腦立清片的質量標準

陳曉颙，辜明

(1.湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院，武漢 430075；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，武漢 430022)

腦立清片由薄荷腦、冰片、磁石、赭石、珍珠母、牛膝等十余味中藥材組成，具有平肝潛陽、醒腦安神之功效，用于頭暈目眩、耳鳴口苦、心煩難寐及高血壓，現行標準收載于《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑》(第十九冊)[1]。腦立清片為國家醫(yī)保目錄品種，現行質量標準中僅收載了處方、制法、性狀、顯微鑒別及薄層鑒別等項目，難以有效控制藥品質量及用藥安全性。近年來，隨著中藥制劑研究的不斷深入以及藥物分析技術的快速發(fā)展，對中成藥的質量標準制訂也提出更高的要求。

腦立清片全國共有3家生產企業(yè)，3個批準文號，筆者對其中2家生產企業(yè)的6批腦立清樣品進行研究，增加了牛膝的顯微鑒別、磁石、赭石的理化鑒別，增加了牛膝、豬膽汁的薄層鑒別，采用氣相色譜法對薄荷腦、冰片的含量進行了測定，并采用原子吸收分光光度法測定了制劑中鐵的含量，修訂后的質量標準可對腦立清片進行準確的定性和定量測定，能夠有效評價與控制其質量。

1 儀器與試藥

1.1儀器 奧林巴斯BX53顯微照相系統(tǒng)；Agilent 7890A氣相色譜儀及FID檢測器；TAS-986原子吸收分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；XP205電子天平[梅特勒-托尼多儀器(上海)有限公司，感量：0.01 mg]；Agilent HP-INNOWax(30.0 mm×250 mm，0.25 mm)彈性石英毛細管柱。

1.2試藥 齊墩果酸對照品(批號：110709-200304)、豬去氧膽酸對照品(批號：0087-9708)、薄荷腦對照品(批號：0728-200006)、龍腦對照品(批號：110881-200706，含量：99.2%)均來自中國食品藥品檢定研究院；鐵元素標準溶液(1000 mg·mL-1，中國計量科學院國家標準物質研究中心)；其余所有試劑均為分析純或優(yōu)級純；6批腦立清片樣品分別來源于A(批號：091104，101104，100803)及B(批號：10515，100506，100803)兩家生產企業(yè)。

2 方法與結果

2.1顯微特征鑒別 取腦立清樣品研細，置顯微鏡下觀察(圖1)，草酸鈣砂晶充塞于薄壁細胞中(牛膝)。不規(guī)則碎塊，表面多不整齊，呈明顯的顆粒性(珍珠母)。草酸鈣針晶束存在于橢圓形黏液細胞中或隨處散在(清半夏)。

2.2理化鑒別 取腦立清樣品適量，研細，取約1 g，用水淘洗，可得少量棕褐色沉淀。取沉淀，加鹽酸2 mL，振搖，濾過，取濾液，加硫氰酸銨試液2滴，即顯血紅色。取缺赭石、磁石的陰性樣品，同法處理，結果不顯血紅色。

2.3薄層色譜鑒別

2.3.1牛膝的鑒別

①溶液制備。取腦立清樣品適量，研細，取約5 g，加乙醇30 mL，加熱回流40 min，放冷，濾過，取濾液15 mL，加鹽酸1 mL，加熱回流1 h，放泠，加水20 mL，用石油醚(60～90 ℃)15 mL振搖提取4次，提取液蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。按處方中比例制備缺牛膝的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。取齊墩果酸對照品，加乙醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

②色譜條件。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502[5])實驗，吸取供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，對照品溶液3 μL，分別點于同一硅膠G薄層預制板上，以三氯甲烷-甲醇(40：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點顯色清晰[2-4]。

③鑒別結果。供試品溶液、陰性對照溶液及對照品溶液在上述色譜條件下進行薄層色譜鑒別，結果見圖2。可見，在與對照品色譜相應位置上，供試品色譜中顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。

2.3.2豬膽汁的鑒別

①溶液制備。取腦立清樣品適量，研細，取約5 g，加甲醇40 mL，加熱回流2 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加10%氫氧化鈉溶液10 mL，在120 ℃加熱4 h，放冷，加水30 mL充分溶解，濾過，濾液加鹽酸調節(jié)pH值至2～3，搖勻，用乙酸乙酯振搖提取4次，每次15 mL，合并提取液，蒸干，殘渣加乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。按處方中比例制備缺豬膽汁的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。另取豬去氧膽酸對照品，加乙醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

②色譜條件。按照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502[5])實驗，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以異辛烷-乙醚-正丁醇-冰醋酸-水(10：5：3：5：1)的上層溶液為展開劑(臨用新配)，展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點顯色清晰[6]。

③鑒別結果。供試品溶液、陰性對照溶液及對照品溶液在上述色譜條件下進行薄層色譜鑒別，結果見圖3?？梢?，在與對照品色譜相應位置上，供試品色譜中顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。

圖1 腦立清片顯微圖(15×20)Fig.1 Microscopic characteristics of Naoliqing tablets(15×20)

1.齊墩果酸對照品；2～4.供試品溶液；5.缺牛膝的陰性對照樣品。圖2 牛膝的薄層色譜圖1.oleanolic acid reference；2-4.test samples；5.negative reference without Achyranthis Bidentatae Radix.Fig.2 TLC of Achyranthis Bidentatae Radix

1.豬去氧膽酸對照品；2～4.供試品溶液；5.缺豬膽汁的陰性對照樣品。圖3 豬膽汁的薄層色譜圖 1.hyodeoxycholic acid reference；2-4.test samples；5.negative reference without Fel Suillus.Fig.3 TLC of Fel Suillus

2.4含量測定

2.4.1薄荷腦和龍腦的含量測定

①色譜條件。Agilent HP-INNOWax(30.0 mm×250 mm，0.25 μm)彈性石英毛細管柱，氮氣(N2)為載氣，流速：1.0 mL·min-1，進樣量：2 μL，柱溫160 ℃；理論板數以龍腦和薄荷腦峰計算均不低于10 000。與內標物質的分離度>1.5[7-15]。

②溶液的制備。對照品溶液：取水楊酸甲酯適量，精密稱定，加無水乙醇制成每毫升含約10 mg的溶液，作為內標溶液；另取龍腦對照品約10 mg、薄荷腦對照品約10 mg置10 mL量瓶中，加無水乙醇溶解后稀釋至刻度；再精密吸取2 mL，置10 mL量瓶中，精密加入內標溶液1 mL，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得龍腦和薄荷腦對照品溶液。

供試品溶液：取本品20片，精密稱定，研細，混勻，取約2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入無水乙醇25 mL，稱定質量，加熱回流30 min，取出放冷，再稱定質量，用無水乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置10 mL量瓶中，精密加入內標溶液1 mL，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

陰性對照溶液：按照腦立清片的處方比例分別制備缺冰片和薄荷腦的陰性樣品，照供試品溶液的制備方法，制成陰性對照溶液。

③專屬性實驗。精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液，注入氣相色譜儀分析(圖4)，結果表明陰性樣品無干擾，樣品與內標之間無干擾。

④線性關系考察。精密稱取水楊酸甲酯0.531 4 g，置于50 mL量瓶中加適量無水乙醇溶解后，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為內標溶液。另精密稱取龍腦對照品51.81 mg、薄荷腦對照品49.85 mg，置25 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別精密吸取此對照品溶液0.3，1.0，2.0，3.0，5.0 mL，置10 mL量瓶中，再精密吸取上述內標溶液1 mL，分別加入量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別吸取上述5種系列對照品溶液各2 μL，注入氣相色譜儀，以濃度(X)為橫坐標，以對照品與內標物質水楊酸甲酯的峰面積之比(Y)為縱坐標，進行回歸，回歸方程為：薄荷腦：Y=1.537X+0.000 7，r=0.999 9和龍腦：Y=1.574 5X+0.010 8，r=0.999 9。結果表明，龍腦對照品在0.061 6～1.028 0 mg·mL-1；薄荷腦對照品在0.059 8～0.997 0 mg·mL-1的濃度范圍內線性關系良好。

⑤重復性實驗。精密稱取樣品6份(批號：100515)，按“2.4.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結果樣品中龍腦和薄荷腦的含量分別為每片2.06和1.06 mg，RSD分別為1.88%和2.35%。

A.對照品+內標；B.供試品+內標；C.缺冰片的陰性對照+內標；D.缺薄荷腦的陰性對照+內標；1.薄荷腦；2.龍腦；3.內標(水楊酸甲酯)。圖4 腦立清片氣相色譜圖A.reference and internal standard；B.sample and internal standard；C.negative control without borneol and internal standard；D.negative control without menthol and internal standard；1.menthol；2.borneol；3.internal standard(methyl acetylsalicylate).Fig.4 GC choromatograms of Naoliqing tablets

⑥回收率實驗。精密稱取6份已測定含量的樣品各1 g(批號：100515；含量：龍腦4.10 mg·g-1，薄荷腦2.10 mg·g-1)，精密加入混合對照溶液(龍腦：2.086 mg·mL-1、薄荷腦：1.052 mg·mL-1)2 mL，按“2.4.1.2”項下方法制備供試品溶液，測定含量，計算加樣回收率，結果見表1，2。龍腦和薄荷腦的平均回收率分別為101.40%和102.70%，RSD分別為0.92%和1.26%。

⑦穩(wěn)定性實驗。精密吸取供試品溶液(批號：100515)2 μL，于0，2，4，6，8，12 h進樣分析，記錄峰面積，計算龍腦、薄荷腦與內標物的峰面積比，其RSD分別為1.59%和0.41%，說明供試品溶液在12h內穩(wěn)定性良好。

表1 腦立清片中龍腦和薄荷腦回收率測定結果Tab.1 Recovery results of borneol and menthol in Naoliqing tablets

表2 樣品的含量測定結果Tab.2 Content detection of borneol and menthol in samples

⑧樣品的測定。取6批樣品，按“2.4.1.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取2 μL注入氣相色譜儀，記錄峰面積，計算含量，結果見表2。

2.4.2磁石、赭石中鐵含量的測定

①測定條件。波長：248.3 nm；狹縫：0.2 nm；燈電流：3.0 mA；光源為鐵空心陰極燈。采用空氣-乙炔火焰；空氣流量：7.0 L·min-1；乙炔流量：1.7 L·min-1[16-20]。

②溶液的制備。對照品溶液的制備：精密量取鐵元素標準液(中國計量科學院國家標準物質研究中心，含量：1000 μg·mL-1)，配制成0.5，1.0，2.0，5.0及10.0 g·mL-1的標準溶液。

供試品溶液的制備：取本品20片，研細，混勻，取約0.1 g，精密稱定，置凱氏燒瓶中，加硝酸-高氯酸(4：1)15 mL，混勻，瓶口加以小漏斗，浸泡過夜。置電熱板上加熱消解，保持微沸，若變棕黑色，再加硝酸-高氯酸(4：1)混合溶液適量，持續(xù)加熱至溶液澄明后升高溫度，繼續(xù)加熱至冒濃煙，直至白煙散盡，消解液呈無色透明或略帶黃色，放冷，轉入50 mL量瓶中，用2%硝酸溶液洗滌容器，洗液合并于量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得。同法同時制備試劑空白溶液。

③標準曲線的制備。取“2.4.2②”項下的鐵標準溶液進樣，采用火焰法測定，以吸光度(A)為縱坐標，濃度(C)為橫坐標，計算回歸方程：A=0.009 7C-0.038 6，r=0.999 48。結果表明，鐵檢測濃度在0.5～10.0 μg·mL-1范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

④重復性實驗。精密稱取樣品6份(批號：100521)，按“2.4.2②”項下方法制備供試品溶液并測定，結果樣品總鐵含量為每片11.42 mg，RSD為3.41%，表明本方法重復性良好。

⑤回收率實驗。精密稱取稱取6份已測定含量的樣品各0.05 g(含量：23.45 mg·g-1)，分別精密加入鐵標準溶液(1000 mg·mL-1)1 mL，按“2.4.2②”項下方法制備樣品并測定，計算加樣回收率，結果表明，平均加樣回收率為100.83%，RSD為1.46%(表3)。

表3 鐵回收率測定結果Tab.3 Recovery results of Fe

⑥樣品的測定。取6批樣品，按“2.4.2②”項下方法制備供試品溶液，測定，計算含量，結果見表4。

表4 樣品的含量測定結果Tab.4 Content detection of samples

3 討論

本實驗對腦立清片的顯微鑒別、理化鑒別及薄層色譜鑒別方法均進行了增修，增加了冰片和薄荷腦的氣相色譜定量測定方法，并采用原子吸收分光光度法對本制劑中總鐵含量進行了測定，從而科學、有效地評價制劑的質量。

3.1供試品的制備方法

3.1.1冰片和薄荷腦含量測定中供試品溶液的制備 實驗過程中分別對提取溶劑及提取方法進行考察，采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯3種提取溶劑，超聲和回流2種提取方法測定樣品中龍腦及薄荷腦的含量，結果表明，回流提取的樣品中這2種成分含量較高；在此對回流時間進行了考察，最終選取回流提取30 min制備供試品溶液。

3.1.2鐵含量測定中供試品溶液的制備 分別比較了濕法消解及微波消解兩種方法，經方法對比分析，因樣品中礦物藥比較多，濕法消解過程中為非密閉式消解，方便調整酸液的用量，故最終采用濕法消解進行樣品前處理。同時在消解過程中比較了硝酸、硝酸-高氯酸(9：1)及硝酸-高氯酸(4：1)等消解液，最終采用硝酸-高氯酸(4：1)混合液進行濕法消解。

3.2含量測定限度的制定

3.2.1冰片和薄荷腦含量測定限度值的制定 腦立清片中冰片及薄荷腦均為原料直接投料，理論轉移率應接近90%，但按處方量計算樣品中龍腦和樟腦的平均轉移率僅為52.8%和21.0%，分析原因可能是因為冰片和薄荷腦均有揮發(fā)性，如貯藏保管不當易造成損失。根據上述實驗結果，考慮到生產實際、冰片和薄荷腦藥材的質量差異、貯存條件等的影響，并結合腦立清膠囊標準中的含量限度值，暫定本品每片含冰片(以龍腦計)為不得少于1.45 mg，含薄荷腦不得少于1.05 mg。

3.2.2冰片和薄荷腦含量測定限度值的制定 本法制劑中所用的磁石及赭石含有鐵，《中華人民共和國藥典》2015年版一部中規(guī)定磁石的含量以鐵計算不得少于50.0%，赭石的含量以鐵計算不得少于45.0%。本實驗同樣采用原子吸收分光光度法對原藥材中的鐵含量進行了測定，根據藥材中鐵含量的測定結果計算制劑中的平均轉移率為52.21%。根據平均轉移率，以合格藥材投料，按處方量計算制劑中的鐵含量理論值為每片16.81 mg，故最終將其限度值規(guī)定為每片16.8 mg。

3.3制劑質量評價結果 按擬定的質量標準對收集的樣品進行測定，結果顯示A廠家的3批樣品鐵含量均不合格，即磁石、赭石含量不合格，提示部分生產企業(yè)樣品原料質量較差；B廠家的3批樣品中1批龍腦含量不合格，1批在限度邊緣，因為龍腦為原料藥直接投料，提示該企業(yè)的樣品在生產和貯存過程中龍腦揮發(fā)而導致含量偏低，可能需要改進生產工藝及包裝材料，減少揮發(fā)性成分在生產和貯存過程的損耗。