• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    進(jìn)境種牛及遺傳物質(zhì)的遺傳缺陷病檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

    2019-09-06 03:38:09馬飛許文超宿雅彬王建昌李濤
    現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 2019年8期
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)方法應(yīng)用

    馬飛 許文超 宿雅彬 王建昌 李濤

    摘要 本研究運(yùn)用分子生物學(xué)方法,對(duì)進(jìn)口荷斯坦奶牛遺傳物質(zhì)、進(jìn)口種牛、國(guó)產(chǎn)牛精液等進(jìn)行BLAD、CVM、DUMPS、FDS4種主要遺傳病篩查,采用的PCR-RFLP方法是對(duì)提取產(chǎn)物的致病序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,后均采用酶切的方法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行純合子和隱性雜合子的鑒定,本文標(biāo)本來(lái)自進(jìn)口52份牛精液(美國(guó)、加拿大)、國(guó)產(chǎn)112份牛精液標(biāo)本.650份進(jìn)口種牛血液樣品(澳大利亞、新西蘭、烏拉圭、智利等國(guó)家),通過(guò)對(duì)814份樣品的篩查,共檢出攜帶BLAD隱性有害基因的樣品6份,攜帶CVM隱性有害基因的樣品15份,攜帶DUMPS隱性有害基因的樣品4份,未檢測(cè)到攜帶FDS隱性有害基因的樣品。基于此,我國(guó)有必要盡快建立荷斯坦牛隱性遺傳缺陷監(jiān)控體系并進(jìn)行系譜標(biāo)注,以逐步降低我國(guó)奶牛群體中遺傳缺陷隱性等位基因頻率。

    關(guān)鍵詞 進(jìn)境種牛;遺傳缺陷病;檢測(cè)方法;應(yīng)用

    中圖分類號(hào) S858.23

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

    文章編號(hào) 1007-5739(2019)08-0218-05

    1綜述

    遺傳缺陷病是動(dòng)物個(gè)體發(fā)生基因突變或染色體畸變導(dǎo)致的遺傳疾病,導(dǎo)致發(fā)育個(gè)體出現(xiàn)身體結(jié)構(gòu)上的缺陷或者功能性障礙,從而影響生產(chǎn)性能,具有先天性和家族性的特征。遺傳缺陷病分為單染色體遺傳病、染色體遺傳病和多染色體遺傳病。單基因遺傳病是指一對(duì)主基因突變?cè)斐傻募膊?,其遺傳符合孟德?tīng)柖?,荷斯坦牛中最常?jiàn)以常染色體隱性為主如荷斯坦牛脊柱畸形綜合癥(CVM)、荷斯坦牛白細(xì)胞粘附缺陷(BLAD)、荷斯坦牛尿氨酸合酶缺陷癥(DUMP),以及新發(fā)現(xiàn)的牛面部畸形綜合癥(FDS)等。

    近年來(lái),由于人工授精技術(shù)的普及以及奶牛生產(chǎn)力和養(yǎng)殖效益的大幅提高,奶牛遺傳缺陷病危害逐年增加。目前,一些國(guó)家每年都會(huì)檢測(cè)公牛的一些遺傳缺陷,并淘汰攜帶者。2017年我國(guó)進(jìn)口種牛逾10萬(wàn)頭,進(jìn)口牛精液及胚胎300萬(wàn)只,種公牛數(shù)百頭。本研究對(duì)部分進(jìn)口公牛和奶牛的精液及血液標(biāo)本進(jìn)行篩查,旨在了解我國(guó)部分進(jìn)口和國(guó)內(nèi)公牛及奶牛的遺傳缺陷情況,并希望初步建立一種方便快捷的遺傳缺陷病篩查方法。這樣以來(lái),就可提前把具有及攜帶遺傳缺陷病基因的病牛拒國(guó)]之外,對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)穩(wěn)定發(fā)展及保障畜禽衛(wèi)生健康具有重要意義。

    1.1CVM疾病簡(jiǎn)述

    脊柱畸形綜合征(complexvertebralmalformation,CVM),是荷斯坦牛的一種常染色體致死性隱性遺傳病,CVM主要表現(xiàn)為純合子胎兒的早期死亡,純合子胎兒在出生后極少能存活,但是CVM雜合子后代(攜帶者)表現(xiàn)正常,能存活?;疾倥5牟顬樾刈岛皖i椎較正常犢牛短,掌指關(guān)節(jié)和跖趾關(guān)節(jié)對(duì)稱性地收縮和彎曲,體重較同期正常犢牛輕20%左右,另外還常見(jiàn)不同程度的椎骨半側(cè)缺失、脊柱側(cè)凸以及脊柱的骨間連合等(注:在CVM患者中發(fā)現(xiàn)了脊椎沒(méi)有損傷的特例)。一些CVM患病胎兒還存在肺部和心臟畸形.CVM嚴(yán)重影響奶業(yè)生產(chǎn)。

    Agerholm等研究確診CVM為常染色體隱性遺傳病,確定CVM的候選基因是SLC35A3(solutecarrierfamily35,memberA3)基因,本研究根據(jù)CVM發(fā)病的分子機(jī)理為CVM患牛的3號(hào)染色體(BTA3)上的SLC35A3(BovineSoluteCarrierFamily35Member3)基因的第4外顯子559處發(fā)生G-T突變,導(dǎo)致180處纈氨酸置換為苯丙氨酸,致使異常的核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體從而使Rsal限制性酶切位點(diǎn)消失的原理,通過(guò)PCR-RFLP方法對(duì)此標(biāo)本進(jìn)行鑒定分析。針對(duì)G559T突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,特異性擴(kuò)增牛SLC35A3基因含有上述點(diǎn)突變的片段,長(zhǎng)度為225bp。經(jīng)限制性內(nèi)切酶RsaI酶切后,正常個(gè)體產(chǎn)生201bp和24bp的DNA條帶,而攜帶者產(chǎn)生201、24、225bp的DNA條帶,純合隱性個(gè)體仍為225bp。

    1.2BLAD疾病簡(jiǎn)述

    荷斯坦牛白細(xì)胞粘附缺陷(bovineleukocyteadhesiondeficiency,BLAD)是荷斯坦牛的一種重要的單堿基突變隱性遺傳疾病。在相同的飼養(yǎng)條件下,荷斯坦牛BLAD純合子與正常荷斯坦牛相比,生長(zhǎng)明顯緩慢,皮毛無(wú)光澤,對(duì)于病原微生物尤其是細(xì)菌的易感性高,主要特征表現(xiàn)為嚴(yán)重的重復(fù)細(xì)菌感染、缺少化膿、損傷愈合延遲和白細(xì)胞增多??谇粌?nèi)、舌和牙眼出現(xiàn)潰瘍,嚴(yán)重時(shí)由于牙床及骨翻的炎癥而引起整個(gè)下領(lǐng)腫大。咽部出現(xiàn)明顯炎癥,呼吸道和肺部出現(xiàn)炎癥。在胃和腸道出現(xiàn)潰瘍,腎臟炎癥,大多數(shù)淋巴結(jié)腫大。骨髓內(nèi)的血細(xì)胞,主要是白細(xì)胞成熟中性顆粒細(xì)胞增多。在毒血癥時(shí),血管內(nèi)的中性顆粒細(xì)胞濃度非常高,但在炎癥部位反而很低,導(dǎo)致炎癥長(zhǎng)期不愈。

    在荷斯坦牛育種中以剔除荷斯坦牛BLAD雜合子為主。BLAD遺傳缺陷病其分子遺傳學(xué)機(jī)制為牛1號(hào)染色體上CD18基因編碼區(qū)發(fā)生A383G突變,導(dǎo)致第128位氨基酸由天門冬氨酸變?yōu)楦拾彼?。本研究根?jù)BLAD患病牛CD18基因編碼區(qū)序列第383位點(diǎn)的A/G突變,從而使TaqI限制性酶切位點(diǎn)消失的原理,通過(guò)PCR-RFLP方法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行鑒定分析,針對(duì)A383G突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,特異性擴(kuò)增奶牛CD18基因含有上述點(diǎn)突變的片段,長(zhǎng)度為343bp。經(jīng)限制性內(nèi)切酶TaqI酶切后,正常個(gè)體產(chǎn)生191bp和152bp的DNA條帶,而攜帶者產(chǎn)生191、152343bp的DNA條帶,純合隱性個(gè)體仍為324bp。

    1.3DUMPS疾病簡(jiǎn)述

    尿苷酸合酶缺乏癥(deficiencyofuridinemonophophatesynthase,DUMPS)是荷斯坦牛胚胎早期死亡的一種常染色體單基因隱性遺傳缺陷病,最早于1987年在美國(guó)發(fā)現(xiàn)。臨床癥狀為血液中瓜氨酸含量升高,尿素循環(huán)受阻引起高氨血癥,從而導(dǎo)致?tīng)倥T诔錾?周內(nèi)死亡,或者母牛懷孕40d左右時(shí)流產(chǎn).DUMPS的遺傳學(xué)基礎(chǔ)是奶牛1號(hào)染色體(BTA1)上的UMPS基因C-末端密碼子405處存在著一個(gè)C-T點(diǎn)突變,可導(dǎo)致原來(lái)編碼精氨酸的CGA轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a終止密碼子的TGA,導(dǎo)致基因編碼產(chǎn)物催化亞基C-末端缺失76個(gè)氨基酸。由于這種蛋白質(zhì)的酶催化功能喪失,造成其作用底物乳清酸的大量積累。

    本研究根據(jù)該病發(fā)生的分子機(jī)理通過(guò)PCR-RFLP的檢測(cè)方法對(duì)大量標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)分析,其原理是:針對(duì)C405T突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,特異性擴(kuò)增牛UMPS基因含有上述點(diǎn)突變的片段,長(zhǎng)度為108bp,因酶切片段較小且較接近,為觀察酶切反應(yīng)是否充分,引入第二Aval酶切位點(diǎn)。經(jīng)限制性內(nèi)切酶Aval酶切后,正常個(gè)體產(chǎn)生53、36、19bp的DNA條帶,而攜帶者產(chǎn)生89、53、36、19bp的DNA條帶,純合隱性個(gè)體產(chǎn)生89bp和19bp條帶。因19bp條帶太小,通常觀察不到。

    1.4FDS疾病簡(jiǎn)述

    牛面部畸形綜合癥(FDS)是2017年被文獻(xiàn)報(bào)道出來(lái)的新發(fā)現(xiàn)的遺傳性疾病,其發(fā)病機(jī)理是位于26號(hào)染色體上編碼FGFR2基因6號(hào)外顯子第927位的堿基由G變?yōu)門(G.927T),與之相應(yīng)的高度保守的氨基酸由色氨酸變?yōu)榘腚装彼幔═rp309Cys),致使成千維細(xì)胞受體因子發(fā)生改變而引起臨床發(fā)病。其臨床表現(xiàn)為病畜面部嚴(yán)重發(fā)育不良、完全眼下垂、嚴(yán)重影響生存率。目前,國(guó)內(nèi)和國(guó)外對(duì)此病研究均很少,本課題挑選該病提取標(biāo)本基因組,用包含突變位點(diǎn)的引物特異性擴(kuò)增牛FGFR2基因含有上述點(diǎn)突變的片段,長(zhǎng)度為202bp。用基因測(cè)序的方法對(duì)進(jìn)口及國(guó)內(nèi)牛標(biāo)本突變情況進(jìn)行檢測(cè),以初步了解該病的遺傳攜帶情況。

    2牛遺傳疾病分子生物學(xué)檢測(cè)方法

    2.1試驗(yàn)材料

    2.1.1樣本來(lái)源。本文中標(biāo)本來(lái)自于進(jìn)口52份牛精液(美國(guó)、加拿大)、國(guó)產(chǎn)112份牛精液標(biāo)本650份進(jìn)口種牛血液樣品(澳大利亞新西蘭、烏拉圭、智利)。

    2.1.2主要儀器設(shè)備。BeckmanCoulter離心機(jī)(型號(hào):Micro-fuge20R)、Eppendorf梯度PCR儀(型號(hào):5331)、Bio-Rad伯樂(lè)凝膠成像系統(tǒng)SYSTEMGelDocXR+(型號(hào):1708195)、Bio-Rad伯樂(lè)穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀及水平電泳槽、紫外分光光度計(jì)、水浴恒溫振蕩器、移液器(2、10、20、100、200、1000μL)、Millipore超純水器。

    2.2試驗(yàn)試劑

    血液組織DNA提取試劑盒(貨號(hào):69504,Qiagen)、膠回收試劑盒(貨號(hào):28706,Qiagen)、PCR試劑盒(貨號(hào):M7123Promega)限制性內(nèi)切酶TaqI(貨號(hào):1189A,Takara)、DL500Marker(貨號(hào):3590QTakara)、瓊脂糖(北京化學(xué)試劑公司)、無(wú)水乙醇(北京化學(xué)試劑公司)、異丙醇(北京化學(xué)試劑公司)。

    2.3引物合成

    弓物均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成,如表1所示。

    2.4試驗(yàn)方法

    2.4.1樣品制備。收集牛精液液氮保存;收集牛未抗凝血液的血細(xì)胞成份于-20C條件下保存。

    牛精液及血液中DNA提?。喝?00μL牛精液(或100μL血液),1500r/min離心5min,棄上清,加20μL蛋白酶K,混勻。加200μLBufferAL充分混勻,56C孵育10min。加200μL乙醇充分混勻,移入洗脫柱,8000r/min離心1min。棄廢液,加入500μLAW1,8000r/min離心1min。棄廢液,加人500μLAW2,13000r/min離心3min,棄廢液及廢管。更換1.5mL離心管,加入50μL去離子水8000r/min離心1min,再加入50μL去離子水洗脫2次,共100μLDNA標(biāo)本。

    2.4.2引物配置。按說(shuō)明書(shū)要求加入雙蒸水至100pmol/μL的儲(chǔ)存液,再兩次10倍稀釋至10pmol/μL的即用引物備用。2.4.3PCR反應(yīng)體系及條件。①BLAD、CVM、DUMPS、FDSPCR反應(yīng)體系:20μLMasterMix、2μLPrimerF(l0pmol/uL)、2μLPrimerR(10pmol/μL)、16μLDNA,總體積40μL。②BLAD、CVM、DUMPSPCR反應(yīng)條件為959C預(yù)變性2min,959C變性30s,59C退火30s,72C延伸1min,反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后,95C延伸5min,4C保存。③FDSPCR反應(yīng)條件為95C預(yù)變性2min,959C變性30s,57C退火30s,72C延伸1min,反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后,72C延伸5min,4C保存。

    2.4.4瓊脂糖制作及制膠。①瓊脂糖凝膠制作。取1g瓊脂糖溶于100mLTAE中,在微波爐加熱至瓊脂糖全部熔化,使溶液冷卻至60C,加入10mg/mLEB2μL.②灌膠。用橡皮膏將電泳內(nèi)槽的兩端邊緣封好,不留縫隙。將內(nèi)槽放置于水平臺(tái)面,并插好梳子。待瓊脂糖凝膠液冷卻至60C左右,將其緩慢倒入內(nèi)槽至厚度0.5cm左右,不要形成氣泡,特別是梳子下,如有氣泡可用牙簽挑破。待膠凝固后,拔出梳子,撕去橡皮膏或透明膠帶,將帶凝膠的內(nèi)槽放人電泳槽中,靠近負(fù)極端點(diǎn)樣。加入1xTAE緩沖液至電泳槽,緩沖液剛沒(méi)過(guò)凝膠表面即可。

    2.4.5加樣。直接取40μLPCR產(chǎn)物將其分別加入凝膠的點(diǎn)樣孔并記錄點(diǎn)樣順序。

    2.4.6電泳。接通電源槽與電泳儀的電源,檢查正負(fù)極。DNA的遷移率與電壓成正比,電壓150V電壓,當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)至凝膠前沿1.5cm處,切斷電源,停止電泳。取出內(nèi)槽,推出凝膠,將其放人凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察結(jié)果,DNA存在處應(yīng)顯出明亮條帶,觀察分析、拍照、切膠保存。

    2.5PCR產(chǎn)物膠純化

    將300μLQG液體加入裝有膠的EP管中,放入50C水浴鍋中孵育10min,每3min上下混勻1次。加入350μL異丙醇,上下充分混勻。將約750μL混合液移人純化柱,13000r/min離心1min,棄廢液。加500μLQC至純化柱,13000r/min離心1min,棄廢液。加入750μLPE至純化柱,13000r/min離心1min,棄廢液。將純化柱放人新的回收座中,13000r/min離心1min,棄廢液及回收座。

    將純化柱移人1.5mLEP上,加入15μL雙蒸水,孵育1min,13000r/min離心2min。棄純化柱,將EP管收集的產(chǎn)物放-20C保存供酶切及測(cè)序。

    2.6BLAD膠純化產(chǎn)物酶切體

    BLAD酶酶切體系及條件:0.5μLTaqI酶、1.0μL1%BSA、1.0μL10xTaqIbuffer、7.5μLDNA、10.0μL總體積,酶切溫度及時(shí)間:65C過(guò)夜.CVM酶切體系及條件:0.5μLAfaI酶、1.0μL1%BSA、1.0μL10xTaqIbuffer、7.5μLDNA、10.0μL總體積,酶切溫度及時(shí)間:37C過(guò)夜。DUMPS酶切體系及條件:0.5μLAval酶、1.0μL1%BSA、1.0μL10xTaqIbuffer、7.5μLDNA、10.0μL總體積,酶切溫度及時(shí)間:30C過(guò)夜。

    3結(jié)果與分析

    3.1牛精液及血液基因組DNA提取結(jié)果

    取1μL基因組DNA放人紫外分光光度計(jì)中讀值,檢測(cè)牛精液及血液的濃度及純度。

    3.1.1BLAD目的基因PCR結(jié)果。由圖1可知,試驗(yàn)樣本經(jīng)擴(kuò)增得到一條DNA片段,長(zhǎng)度為324bp,與試驗(yàn)預(yù)期結(jié)果吻合,可進(jìn)行RFLP分析。

    3.1.2酶切結(jié)果,如圖2可知,試驗(yàn)樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)TaqI酶切后產(chǎn)生AB基因型和AA基因型2種不同分型。其中,AB基因型(即隱形攜帶者):324、191、152bp,無(wú)純合隱性個(gè)體;AA基因型(即純合子):191bp和152bp2條帶,屬正常個(gè)體。

    3.2CVM牛精液及血液基因組DNA提取結(jié)果

    CVM牛精液及血液基因組DNA提取結(jié)果如圖3所示。1~4號(hào)為牛精液基因組DNA提取結(jié)果,5~9號(hào)為血液基因組DNA提取結(jié)果。

    3.2.1目的基因PCR結(jié)果。由圖4可知,試驗(yàn)樣本經(jīng)擴(kuò)增得到一條DNA片段,長(zhǎng)度為225bp,與試驗(yàn)預(yù)期結(jié)果相吻合,可進(jìn)行RFLP分析。

    3.2.2膠純化產(chǎn)物酶切結(jié)果。如圖5可知,試驗(yàn)樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)TaqI酶切后產(chǎn)生AB基因型和AA基因型2種不同分型。其中,AB基因型(即隱形攜帶者):201、24、225bp,無(wú)純合隱性個(gè)體;AA基因型(即純合子):201bp和24bp2條帶,屬正常個(gè)體。

    3.3DUMPS牛精液及血液基因組DNA提取結(jié)果

    本試驗(yàn)所提取的牛精液基因組DNA條帶單一、清晰,但血液標(biāo)本提取DNA含量有差別,凍存時(shí)間長(zhǎng)的標(biāo)本,提取效率越低,提取DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)基因組濃度后,于-20C凍存待用。選提取質(zhì)量高的標(biāo)本左基因組DNA的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6。

    3.3.1目的基因PCR結(jié)果。由圖7可知,試驗(yàn)樣本經(jīng)擴(kuò)增得到一條長(zhǎng)度為108bp的DNA片段,與試驗(yàn)預(yù)期結(jié)果相吻合,可以進(jìn)行RFLP分析。

    3.3.2酶切。如圖8可知,試驗(yàn)樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)AvaI酶切后產(chǎn)生2種不同分型,AA基因型(即純合子):53bp和36bp2條帶,屬正常個(gè)體;AB基因型(即隱形攜帶者):89、53、36bp,無(wú)純合隱性個(gè)體。因19bp條帶太小,通常觀察不到。3.4FDS牛精液及血液基因組DNA提取結(jié)果

    本試驗(yàn)所提取的牛精液基因組DNA條帶單一、清晰,但血液標(biāo)本提取DNA含量有差別,凍存時(shí)間長(zhǎng)的標(biāo)本,提取效率越低,提取DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)基因組濃度后,于-20C凍存待用。選提取質(zhì)量高的標(biāo)本左基因組DNA的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9。

    3.4.1目的基因PCR結(jié)果。由圖10可知,試驗(yàn)樣本經(jīng)擴(kuò)增得到一條長(zhǎng)度為202bp的DNA片段,與試驗(yàn)預(yù)期結(jié)果相吻合,可以進(jìn)行RFLP分析。

    3.4.2測(cè)序結(jié)果。圖11為FGFR2目的基因測(cè)序結(jié)果,從結(jié)果上看927位的堿基由G未變?yōu)門,未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。圖12、13分別為FGFR2基因NCBI基因比對(duì)結(jié)果、FGFR2基因NCBI氨基酸序列比對(duì)。

    4結(jié)論與討論

    本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)進(jìn)口52份牛精液、國(guó)產(chǎn)112份牛精液標(biāo)本、進(jìn)口650份牛血液標(biāo)本共計(jì)814份綜合研究,結(jié)果如表4所示。本研究利用PCR-RFLP的方法對(duì)進(jìn)口及國(guó)產(chǎn)共814份標(biāo)本進(jìn)行BLAD遺傳缺陷病檢測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)進(jìn)口種公牛及國(guó)內(nèi)種公牛無(wú)BLAD遺傳病基因,進(jìn)口650份奶牛中共發(fā)現(xiàn)6頭BLAD隱性基因攜帶者,攜帶率占總共標(biāo)本數(shù)的1.02%,低于部分文獻(xiàn)報(bào)道的地區(qū)攜帶率2%~20%。而且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)BLAD純合個(gè)體,即BLAD感染者,因?yàn)檫@樣的個(gè)體在出生后不久便死亡。該研究的目的就是篩查BLAD攜帶者,即AB基因型個(gè)體,及時(shí)淘汰BLAD攜帶者,掌握BLAD遺傳缺陷在奶牛群中分布情況。

    在對(duì)CVM的篩查中,進(jìn)口種公牛精液中CVM攜帶率為零,說(shuō)明目前國(guó)外已重視且做到了對(duì)種公牛的CVM遺傳病的有效篩選,這有助于減少CVM在我國(guó)荷斯坦牛群中的擴(kuò)散。國(guó)產(chǎn)牛精液檢測(cè)出4例陽(yáng)性,說(shuō)明但隨著CVM檢測(cè)方法的越來(lái)成熟和完善,依然有必要對(duì)國(guó)內(nèi)種公牛建立一種長(zhǎng)期有效的檢測(cè)機(jī)制,一旦發(fā)現(xiàn),立即處理,防止牛群生產(chǎn)性能及繁殖性能下降;同時(shí),國(guó)內(nèi)畜牧場(chǎng)也應(yīng)進(jìn)行CVM的基因檢測(cè),避免近交繁殖加大致死率。雖然進(jìn)口荷斯坦奶?;駽VM攜帶率低于報(bào)道水平(11例,1.9%),但伴隨著我國(guó)對(duì)進(jìn)口荷斯坦活牛需求的激增,有必要對(duì)進(jìn)口牛的譜系及遺傳病進(jìn)行篩查,并建立一定范圍的信息共享機(jī)制,選擇種群優(yōu)秀的個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)種繁育。

    在對(duì)DUMPS遺傳缺陷病篩查中,共發(fā)現(xiàn)4頭DUMPS隱性基因攜帶者,發(fā)生率為0.5%,雖然發(fā)生率不高,但如果近交率較大時(shí),將嚴(yán)重影響牛群的繁殖性能。因此,還是有必要對(duì)進(jìn)口牛精液及種牛的譜系進(jìn)行篩查,防止牛群生產(chǎn)性能及繁殖性能下降;同時(shí),國(guó)內(nèi)畜牧場(chǎng)也應(yīng)進(jìn)行DUMPS的基因檢測(cè),避免近交繁殖加大致死率。在進(jìn)口及國(guó)產(chǎn)牛精液的譜系檢測(cè)中,可建立一定范圍的信息共享機(jī)制,選擇種群優(yōu)秀的個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)種繁育。

    本次研究未發(fā)現(xiàn)有FDS隱形基因攜帶者,但FDS致死率較大,但如果近交率較大時(shí),將嚴(yán)重影響牛群的繁殖性能。因此,有必要對(duì)進(jìn)口牛精液及種牛的譜系進(jìn)行篩查,防止牛群生產(chǎn)性能及繁殖性能下降。

    5展望

    PCR-RFLP均可適合于以上3種疾病的常規(guī)檢測(cè)篩選,標(biāo)本可選擇精液或血液,該方法簡(jiǎn)單快捷、準(zhǔn)確性高、成本低廉,適合對(duì)牛進(jìn)行大規(guī)模檢測(cè)。對(duì)814份樣品的檢測(cè)結(jié)果為:6頭荷斯坦牛為BLAD攜帶者,攜帶率為0.8%;15頭荷斯坦牛為CVM攜帶者,攜帶率為2.0%:4頭牛為DUMPS攜帶者,攜帶率為0.5%,說(shuō)明進(jìn)口奶牛和國(guó)內(nèi)牛隱性遺傳疾病雖然攜帶率低于報(bào)道,但還有一定比例。對(duì)進(jìn)口32份牛精液的檢測(cè)結(jié)果為均無(wú)攜帶率,說(shuō)明國(guó)外畜牧業(yè)大國(guó)對(duì)種公牛遺傳疾病檢測(cè)還是做到了有意義的篩查。

    本研究同時(shí)用測(cè)序的方法對(duì)2017年新報(bào)道的遺傳疾病牛面部綜合癥(FDS)進(jìn)行篩選,對(duì)以上標(biāo)本均為檢測(cè)出陽(yáng)性。說(shuō)明FDS的攜帶率比較低,可不必要對(duì)牛進(jìn)行大規(guī)模檢測(cè),但對(duì)種公牛的篩選還是有長(zhǎng)遠(yuǎn)意義。

    優(yōu)秀種公牛在荷斯坦牛育種過(guò)程中被高強(qiáng)度使用,當(dāng)優(yōu)秀種公牛攜帶隱性遺傳疾病時(shí),隱性遺傳疾病很易被迅速傳播。目前,我國(guó)有種公牛超過(guò)2000頭,但對(duì)遺傳疾病的攜帶率情況不清楚。因此,應(yīng)對(duì)我國(guó)荷斯坦種公牛盡快進(jìn)行遺傳疾病的檢測(cè)。由于試驗(yàn)抽取樣本有限只能對(duì)我國(guó)荷斯坦牛隱性遺傳疾病攜帶情況進(jìn)行初步調(diào)查,還應(yīng)對(duì)我國(guó)荷斯坦牛隱性遺傳疾病攜帶情況進(jìn)行大規(guī)模的抽查。隱性遺傳疾病的剔除是一項(xiàng)長(zhǎng)期任務(wù),各職能部門應(yīng)共同努力,加強(qiáng)對(duì)進(jìn)口奶牛、精液及胚胎的檢驗(yàn),同時(shí)逐步淘汰現(xiàn)已檢測(cè)出的攜帶隱性遺傳疾病的荷斯坦奶牛。

    6參考文獻(xiàn)

    [1]孫藝,孫東曉,張沅中國(guó)荷斯坦牛白細(xì)胞粘附缺陷病遺傳分析[J].中國(guó)奶牛,2007(11):7-10.

    [2]王洪梅,李建斌,侯明海,等牛脊柱畸形綜合征檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].遺傳,2008(9):1223-1227.

    [3]朱凱,劉光磊,張長(zhǎng)斌,等.荷斯坦牛遺傳缺陷病研究進(jìn)展[J].中國(guó)奶牛,2014(5):17-20.

    [4]JORGENSA,MCEVOYFJ,HEEGAARDS,etal.AdenovomissensemutationofFGFR2causesfacialdysplasiasyndromeinHolsteincattle[J].BMCGenetics,2017,18:74.

    [5]馬金柱,崔玉東,朱戰(zhàn)波,等.牛白細(xì)胞粘附缺陷?。˙LAD)的調(diào)查[J].遺傳,2006(10):1233-1236.

    [6]李艷華,張勝利,劉振君,等中國(guó)荷斯坦牛脊椎畸形綜合征的研究現(xiàn)狀與展望[J].中國(guó)奶牛,2008(6):27-29.

    [7]范學(xué)華,張毅,孫東曉,等.中國(guó)荷斯坦種公牛BLAD遺傳缺陷的分子檢測(cè)及系譜分析[J].中國(guó)奶牛,2011(8):1-4.

    [8]施紅.新型的DNA序列測(cè)定策略:PCR產(chǎn)物直接測(cè)序[J].生物技術(shù)通訊,2005,11(2):10.

    [9]徐祖元,包其郁,牛宇欣.PCR產(chǎn)物直接測(cè)序技術(shù)中影響因素研究[J].遺傳,2007,24(5):548-550.

    [10]王洪梅,李建斌,許尚忠,等中國(guó)荷斯坦牛白細(xì)胞黏附缺陷癥PCR-RFLP檢測(cè)方法的研究[J].生物技術(shù)通報(bào),2007(3):155-158.

    [11]張開(kāi)展.中國(guó)奶牛進(jìn)口情況與趨勢(shì)[J].中國(guó)牧業(yè)通訊,2005(11):14-15.

    [12]蘇光華,張?jiān)S.奶牛血液保存條件和DNA提取方法的優(yōu)化[J].中國(guó)奶牛,2007(5):7-9.

    [13]馬春生一種新的荷斯坦牛遺傳缺陷短脊椎綜合癥(Brachyspina)[CV/

    中國(guó)奶業(yè)協(xié)會(huì)繁殖專業(yè)委員會(huì)、國(guó)家肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疾病控制研究室、國(guó)家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疾病控制研究室中國(guó)奶業(yè)協(xié)會(huì)第24次繁殖學(xué)術(shù)年會(huì)暨國(guó)家奶牛/肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系第一屆全國(guó)牛病防治學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.北京:中國(guó)奶業(yè)協(xié)會(huì)繁殖專業(yè)委員會(huì),國(guó)家肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疾病控制研究室,國(guó)家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疾病控制研究室,全國(guó)牛病大會(huì)組委會(huì),2009:4.

    [14]李建斌,王洪梅,高運(yùn)東,等.利用PCR-RFLP檢測(cè)中國(guó)荷斯坦牛遺傳缺陷:瓜氨酸血癥[J].生物技術(shù)通報(bào),2006(6):97-99.

    猜你喜歡
    檢測(cè)方法應(yīng)用
    關(guān)于食品中氟烯草酸的檢測(cè)方法的研究
    淺談瀝青路面施工的非均勻性及檢測(cè)方法
    宮頸內(nèi)人乳頭瘤病毒的研究進(jìn)展
    電力計(jì)量裝置異常原因及監(jiān)測(cè)方法分析
    小兒氨酚黃那敏顆粒有關(guān)物質(zhì)對(duì)氯苯乙酰胺檢測(cè)方法的建立
    多媒體技術(shù)在小學(xué)語(yǔ)文教學(xué)中的應(yīng)用研究
    考試周刊(2016年76期)2016-10-09 08:45:44
    分析膜技術(shù)及其在電廠水處理中的應(yīng)用
    科技視界(2016年20期)2016-09-29 14:22:00
    GM(1,1)白化微分優(yōu)化方程預(yù)測(cè)模型建模過(guò)程應(yīng)用分析
    科技視界(2016年20期)2016-09-29 12:03:12
    煤礦井下坑道鉆機(jī)人機(jī)工程學(xué)應(yīng)用分析
    科技視界(2016年20期)2016-09-29 11:47:01
    氣體分離提純應(yīng)用變壓吸附技術(shù)的分析
    科技視界(2016年20期)2016-09-29 11:02:20
    日本黄色视频三级网站网址| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 一二三四在线观看免费中文在| 中文资源天堂在线| xxx96com| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲精品久久国产高清桃花| 久久婷婷成人综合色麻豆| 9191精品国产免费久久| 制服人妻中文乱码| 成人18禁在线播放| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲国产精品久久男人天堂| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 免费看十八禁软件| 丝袜美腿诱惑在线| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 精品人妻1区二区| 欧美日韩黄片免| 女性被躁到高潮视频| 天天一区二区日本电影三级| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲精品av麻豆狂野| 99久久99久久久精品蜜桃| 免费在线观看日本一区| 一区二区三区国产精品乱码| 欧美精品亚洲一区二区| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品野战在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 中文字幕av电影在线播放| 韩国av一区二区三区四区| 91老司机精品| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久久国产成人精品二区| 久久草成人影院| 国产视频内射| 一进一出抽搐动态| 欧美日韩一级在线毛片| 最近在线观看免费完整版| 久久久国产成人免费| 精品免费久久久久久久清纯| 国产主播在线观看一区二区| 12—13女人毛片做爰片一| 美女大奶头视频| 久久久久久人人人人人| ponron亚洲| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产视频一区二区在线看| 国语自产精品视频在线第100页| 女同久久另类99精品国产91| 一本大道久久a久久精品| 国产精品久久电影中文字幕| 中亚洲国语对白在线视频| 男人操女人黄网站| 淫秽高清视频在线观看| videosex国产| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 一级a爱片免费观看的视频| 国产精品免费视频内射| 日韩中文字幕欧美一区二区| 色播在线永久视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 十分钟在线观看高清视频www| 两性夫妻黄色片| 午夜精品久久久久久毛片777| 满18在线观看网站| 亚洲黑人精品在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 亚洲成人久久爱视频| a在线观看视频网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | www.www免费av| 99久久无色码亚洲精品果冻| 日韩欧美免费精品| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 亚洲国产精品合色在线| 在线观看66精品国产| 中文字幕高清在线视频| 免费观看精品视频网站| 久久久久久久久中文| 黄片播放在线免费| 国产黄色小视频在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 久久亚洲真实| 青草久久国产| 久久香蕉激情| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 后天国语完整版免费观看| 午夜老司机福利片| 日韩有码中文字幕| av福利片在线| 午夜精品在线福利| 欧美色视频一区免费| 在线播放国产精品三级| 人妻久久中文字幕网| 黄色丝袜av网址大全| 欧美日韩一级在线毛片| 久久香蕉激情| 精品久久蜜臀av无| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久欧美精品欧美久久欧美| av在线播放免费不卡| 欧美激情 高清一区二区三区| 制服丝袜大香蕉在线| 国产麻豆成人av免费视频| 精品久久蜜臀av无| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日韩精品中文字幕看吧| 深夜精品福利| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 手机成人av网站| 国产精品久久久久久精品电影 | 动漫黄色视频在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 日本在线视频免费播放| 午夜福利高清视频| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美大码av| 亚洲成人久久性| 亚洲无线在线观看| 午夜久久久在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 天天添夜夜摸| 亚洲国产中文字幕在线视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲avbb在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 可以在线观看的亚洲视频| 久久精品国产综合久久久| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 中文字幕人妻熟女乱码| 色婷婷久久久亚洲欧美| 在线天堂中文资源库| 国产视频内射| 亚洲电影在线观看av| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲人成电影免费在线| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 深夜精品福利| 亚洲欧美精品综合久久99| 日本成人三级电影网站| 90打野战视频偷拍视频| svipshipincom国产片| 欧美三级亚洲精品| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美久久黑人一区二区| 欧美+亚洲+日韩+国产| а√天堂www在线а√下载| 国产高清videossex| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲九九香蕉| 国产精品一区二区免费欧美| 精华霜和精华液先用哪个| 午夜免费激情av| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 人人妻人人澡人人看| 香蕉久久夜色| 亚洲av美国av| 两人在一起打扑克的视频| 午夜激情av网站| 日本精品一区二区三区蜜桃| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲精品在线美女| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产av一区在线观看免费| 免费在线观看影片大全网站| 国产成人精品无人区| 久久热在线av| 久久国产乱子伦精品免费另类| 免费搜索国产男女视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产男靠女视频免费网站| 久久亚洲真实| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产视频内射| 亚洲成人免费电影在线观看| 日本a在线网址| 久久午夜综合久久蜜桃| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美一级a爱片免费观看看 | 午夜福利在线观看吧| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 怎么达到女性高潮| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲中文av在线| 成熟少妇高潮喷水视频| www.自偷自拍.com| 久久久久九九精品影院| 欧美乱码精品一区二区三区| 免费高清视频大片| 亚洲精品国产一区二区精华液| 成人av一区二区三区在线看| 18美女黄网站色大片免费观看| 波多野结衣巨乳人妻| 午夜福利欧美成人| 国产视频内射| ponron亚洲| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 一区二区日韩欧美中文字幕| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 精品不卡国产一区二区三区| 久久中文字幕一级| 国产aⅴ精品一区二区三区波| av中文乱码字幕在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 国产一卡二卡三卡精品| 成人三级做爰电影| 国产爱豆传媒在线观看 | 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 97碰自拍视频| 最近在线观看免费完整版| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 少妇的丰满在线观看| 亚洲精品在线美女| 18禁美女被吸乳视频| 免费在线观看日本一区| 国产私拍福利视频在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 999精品在线视频| 51午夜福利影视在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 不卡一级毛片| 久久精品91无色码中文字幕| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产三级黄色录像| 黄片播放在线免费| 国产精品久久久久久精品电影 | 欧美午夜高清在线| 国产激情久久老熟女| 欧美+亚洲+日韩+国产| 丝袜人妻中文字幕| 欧美日韩精品网址| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产欧美日韩一区二区三| 成年免费大片在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲一区中文字幕在线| 国产亚洲精品久久久久5区| 欧美最黄视频在线播放免费| 日韩欧美一区视频在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲精品一区av在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲九九香蕉| 精品国产国语对白av| 一二三四社区在线视频社区8| 午夜久久久在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 一区二区三区激情视频| 一夜夜www| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产精品一区二区三区四区久久 | 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲人成电影免费在线| 黄色 视频免费看| 午夜福利在线观看吧| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产一区二区在线av高清观看| 国产激情久久老熟女| 91成人精品电影| 在线观看免费午夜福利视频| 悠悠久久av| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产免费男女视频| 久久中文字幕一级| 中文资源天堂在线| 嫩草影院精品99| 日日夜夜操网爽| 18禁国产床啪视频网站| svipshipincom国产片| 波多野结衣av一区二区av| 女警被强在线播放| 丝袜在线中文字幕| 一本一本综合久久| 成人特级黄色片久久久久久久| 日韩av在线大香蕉| 欧美国产精品va在线观看不卡| a级毛片a级免费在线| 一级毛片女人18水好多| 十八禁网站免费在线| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 丁香欧美五月| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲成国产人片在线观看| 韩国精品一区二区三区| 久久午夜亚洲精品久久| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美日韩一级在线毛片| ponron亚洲| 香蕉国产在线看| 白带黄色成豆腐渣| 两个人视频免费观看高清| 91九色精品人成在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 日本一本二区三区精品| 久久中文看片网| 国产精品 欧美亚洲| 美女午夜性视频免费| 成人国语在线视频| 波多野结衣av一区二区av| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 午夜福利高清视频| 国产成人av教育| 亚洲成人久久性| 成人手机av| 国产精品1区2区在线观看.| 性色av乱码一区二区三区2| 黑人操中国人逼视频| 女性生殖器流出的白浆| 午夜日韩欧美国产| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 曰老女人黄片| 啪啪无遮挡十八禁网站| 成人国产综合亚洲| 国产精品 国内视频| 无限看片的www在线观看| 久久中文字幕人妻熟女| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久久国产精品麻豆| 国产精品电影一区二区三区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲人成77777在线视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 99久久99久久久精品蜜桃| videosex国产| 91九色精品人成在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产精品九九99| 丁香六月欧美| 精品久久久久久久毛片微露脸| 波多野结衣巨乳人妻| 成人免费观看视频高清| 热re99久久国产66热| 国产一区二区在线av高清观看| 成人一区二区视频在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 91九色精品人成在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲专区字幕在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 在线永久观看黄色视频| 两个人看的免费小视频| 哪里可以看免费的av片| 久久 成人 亚洲| 亚洲中文av在线| 一级毛片高清免费大全| 露出奶头的视频| 亚洲av片天天在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 香蕉久久夜色| 大型av网站在线播放| 国产精品国产高清国产av| 国产又色又爽无遮挡免费看| 夜夜夜夜夜久久久久| 91成人精品电影| 国产成人欧美在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 午夜两性在线视频| 免费高清在线观看日韩| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 欧美成人免费av一区二区三区| 此物有八面人人有两片| 嫁个100分男人电影在线观看| 手机成人av网站| 免费高清在线观看日韩| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产精品永久免费网站| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 人人妻人人澡人人看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 99热6这里只有精品| 黄色成人免费大全| 露出奶头的视频| 我的亚洲天堂| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 成年女人毛片免费观看观看9| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 欧美成狂野欧美在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产一区二区在线av高清观看| 黄片播放在线免费| 一进一出好大好爽视频| 首页视频小说图片口味搜索| 国产精品综合久久久久久久免费| 日韩大码丰满熟妇| 一本综合久久免费| 变态另类丝袜制服| 精品久久蜜臀av无| 999精品在线视频| 久久亚洲真实| 一本大道久久a久久精品| 久久香蕉国产精品| 两个人看的免费小视频| 久热这里只有精品99| 久久久国产成人精品二区| 男人舔女人的私密视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲av电影在线进入| 黄色a级毛片大全视频| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久亚洲真实| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产黄a三级三级三级人| 人人澡人人妻人| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲avbb在线观看| 久久人人精品亚洲av| x7x7x7水蜜桃| 国产一区在线观看成人免费| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 国产成人影院久久av| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久99久视频精品免费| 最好的美女福利视频网| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 99久久99久久久精品蜜桃| 两个人视频免费观看高清| 女同久久另类99精品国产91| bbb黄色大片| 精品久久久久久,| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 老鸭窝网址在线观看| 久久香蕉精品热| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲第一电影网av| 啦啦啦 在线观看视频| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 欧美乱色亚洲激情| 日韩高清综合在线| 此物有八面人人有两片| 午夜久久久在线观看| 深夜精品福利| 香蕉久久夜色| 日韩大码丰满熟妇| 韩国精品一区二区三区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 波多野结衣高清作品| 韩国av一区二区三区四区| 免费搜索国产男女视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 性欧美人与动物交配| 免费av毛片视频| 可以在线观看毛片的网站| 黄频高清免费视频| 欧美三级亚洲精品| 国产97色在线日韩免费| 国产欧美日韩一区二区三| 国产1区2区3区精品| 亚洲七黄色美女视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 精品无人区乱码1区二区| 美女大奶头视频| 精品第一国产精品| 亚洲av电影在线进入| 精品福利观看| 女警被强在线播放| 一区福利在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲成人免费电影在线观看| xxxwww97欧美| 国产私拍福利视频在线观看| 国产亚洲精品av在线| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲专区中文字幕在线| 校园春色视频在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 麻豆一二三区av精品| 国产高清有码在线观看视频 | 午夜影院日韩av| 国产人伦9x9x在线观看| 成在线人永久免费视频| 亚洲专区国产一区二区| 精品一区二区三区四区五区乱码| avwww免费| 一级毛片精品| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产成人欧美| 首页视频小说图片口味搜索| 欧美黄色片欧美黄色片| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 午夜久久久久精精品| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 亚洲七黄色美女视频| 亚洲精品国产区一区二| 欧美一级毛片孕妇| 日韩三级视频一区二区三区| 成人国产综合亚洲| 日本一区二区免费在线视频| 一a级毛片在线观看| 久久青草综合色| av视频在线观看入口| 老司机靠b影院| 色av中文字幕| 一二三四社区在线视频社区8| 欧美性长视频在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 啦啦啦免费观看视频1| 国产99久久九九免费精品| 久久精品国产亚洲av高清一级| 丝袜在线中文字幕| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产三级黄色录像| 一级a爱视频在线免费观看| 精品无人区乱码1区二区| 精品国产美女av久久久久小说| 久久精品国产综合久久久| 一本久久中文字幕| 丁香欧美五月| 免费在线观看日本一区| 亚洲黑人精品在线| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产片内射在线| 国产精品av久久久久免费| 欧美三级亚洲精品| 婷婷丁香在线五月| 亚洲中文av在线| 日本成人三级电影网站| 国产区一区二久久| 国产精品二区激情视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 无人区码免费观看不卡| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲 欧美一区二区三区| 免费高清在线观看日韩| 国产精品国产高清国产av| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产在线观看jvid| 特大巨黑吊av在线直播 | 久久久久精品国产欧美久久久| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 日本在线视频免费播放| 亚洲精品色激情综合| 99国产精品99久久久久| 国产黄色小视频在线观看| 国产精品免费视频内射| 制服诱惑二区| 精品人妻1区二区| 校园春色视频在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产精品电影一区二区三区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 久久久久九九精品影院| 日韩免费av在线播放| 少妇的丰满在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产成人av激情在线播放| 国产精品日韩av在线免费观看| 成人永久免费在线观看视频| 欧美在线一区亚洲| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久久久久久午夜电影| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 免费看十八禁软件| 91字幕亚洲| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲男人天堂网一区| 精品国产国语对白av| 久久亚洲真实| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久草成人影院| 亚洲男人天堂网一区| 91九色精品人成在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲 国产 在线| √禁漫天堂资源中文www|