頂空毛細(xì)管氣相色譜-熱導(dǎo)檢測器法測定抗菌藥物中的水分*

符傳武，洪薇，鐘文俊，覃華亮，覃子龍，李俊霖，劉永逸

(柳州市食品藥品檢驗(yàn)所，柳州 545006)

水分會影響抗菌藥物的穩(wěn)定，造成藥效降低，甚至?xí)箍咕幬锝到猓a(chǎn)生對人體有害的物質(zhì)[1]，因此，抗菌藥物中的水分是藥品質(zhì)量控制中一項(xiàng)特別重要的指標(biāo)。目前國內(nèi)公開報(bào)道的抗菌藥物水分的測定有卡爾費(fèi)休氏法[2-10]、微波加熱法[11]、減壓干燥法[12]和近紅外光譜法[13-17]，其中報(bào)道最多的是采用卡爾費(fèi)休法。

卡爾費(fèi)休法是Karl Fischer在1935年提出的測定水分的分析方法[18]，其原理是利用碘將二氧化硫氧化為三氧化硫時(shí)，需要一定量的水參與反應(yīng)，由消耗碘的量計(jì)算出水分的含量，它屬于水分測定的經(jīng)典方法，已被列為許多物質(zhì)中水分測定的標(biāo)準(zhǔn)方法[19]，在《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0832收載有此法，用于測定藥品中水分的含量。其具有對水選擇性強(qiáng)、準(zhǔn)確和精密度高、樣品用量少及樣品制備簡單等優(yōu)點(diǎn)，但該法所使用的試液及試劑有較高的毒性，對環(huán)境及檢測人員的身體健康構(gòu)成了較大的威脅，因此建立一種對人體危害小又能批量快速測定抗菌藥物中水分的檢測方法非常有必要。

筆者目前還未見有關(guān)采用頂空毛細(xì)管氣相色譜-熱導(dǎo)檢測器法測定抗菌藥物中水分的文獻(xiàn)報(bào)道。筆者采用對人員和環(huán)境較為友好的乙醇提取試劑，所建立的氣相色譜法能快速、準(zhǔn)確地測定抗菌藥物中的水分。

1 儀器與試藥

1.1儀器 GC-2010 Plus氣相色譜儀、熱導(dǎo)檢測器(TCD，日本島津公司)；XS205DU電子分析天平(瑞士Mettler 公司，感量：0.01 mg)。

1.2試藥 阿莫西林膠囊(華北制藥股份有限公司，簡稱HB，哈藥集團(tuán)制藥總廠，簡稱HY，瑞陽制藥有限公司，簡稱RY，吉林萬通藥業(yè)集團(tuán)梅河藥業(yè)股份有限公司，簡稱WT，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，簡稱LK，先聲藥業(yè)有限公司，簡稱XS，四川峨眉山藥業(yè)有限公司，簡稱EMS，成都錦華藥業(yè)有限責(zé)任公司，簡稱JH，批號分別為F6102316，A1503168，15051702，20161015，1610026，02-161108，20170301，170304)；頭孢氨芐膠囊(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號：160701)；頭孢克肟膠囊(天津華津制藥有限公司，簡稱HJ，批號：6E262C)；頭孢克肟片(白云山制藥總廠，簡稱BYS，山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，簡稱LX，湖南方盛制藥股份有限公司，簡稱FS，山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，浙江巨泰藥業(yè)有限公司，簡稱JT，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號分別為20170005，617042312，170301，617102202，T01170601，170203)；頭孢克洛片(石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，簡稱OY，白云山制藥總廠，批號分別為021170601，20170003)；頭孢丙烯片(山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號：617052243X)；頭孢拉定片(湖南科倫制藥有限公司，簡稱KL，批號：H150604)；乙醇(含量99.9%，色譜純)；甲醇(北京百靈威科技有限公司，含量99.8%，色譜純)；水為Ⅰ級純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 采用頂空毛細(xì)管氣相色譜-熱導(dǎo)檢測器法進(jìn)行測定，使用Agilent HP-PLOT/Q毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.530 mm，40 μm)；載氣為高純氦氣，流量3 mL·min-1；進(jìn)樣量250 μL，分流比20：1，進(jìn)樣口溫度為200 ℃；頂空進(jìn)樣，采用氣密針模式的頂空進(jìn)樣(氣密針溫度為95 ℃)，頂空瓶的平衡溫度為85 ℃，平衡時(shí)間為10 min；柱溫箱：采取程序升溫，初始溫度150 ℃，保持6 min，以60 ℃·min-1的速率升到250 ℃，保持5 min；熱導(dǎo)檢測器溫度為250 ℃，電流為70 mA。

2.2溶液的制備

2.2.1內(nèi)標(biāo)提取溶液 取甲醇4 mL，用乙醇定容至1000 mL，作為內(nèi)標(biāo)提取溶液。

2.2.2溶劑空白溶液 精密加入內(nèi)標(biāo)提取溶液3 mL，置20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，密封，作為溶劑空白溶液。

2.2.3對照品溶液 精密稱取水15 mg，置20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)提取溶液3 mL，密封，作為對照品溶液。

2.2.4供試品溶液 精密稱取樣品0.1 g，置20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)提取溶液3 mL，密封，作為供試品溶液。

2.3系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)及專屬性考察 取一個(gè)20 mL頂空進(jìn)樣瓶密封為A瓶；取3 mL水置20 mL頂空進(jìn)樣瓶中密封，為B瓶；取3 mL甲醇，置20 mL的頂空進(jìn)樣瓶中密封為C瓶。取上述的溶劑空白溶液、對照品溶液及供試品溶液作為系統(tǒng)適用性考察供試品。分別精密吸取250 μL注入氣相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定，記錄色譜圖。理論板數(shù)以水和甲醇峰計(jì)，均不低于20 000，各峰分離度均大于1.5。水保留時(shí)間約為2.1 min，甲醇保留時(shí)間約為2.7 min(圖1)，由于溶劑空白中含有水峰，故本次測定采取扣除本底的方法以消除對測定結(jié)果的影響。

2.4線性關(guān)系考察 分別精密稱取水適量，置20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)提取溶液3 mL，密封，配制濃度為1.717，3.333，5.000，8.333，16.667 mg·mL-1的系列對照品溶液。分別精密量取250 μL，注入氣相色譜儀，記錄圖譜，以水的色譜峰(扣除溶劑中水的峰面積)與內(nèi)標(biāo)甲醇峰比值(Y=A水/A內(nèi))，分別對其濃度(C，mg·mL-1)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：Y=0.201 2C+0.006 0，r=0.999 8，表明水峰在含量為1.717～16.667 mg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。

2.5精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)的溶劑空白溶液6份，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，每份進(jìn)樣1次，結(jié)果水峰與甲醇峰比值(K=A水/A內(nèi))的RSD為 4.4%，說明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批(批號：02-161108)樣品6份，精密稱定，按 “2.2.4”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，計(jì)算水的平均含量為12.55%，RSD 為 4.7%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性較好。

2.7加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批(批號：02-161108)已知水分含量的阿莫西林膠囊樣品9份，每份約0.05 g，加入水適量，照“2.2.4”項(xiàng)供試品溶液配制的方法配制低、中、高3種濃度的溶液，并按上述色譜條件下進(jìn)行測定，計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果平均回收率為92.76%～103.55%，RSD均在5.0%范圍內(nèi)，見表1。

2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批(批號：02-161108)樣品4份，精密稱定，按 “2.2.4”項(xiàng)制備供試品溶液，在室溫下放置0，3，6，12 h測定，記錄主峰面積，結(jié)果表明，樣品中水的含量無明顯變化，其RSD為5.7%。

1.空氣；2.水；3.甲醇；4.乙醇。圖1 空氣(A)、水(B)、甲醇(C)、溶劑空白(D)、對照品溶液(E)、供試品溶液(F)色譜圖 1.air;2.water;3.methanol;4.ethanol.Fig.1 GC chromatogram of air (A),water (B),methanol (C),blank solvent (D),reference substances (E)and sample solution (F)

表1 阿莫西林加樣回收率測定結(jié)果Tab.1 Results of recovery test of amoxicillin n=3

2.9樣品測定 精密稱取20個(gè)抗菌藥物樣品，照“2.2.4”項(xiàng)的方法制備溶液；按“2.1”項(xiàng)的色譜條件，記錄色譜圖。按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算水的含量，同時(shí)用法定檢測方法——費(fèi)休法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0832第一法)對其測定，結(jié)果用費(fèi)休法和氣相法測定結(jié)果無顯著差異，且均符合標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，見表2。

3 討論

3.1頂空條件的考察 本次頂空條件考察使用批號為02-161108的樣品，為了便于考察方法的可靠性，本研究先用費(fèi)休法測定其水分的含量(12.7%)，再將頂空條件的考察結(jié)果與其進(jìn)行比較，最終確定與費(fèi)休法測定結(jié)果無顯著差異的頂空條件。

取樣量及提取溶劑考察：在樣品瓶平衡溫度為85 ℃，平衡時(shí)間為30 min以下，考察了取樣量為0.05，0.1，0.25，0.5，1.0 g，提取溶劑加入量為3，5，10 mL時(shí)抗菌藥物中水的含量，結(jié)果顯示，當(dāng)取樣量為0.05或0.1 g，提取溶劑加入量為3，5，10 mL時(shí)，測定結(jié)果與費(fèi)休法測定結(jié)果無顯著差異。

取樣量及樣品平衡時(shí)間的考察：在平衡溫度為85 ℃，提取溶劑加入量為3 mL時(shí)，考察了取樣量為0.05，0.1，0.25，0.5，1.0 g，頂空進(jìn)樣瓶平衡時(shí)間為5，10，20，30 min，結(jié)果顯示，當(dāng)取樣量為0.05或0.1 g，頂空進(jìn)樣瓶平衡時(shí)間為10，20，30 min，本法測定結(jié)果與費(fèi)休法測定結(jié)果無顯著差異。

樣品瓶平衡溫度的考察：當(dāng)空白溶劑溶液、對照品溶液、供試品溶液精密加入內(nèi)標(biāo)提取溶液3 mL，取樣量為0.05，0.1 g，平衡時(shí)間為10 min時(shí)，樣品瓶平衡溫度為85 ℃，其測定結(jié)果與費(fèi)休法測定結(jié)果無顯著差異；當(dāng)樣品瓶平衡溫度為75或65 ℃時(shí)，其測定結(jié)果比費(fèi)休法測定結(jié)果偏低。

3.2測定方法的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道測定抗菌藥物中的水分主要有近紅外法[13-17]、干燥失重法與費(fèi)休法[7]。近紅外法測定水分快速、簡便，但前期必須花大量的精力來建立相關(guān)的定量模塊；干燥失重法設(shè)備便宜，操作簡單，但由于部分抗菌藥物含有揮發(fā)溶劑，不能很準(zhǔn)確反映抗菌藥物真實(shí)水分的含量；費(fèi)休法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，但其所使用的試劑毒性較大，不符合當(dāng)今綠色檢測的理念。筆者參考有關(guān)文獻(xiàn)[20-22]，使用頂空毛細(xì)管氣相色譜-熱導(dǎo)檢測器，測定抗菌藥物中的水分，所使用的試劑較為環(huán)保，試劑使用量少，前處理操作簡單，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表2 樣品含量測定結(jié)果Tab.2 Results of content determination on the samples n=3

3.3含量計(jì)算方法的選擇 為了消除樣品前處理及進(jìn)樣體積誤差對測定結(jié)果的影響及后期計(jì)算的便利，本次實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行定量分析，經(jīng)比較，內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算的結(jié)果有較好的重復(fù)性。由于提取溶劑中含有部分水，計(jì)算時(shí)必須把這部分的水量扣除，具體計(jì)算公式如下：

(1)內(nèi)標(biāo)提取溶液校正因子計(jì)算公式：K=A水1/A甲醇1

(2)對照品校正因子計(jì)算公式：F=A甲醇2×C水2/[(A水2-K×A甲醇2)×C甲醇2]

(3)樣品含水量計(jì)算公式：水%=[F×(A水3-K×A甲醇3)×C甲醇3×N]/A甲醇3×W×1000×100%

K為內(nèi)標(biāo)提取溶液校正因子；A水1為內(nèi)標(biāo)提取溶液水的峰面積；A甲醇1為內(nèi)標(biāo)提取溶液甲醇的峰面積；F為對照品溶液校正因子；A水2為對照品溶液水的峰面積；A甲醇2為對照品溶液甲醇的峰面積；C水2為對照品溶液水的含量，單位為mg·mL-1；C甲醇2為對照品溶液甲醇的含量，單位為%；A水3為供試品溶液中水的峰面積；A甲醇3為供試品溶液中甲醇的峰面積；C甲醇3為供試品溶液中甲醇的濃度，單位為%；N為稀釋倍數(shù)；W為供試品取樣量，單位為g；1000為單位換算系數(shù)。

3.4色譜柱的選擇及程序升溫條件的優(yōu)化 選取3根不同型號的色譜柱：HP-PLOT/Q(30 m×0.530 mm，40 μm)，150 ℃保持6 min，以60 ℃·min-1升溫至250 ℃，保持5 min；DB-624(30 m×0.530 mm，3 μm)，60 ℃保持2 min，以10 ℃·min-1升溫至140 ℃，保持1 min；DB-FFAP(30 m×0.32 mm，0.25 μm)，60 ℃保持6 min，以60 ℃·min-1升溫至200 ℃，保持2 min。結(jié)果3根色譜柱各峰分離度均大于1.5，理論板數(shù)以水和甲醇峰計(jì)，均在20 000以上。

3.5進(jìn)樣方式選擇 由于液體進(jìn)樣方式會把樣品本身及樣品中含有的不揮發(fā)性組分注入氣相色譜中，這不僅會污染進(jìn)樣針，還會污染進(jìn)樣口和色譜柱，故本研究采用較為簡便、干凈、快速，且不需要使用大量有機(jī)溶劑的頂空進(jìn)樣方式進(jìn)樣。

3.6濕度對實(shí)驗(yàn)的影響 研究表明，環(huán)境的濕度對測定結(jié)果重現(xiàn)性有一定的影響[22]，當(dāng)環(huán)境濕度較大時(shí)，應(yīng)該控制實(shí)驗(yàn)室的濕度。前處理時(shí)應(yīng)該充分考慮到這一因素，盡量縮短其與空氣接觸的時(shí)間及所用的容器必須干燥。

3.7其他問題 利用本法測定多批注射用頭孢曲松鈉水分時(shí)發(fā)現(xiàn)，其測定結(jié)果與費(fèi)休法測定結(jié)果有較大差別(費(fèi)休法測定結(jié)果約為本法測定結(jié)果的1.7倍)，但與烘干法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0832第二法)測定結(jié)果又較為接近，造成此現(xiàn)象的原因，筆者認(rèn)為是由于頭孢曲松鈉本身或者注射用頭孢曲松鈉中所含有的輔料(已有文獻(xiàn)報(bào)道[1]，輔料無水碳酸鈉對費(fèi)休法測定水分有干擾，致使測定結(jié)果偏高)能與碘反應(yīng)，致使卡爾費(fèi)休法試劑消耗增加，從而使測定結(jié)果偏高，故《中華人民共和國藥典》2015年版二部使用費(fèi)休法測定注射用頭孢曲松鈉水分的合理性及準(zhǔn)確性有待于進(jìn)一步探討。

筆者曾考察多個(gè)廠家的無水乙醇和含量為99.9%的色譜乙醇，其溶劑均含有一定量的水，在色譜圖上有較為明顯的色譜峰，故本法無需考察方法的檢出限，但為了減少本底的干擾，對照品溶液與供試品溶液的配制必須用同一瓶新配的內(nèi)標(biāo)提取溶液，按“3.3”項(xiàng)的計(jì)算方法扣除本底的干擾。從“2.9”項(xiàng)樣品測定結(jié)果可以看出，本計(jì)算方法能有效地消除本底水分的干擾。

由于溶劑中含有水分，對含水量較低樣品的測定誤差可能會比較大，本課題組下一步將繼續(xù)研究消除溶劑中水分的相關(guān)技術(shù)，以彌補(bǔ)本法的不足。