4.671±0.464*苦參素高劑量組0.150 20.99±3.69 0.91±0.22 4.298±0.533*

表3 對急性酒精性肝損傷小鼠血清ALT與AST活性的影響. n = 12Tab 3 Effect of ALT, AST levels in serum of marine capsules on acute alcoholic liver injury. n = 12

2.5 對急性酒精性肝損傷小鼠血清中TC、TG水平的影響

表4 顯示，與正常組比較，模型組小鼠血清中TC、TG 顯著性升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。與模型組比較，苦參素各劑量組均能降低血清中TG 水平，中劑量組和高劑量組能降低TC 水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）；苦參素低劑量組具有降低TC水平的趨勢。表明苦參素膠囊可以降低急性酒精性肝損傷小鼠血清中TC、TG水平。

2.6 對急性酒精性肝損傷小鼠血清中ALP、LDH活性的影響

表5 顯示，與正常組比較，模型組小鼠血清中ALP、LDH 活性顯著性升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。與模型組比較，苦參素各劑量組均能降低血清中ALP、LDH水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01）。表明苦參素膠囊可以降低急性酒精性肝損傷小鼠血清中ALP、LDH活性。

表4 對急性酒精性肝損傷小鼠血清中TC、TG水平的影響. n = 12Tab 4 Effect of TC, TG levels in serum of marine capsule on acute alcoholic liver injury. n = 12

表5 對急性酒精性肝損傷小鼠血清中ALP與LDH活性的影響. n = 12Tab 5 Effect of ALP, LDH levels in serum of marine capsules on acute alcoholic liver injury. n = 12

2.7 對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織中SOD、MDA含量的影響

表6 顯示，模型組小鼠肝組織MDA 含量較正常組顯著升高，SOD活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。與模型組比較，苦參素各劑量組均能顯著降低小鼠肝組織中MDA 含量，中、高劑量組明顯提高SOD 活性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。表明苦參素膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD水平具有不同程度的改善作用。

3 討論

ALD 是由于過量攝入酒精而引起肝臟損害的一系列急、慢性病理性改變導(dǎo)致的疾病。初期通常表現(xiàn)為脂肪肝，進(jìn)而發(fā)展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化及肝硬化，嚴(yán)重酗酒時可誘發(fā)廣泛肝細(xì)胞壞死甚至肝衰竭[2]。致病因素是長期大量酒精的攝入，但其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。文獻(xiàn)[3-4]研究表明，氧化應(yīng)激和氧化應(yīng)激誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化是導(dǎo)致ALD 病理損傷的重要機(jī)制之一，氧化應(yīng)激是指當(dāng)機(jī)體受到有害刺激時，活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）等一些體內(nèi)高活性分子產(chǎn)生過多，超出抗氧化物的清除能力，打破氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間的動態(tài)平衡，從而導(dǎo)致肝臟的損傷。

表6 對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織中SOD與MDA水平的影響. n = 12Tab 6 Effect of SOD, MDA levels in liver tissue of marine capsules on acute alcoholic liver injury. n = 12

臨床上活性酶ALT 和AST 是反映肝細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)，正常情況下，血清中兩種酶只存在于細(xì)胞內(nèi)，血清中很少，活性非常低，當(dāng)肝細(xì)胞病變受損時，肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞膜通透性增加，肝細(xì)胞內(nèi)ALT 和AST 大量釋放入血，導(dǎo)致血清中的ALT 和AST 水平升高[5]。MDA 為機(jī)體脂質(zhì)過氧化的重要終產(chǎn)物，它的增加或減少可反映脂質(zhì)過氧化程度的增加或減少，因此可以通過檢測MDA的含量衡量肝組織過氧化損傷和治療后肝細(xì)胞的恢復(fù)情況[6]。在正常生理狀態(tài)下，肝臟中的抗氧化劑SOD能及時清除氧自由基，使機(jī)體免受氧化損傷，當(dāng)自由基產(chǎn)生過多，超過抗氧化劑的清除能力，使體內(nèi)氧自由基蓄積，損傷肝細(xì)胞，因此SOD 活力的高低可以反映機(jī)體清除氧自由基的能力[7]。

苦參素膠囊的主要成分是氧化苦參堿，可以清除氧自由基，抑制氧自由基的釋放和磷脂酶的活化，穩(wěn)定肝細(xì)胞膜，促進(jìn)受損肝細(xì)胞的修復(fù)，改善肝臟微循環(huán)，抑制肝細(xì)胞纖維化因子的釋放，從而恢復(fù)肝細(xì)胞功能，保護(hù)肝臟[1]。魏紅等[8]在研究苦參堿微乳與苦參素膠囊對小鼠急性肝損傷保護(hù)作用的對比中發(fā)現(xiàn)苦參素膠囊可以使血清中ALT 和AST 水平低于模型組，表明苦參素膠囊對小鼠肝臟具有保護(hù)作用。有研究[9]表明，苦參素可以阻止甚至逆轉(zhuǎn)肝臟的纖維化，從而阻止肝臟的惡性發(fā)展。

實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠血清ALT、AST、ALP、LDH 活性顯著升高，TG、TC 水平顯著增加（P ＜ 0.01），肝組織SOD活性明顯降低（P ＜ 0.05），肝組織MDA 明顯升高（P ＜ 0.05）。以上數(shù)據(jù)表明，急性酒精性肝損傷造模成功。模型組小鼠血清ALT、AST活性明顯升高，表明肝細(xì)胞膜通透性增大，ALP、LDH、TG、TC水平顯著升高，表明肝細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷。而給予苦參素膠囊治療后，小鼠肝臟系數(shù)，血清中ALT、AST、ALP、LDH活性及TG、TC含量顯著降低，說明苦參素膠囊能保護(hù)肝細(xì)胞，穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，對酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用?？鄥⑺啬z囊能顯著抑制酒精性肝損傷小鼠肝組織中MDA含量的升高，SOD活性顯著增強(qiáng)，說明苦參素膠囊通過阻斷脂質(zhì)過氧化，增強(qiáng)小鼠肝臟抗氧化而產(chǎn)生保護(hù)肝臟的作用。

綜上所述，苦參素膠囊對小鼠急性酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與清除自由基抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)，通過增強(qiáng)體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間的動態(tài)平衡，提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而達(dá)到保護(hù)肝細(xì)胞的目的。本研究結(jié)果表明，苦參素膠囊對酒精誘導(dǎo)的急性酒精肝損傷小鼠模型表現(xiàn)出較好的抗損傷作用，提示苦參素膠囊具有廣闊的開發(fā)前景，值得進(jìn)一步深入開發(fā)。