鯡辣椒中益生細(xì)菌的計(jì)數(shù)與分離鑒定及功能研究

王琦　張紫娟　羅艷萍　黃承婷　何溢昕　胡俊升　凌潔玉

摘要為獲得優(yōu)良的益生菌株，在鯡辣椒發(fā)酵過程中對其芽孢桿菌及乳酸菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，其均在第4天達(dá)到最高值。從該時(shí)期共分離得到9株芽孢桿菌與10株乳酸菌，其中蠟樣芽孢桿菌與植物乳桿菌占優(yōu)勢。5株芽孢桿菌對龍蝦殘餌降解研究表明，B1與B18這2株蠟樣芽孢桿菌在48h對殘餌中淀粉降解率都高達(dá)60%以上，對蛋白的降解率達(dá)到50%以上，是凈水的優(yōu)良候選菌株。4株乳酸菌體外抗氧化研究表明，L1乳酸乳球菌乳酸亞種產(chǎn)酸最強(qiáng)，而抗氧化活性也最高，且含有豐富的胞外多糖，可作為發(fā)酵乳制品的候選菌株。

關(guān)鍵詞 鯡辣椒;芽孢桿菌;乳酸菌;分離鑒定;殘餌降解;抗氧化

中圖分類號 S641.3;TS255.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 1007-5739（2019）07-0199-02

鯡辣椒是流行于湖北、湖南、四川等省山區(qū)的一種傳統(tǒng)佐餐食品，它以玉米粉配以新鮮紅辣椒，經(jīng)過15～30d的自然發(fā)酵而制成。隨著旅游業(yè)的發(fā)展，鯡辣椒開始進(jìn)人大眾視野并以其獨(dú)特風(fēng)味受到消費(fèi)者的歡迎。到目前為止，關(guān)于鯡辣椒的研究報(bào)道并不多，已經(jīng)有少量研究表明，其在發(fā)酵過程中的微生物菌群包括乳酸菌、芽孢桿菌醋酸桿菌和酵母菌等"，但是極少進(jìn)一步對這些菌進(jìn)行分離鑒定和益生作用分析。同眾多發(fā)酵食品，鯡辣椒是益生菌的天然來源e，因而本研究對鯡辣椒發(fā)酵過程中的芽孢桿菌和乳酸菌進(jìn)行計(jì)數(shù)和分離鑒定，并且選取代表性菌株對其益生功能進(jìn)行了初步探索，以期獲得優(yōu)良的益生菌株，用于食品以及環(huán)保等領(lǐng)域。

1材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮玉米粉紅辣椒姜蒜、食鹽等鯡辣椒制備原料，均購于正規(guī)超市;龍蝦配合飼料購于湖北濮陽飼料有限公司。

MRS培養(yǎng)基、芽孢桿菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基購于青島海博生物技術(shù)有限公司;rTaq聚合酶dNTP購于TaKaRa公司;DNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司;DPPH、焦性沒食子酸、水楊酸、30%過氧化氫、碘、硝酸鈣、考馬斯亮藍(lán)G-250等化學(xué)試劑購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

引物序列由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成，其中乳酸菌的擴(kuò)增引物為27F（5一AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）與1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）;芽孢桿菌的擴(kuò)增引物為16sF（5'-TGACGAGTGGCGGACGGGTG-3'）與16sR（5'-CCATGGTGTGACGGGCGGTGTG-3'）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1鯡辣椒的制備。按照農(nóng)家常規(guī)做法，將新鮮紅辣椒洗凈切碎，與玉米粉以1：5混勻，加入適量的鹽姜、蒜，裝壇液封，于25C恒溫發(fā)酵16d。

1.2.2益生菌計(jì)數(shù)及分離鑒定在鯡辣椒發(fā)酵過程中，每隔4d取樣分別進(jìn)行芽孢桿菌和乳酸菌計(jì)數(shù)。芽孢桿菌采用專用的芽孢桿菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，379C培養(yǎng)48h;乳酸菌采用MRS瓊脂培養(yǎng)基，37C厭氧培養(yǎng)72h。

對發(fā)酵第4天的計(jì)數(shù)平板，挑取典型菌落，純化2代直至鏡檢形態(tài)一致，挑取單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，并提取其DNA，采用PCR擴(kuò)增其16SrDNA。芽孢桿菌PCR條件為：949C預(yù)變性5min;94C變性30s，65C退火30s，72°C延伸1min，30個(gè)循環(huán);72°C延伸7min。乳酸菌PCR條件為：94C預(yù)變性5min;94C變性1min，53C退火1min，72C延伸1.5min，30個(gè)循環(huán);72C延伸10min。PCR產(chǎn)物送于武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對。

1.2.3芽孢桿菌對殘余餌料降解的研究。將同時(shí)具有淀粉酶活與蛋白酶活的芽孢桿菌，采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基活化2代，以5%接種量接種到模擬龍蝦殘余餌料培養(yǎng)基8（1g龍蝦飼料加人100mL蒸餾水，121C滅菌25min，靜置，過夜后使用），28C振蕩培養(yǎng)，于48、72h取樣，分別測定其淀粉及蛋白質(zhì)的含量，以未接菌的餌料培養(yǎng)基作為對照。淀粉含量測定采用碘顯色法+，蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法[4。

1.2.4乳酸菌的體外抗氧化研究。選擇產(chǎn)酸較強(qiáng)的乳酸菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，活化2代，取其發(fā)酵上清液進(jìn)行抗氧化性研究和胞外多糖提取。羥自由基（·0H）、DPPH自由基（DPPH·）與超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力測定，以吸胞外多糖的提取和測定均參照楊晨璐等的方法。

2結(jié)果與分析

2.1鯡辣椒發(fā)酵過程中芽孢桿菌、乳酸菌數(shù)量變化及分離鑒定

在鯡辣椒發(fā)酵過程中，每隔4d對其芽孢桿菌及乳酸菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。由圖1可知，芽孢桿菌數(shù)量在整個(gè)發(fā)酵期間變化較小，維持在1x104CFU/g左右，在第4天略高。而乳酸菌數(shù)量急劇上升，從初始8x103CFU/g上升到第4天的最高值1.5x10*CFU/g。芽孢桿菌能產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶等多種胞外酶類，將原料中的淀粉、蛋白質(zhì)等分解成更易吸收的小分子糖類、多肽、氨基酸等物質(zhì)，賦予了鯡辣椒更高的營養(yǎng)價(jià)值;而乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，使鯡辣椒具有柔和的酸味，且和其他菌共同作用產(chǎn)生醛酮、醇等物質(zhì)，賦予鯡辣椒獨(dú)特的風(fēng)味"。

已有研究選用發(fā)酵完成的成品對鯡辣椒中乳酸菌進(jìn)行分離鑒定凹，為了更廣泛地挖掘益生菌株，在計(jì)數(shù)結(jié)果最高的4d進(jìn)行芽孢桿菌和乳酸菌的分離鑒定。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定和16SrDNA鑒定，共得到9株芽孢桿菌，其中蠟樣芽孢桿菌最多，其次是解淀粉芽孢桿菌;共得到10株乳酸菌，其中3株乳球菌，7株乳桿菌。由表1可知，在鯡辣椒發(fā)酵前期，蠟樣芽胞桿菌與植物乳桿菌為優(yōu)勢菌群。

2.2芽孢桿菌對龍蝦殘餌降解的影響

產(chǎn)酶平板初篩結(jié)果表明，芽孢桿菌B1、B4、B18、B29、B30均同時(shí)具有較好的淀粉酶和蛋白酶活性。目前，對益生芽孢桿菌產(chǎn)酶的應(yīng)用，集中在將其作為飼料添加劑，以提高動物對飼料的利用率4。但實(shí)際上，這些酶同樣可以作用于殘余飼料，如在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，用于降解殘余餌料，從而降低養(yǎng)殖水體的有機(jī)物污染，目前相關(guān)研究較少B。

小龍蝦是湖北省重點(diǎn)養(yǎng)殖的淡水鰲蝦，其養(yǎng)殖水溫與鯡辣椒的發(fā)酵溫度相差較小，故人工模擬龍蝦養(yǎng)殖水體中殘餌濃度，研究這些芽孢桿菌對龍蝦飼料中淀粉及蛋白質(zhì)的降解情況。由圖2、3可知，5株芽孢桿菌對殘餌中的淀粉均有較強(qiáng)的降解能力，除B30降解速度較緩慢外，其他4株菌在48h的降解率均達(dá)到60%以。上。對殘餌中蛋白質(zhì)的降解，B4與B29較弱，而其他3株菌都達(dá)到50%以，上。綜合來看，B1與B18這2株蠟樣芽孢桿菌對淀粉及蛋白質(zhì)的降解率均較高，且作用迅速、穩(wěn)定，是較優(yōu)良的候選菌株。

2.3乳酸菌體外抗氧化性

鈣溶圈大小表明，L1、L8、L30、L31這4株乳酸菌產(chǎn)酸較高，對這4株菌進(jìn)行了體外抗氧化能力的初步研究和胞外多糖含量測定，結(jié)果如表2所示。

4株乳酸菌的發(fā)酵液對3種自由基都具有一定的清除能力，其中對·OH清除能力最突出，均達(dá)99%以上，高于1mg/mLVc的清除率。L1乳酸乳球菌乳酸亞種對DPPH.及02.也表現(xiàn)出更高的清除活性，抗氧化性良好，因其在4株菌中產(chǎn)酸也最高，故可作為發(fā)酵乳制品等產(chǎn)品的優(yōu)良候選菌株。從表2還可以看出，4株乳酸菌胞外多糖含量均大于200μg/mL。眾多研究表明，胞外多糖能增加發(fā)酵乳制品的黏度和穩(wěn)定性0，并能夠發(fā)揮抗氧化和抑菌等功能。

3結(jié)論與討論

發(fā)酵食品是益生菌的天然來源，鯡辣椒作為較獨(dú)特的發(fā)酵谷物制品，其所含益生菌值得探究。本試驗(yàn)從發(fā)酵第4天的鯡辣椒中共分離得到9株芽孢桿菌和10株乳酸菌，是首次從鯡辣椒中進(jìn)行芽孢桿菌的分離鑒定。

5株芽孢桿菌對模擬龍蝦殘餌均有一定的降解能力，其中B1與B18對淀粉的降解率均達(dá)到60%以上，對蛋白的降解率均達(dá)到50%以上，且作用穩(wěn)定、迅速，是較優(yōu)良的凈水候選菌株。傳統(tǒng)鯡辣椒發(fā)酵溫度通常在25～30C之間，且其原料玉米與水產(chǎn)飼料都是富含淀粉和蛋白質(zhì)等有機(jī)物，因而其中的芽孢桿菌可能適合用于養(yǎng)殖水體的凈化。這只是前期的一個(gè)模擬研究，其芽孢桿菌是否適于在真正的龍蝦養(yǎng)殖水體中生長8，是否對水體污染的直接指標(biāo)如化學(xué)需氧量、氨氮和亞硝氮等有改善作用，有待于后期進(jìn)一步研究。

采用4株產(chǎn)酸較強(qiáng)的乳酸菌進(jìn)行體外抗氧化研究表明，產(chǎn)酸最強(qiáng)的LI乳酸乳球菌乳酸亞種對DPPH·、·0H和O2-·均具有較高的清除率，尤其對.OH清除能力高于1mg/mL的Ve，且含較高量的胞外多糖，可作為發(fā)酵乳制品等產(chǎn)品的優(yōu)良候選菌株。

總體而言，鯡辣椒中益生菌含量豐富，不僅該產(chǎn)品本身因受益生菌作用而風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富，還能從中發(fā)掘出許多益生菌株用于其他食品或環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域。

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