SPE-HPLC-DAD法同時(shí)檢測(cè)柑橘藥用資源中黃烷酮類和川陳皮素成分

謝 輝，陳 亞，雷愛玲，朱春燕，李楊梅，白玉婷，孫 鵬*，李貴節(jié),2*

1重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院 重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400067；2西南大學(xué)柑桔研究所 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所 國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712

柑橘屬于蕓香科柑橘亞科植物[1]，很多品種具有藥用價(jià)值，常見中藥材包括陳皮、青皮、化橘紅、橘絡(luò)及橘核等。陳皮(CitriReticulataePericarpium)為曬干的成熟橘皮，入藥以陳為佳具有理氣和中、燥濕化痰、安胃和中、降逆止嘔等功效[2]。青皮(CitriReticulataePericarpiumViride)，即橘子未成熟的綠色干燥外皮，亦有用幼小果實(shí)曬干而成，具有破氣散結(jié)、疏肝止痛的作用[3,4]。化橘紅(ExocarpiumCitriGrandis)為廣東地方柚的變種，具有利氣消痰、寬中散結(jié)的功效[5,6]。橘絡(luò)(CitriReticulataeRetinervus)即橘瓣上的白色絲絡(luò)，具有通血脈、理氣止痛及化痰的功效。橘核(CitriReticulataeSemen)為橘子的種子，具有理氣、止痛的功效[7]。

柑橘果實(shí)中含有大量的類黃酮物質(zhì)，常見成分包括屬于黃烷酮類物質(zhì)的蕓香柚皮苷、橙皮苷、柚皮苷、橙皮素、柚皮素和屬于多甲氧基黃酮類的川陳皮素[8]。已有研究表明，蕓香柚皮苷、橙皮苷、柚皮苷等黃烷酮糖苷具有抗脂質(zhì)過氧化、清除氧自由基、抗炎、抗癌、抗菌、抗病毒、延緩衰老、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等多種作用[9-11]；而川陳皮素也有較強(qiáng)的抗腫瘤、抗真菌、抗動(dòng)脈粥樣硬化和降低血清膽固醇等藥理活性[12,13]。提取柑橘類黃酮的常用方法有堿提取酸沉淀法、溶劑提取法、超聲波輔助提取、加熱回流提取等方法；分離純化的常用手段包括柱層析法、大孔樹脂吸附法、高速逆流色譜技術(shù)等方法[14]。固相萃取(SPE)是近年來廣泛應(yīng)用于食品、生物、藥學(xué)、環(huán)境等眾多領(lǐng)域的樣品前處理技術(shù)。SPE常用于處理組成復(fù)雜的液體樣品，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)樣品中不揮發(fā)和半揮發(fā)性目標(biāo)物的萃取、凈化和濃縮的要求，具有去除干擾物質(zhì)、溶劑用量少、操作簡(jiǎn)單快速等優(yōu)良性能[15-20]。本研究選取了陳皮、青皮、化橘紅、橘絡(luò)、橘核等常用的柑橘藥材作為檢測(cè)對(duì)象，采用乙醇浸提柑橘藥材中的川陳皮素和黃烷酮等目標(biāo)物質(zhì)，運(yùn)用SPE進(jìn)一步去除雜質(zhì)和富集濃縮，采用高效液相色譜串聯(lián)二極管陣列檢測(cè)器(high performance liquid chromatography-diode array detector，HPLC-DAD)進(jìn)行分離和分析檢測(cè)，進(jìn)而了解目標(biāo)類黃酮成分在柑橘不同藥用資源中的分布情況，以期為進(jìn)一步研究其功能性和藥理作用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陳皮、青皮、化橘紅、橘絡(luò)和橘核購自重慶萬家燕大藥房，由重慶第二師范學(xué)院重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心趙欣教授鑒定。甲醇、乙酸(色譜純)上海阿拉丁有限公司；無水乙醇(分析純)重慶川東化工(集團(tuán))有限公司。蕓香柚皮苷、橙皮苷、柚皮苷、橙皮素、柚皮素及川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品(純度98%) 上海源葉生物科技有限公司，其物質(zhì)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 6個(gè)柑橘類黃酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of six citrus flavonoids注：1-蕓香柚皮苷；2-橙皮苷；3-柚皮苷；4-橙皮素；5-柚皮素；6-川陳皮素。Note:1-Narirutin;2-Hesperidin;3-Naringin;4-Hesperetin;5-Naringenin;6-Nobiletin.

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate 3000 高效液相色譜儀，配備二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，德國Thermo Scientific公司；HyperSep C18SPE小柱 ，德國Thermo Scientific公司；0.22 μm有機(jī)相微孔濾頭，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

分別稱取適量蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容為1.0 mg/mL的儲(chǔ)備液；再用甲醇稀釋，配制濃度分別為10.0、15.0、20.0、30.0、100.0、200.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及相同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3.2 樣品處理

樣品粉碎后過60目篩，取約1.0 g細(xì)粉，精密稱量，加入20 mL 70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，浸提1 h后過濾。將過濾后的液體稀釋至5%，稀釋液以1 mL/min流速通過甲醇活化后的固相萃取柱，再通過超純水清洗除雜。柱上吸附的目標(biāo)物質(zhì)用5 mL甲醇洗脫，洗脫液過0.22 μm微孔濾膜后備用。

1.3.3 色譜及檢測(cè)條件

色譜柱：Thermo Scientific Accucore C18(4.6 mm×150 mm，2.6 μm)；流動(dòng)相：A甲醇，B 0.5%乙酸水溶液，流動(dòng)相梯度見2.2分離條件的選擇；定量檢測(cè)波長(zhǎng)：283、285、290、335 nm；柱溫30 ℃；流速0.50 mL /min；進(jìn)樣量5 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 浸提液稀釋對(duì)C18固相萃取效果的影響

利用C18SPE前處理的原理為分配層析。柑橘類黃酮都含有極性較弱的母環(huán)結(jié)構(gòu)，根據(jù)相似相溶的原理，它們依據(jù)取代基的不同易分布在中弱極性的物質(zhì)中。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%的樣品提取液通過SPE柱時(shí)，由于流動(dòng)相與C18固定相極性接近，大部分黃烷酮類物質(zhì)和川陳皮素會(huì)繼續(xù)保留在乙醇溶液中，僅少量保留在SPE柱上。降低乙醇體積分?jǐn)?shù)，得到的稀釋液極性升高，則柑橘類黃酮物質(zhì)更傾向于保留在極性更弱的固定相表面，從而能夠?qū)崿F(xiàn)固相萃取和濃縮。根據(jù)上述原理，將陳皮浸提液稀釋至乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%、10%、5%，分別通過SPE柱，最終測(cè)得保留的類黃酮含量見表1。結(jié)果表明，5%體積分?jǐn)?shù)乙醇稀釋液中黃烷酮和川陳皮素被SPE收集保留量最高，效果最好。繼續(xù)稀釋時(shí)，類黃酮的溶解性顯著降低，稀釋液呈現(xiàn)明顯渾濁狀態(tài)，導(dǎo)致SPE對(duì)類黃酮成分的保留嚴(yán)重降低，且結(jié)果重復(fù)性差(結(jié)果未顯示)。

表1 C18 SPE對(duì)不同乙醇濃度陳皮稀釋液中類黃酮物質(zhì)的收集保留量

2.2 色譜分離條件的選擇

6種物質(zhì)都含有苯并吡喃酮結(jié)構(gòu)，性質(zhì)較為相似，因此采用梯度洗脫的方式進(jìn)行分離?？紤]到黃烷酮類物質(zhì)即蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、柚皮素和橙皮素中含有易電離的酚羥基，因此在流動(dòng)相中加入乙酸抑制電離，從而改善峰型。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用甲醇和0.05%乙酸水溶液作為流動(dòng)相，各物質(zhì)不能達(dá)到基線分離，而且色譜峰仍有拖尾現(xiàn)象；改用甲醇和0.5%乙酸水溶液(pH=3.03)后，峰形得到明顯改善，柑橘藥用資源樣品中的黃烷酮類物質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)良好分離。經(jīng)優(yōu)化后的洗脫程序見表2，在該條件下分離6種物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的的紫外色譜圖如圖2所示。

2.3 樣品峰定性和定量檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

在2.2所述分離條件下，用DAD掃描各物質(zhì)在190～400 nm間的紫外吸收，得到5個(gè)黃烷酮類物質(zhì)及川陳皮素的紫外光譜圖(圖3)。將樣品物質(zhì)峰的保留時(shí)間和紫外光譜圖與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰對(duì)比，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品峰的定性分析，同時(shí)作峰純度檢測(cè)，以確認(rèn)各目標(biāo)物質(zhì)峰沒有或僅有微量其他成分共流出。由圖3還可知：蕓香柚皮苷在283 nm處有最大吸收，橙皮苷、柚皮苷在285 nm處有最大吸收，橙皮素、柚皮素在290 nm處有最大吸收，而川陳皮素在335 nm處有最大吸收。因此分別選擇283、285、290、335 nm為上述6個(gè)物質(zhì)的定量檢測(cè)波長(zhǎng)。

表2 HPLC流動(dòng)相梯度洗脫程序

圖2 柑橘類黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖和柑橘藥用資源樣品色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of the mixed flavonoid standard solution and citrus medicinal resources samples注：1-蕓香柚皮苷；2-柚皮苷；3-橙皮苷；4-柚皮素；5-橙皮素；6-川陳皮素；A-陳皮；B-橘絡(luò)；C-青皮；D-化橘紅；E-橘核；顯示波長(zhǎng)：285 nm。Note:1-Narirutin;2-Naringin;3-Hesperidin;4-Naringenin;5-Hesperetin;6-Nobiletin;A-Chenpi;B-Juluo;C-Qingpi;D-Huajuhong;E-Juhe,;Ultraviolet wavelength:285 nm.

2.4 線性關(guān)系和檢測(cè)限

將各標(biāo)注物質(zhì)儲(chǔ)備液分別稀釋至10.0、15.0、20.0、30.0、100.0、200.0 μg/mL，測(cè)量不同濃度的標(biāo)樣所對(duì)應(yīng)的峰面積，計(jì)算回歸方程。測(cè)定儀器信噪比(S/N)，當(dāng)各標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至信噪比3

2.5 重復(fù)性、穩(wěn)定性和精密度

取同一批實(shí)驗(yàn)樣品按照1.3.2進(jìn)行樣品處理，配制試樣6份，按照表2的流動(dòng)相洗脫程序進(jìn)行含量測(cè)定，進(jìn)行精密度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示各物質(zhì)RSD在0.49%～2.55%(表4)，表明精密度和重復(fù)性良好。

將陳皮樣品提取液放置于室溫下，分別在24、48、72 h測(cè)定各類黃酮成分的含量，以研究其穩(wěn)定性。如表5所示，提取液中蕓香柚皮苷濃度呈緩慢地上升趨勢(shì)，72 h升高了約1.7%；柚皮苷含量在72 h內(nèi)呈緩慢下降趨勢(shì)，約降低了0.02 mg/g。橙皮苷、柚皮素和橙皮素含量變化趨勢(shì)不明顯，而川陳皮素的含量在72 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

表3 回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢測(cè)限

注：A為峰面積，單位mAU；C為濃度，單位μg/mL。

Note:A is the peak area in mAU;C is the concentration in μg/mL.

2.6 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取相同質(zhì)量的同一批次陳皮樣品兩份，一份用來測(cè)定本底含量，另一份加入已知量的川陳皮素和黃烷酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.3.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按2.1、2.2項(xiàng)下條件測(cè)定，通過實(shí)際測(cè)得加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量除以已知加入量計(jì)算回收率，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表6所示，各物質(zhì)的回收率為95.83%～103.56%。

圖3 6個(gè)類黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的紫外光譜圖Fig.3 UV spectra of six flavonoids注：1-川陳皮素；2-蕓香柚皮苷；3-橙皮苷；4-柚皮苷；5-橙皮素；6-柚皮素；橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，單位nm；縱坐標(biāo)為紫外信號(hào)的相對(duì)響應(yīng)值。Note:1-Nobiletin;2-Narirutin;3-Hesperidin;4-Naringin;5-Hesperetin;6-Naringenin;the abscissa is the wavelength in nm;the ordinate is the relative response of the ultraviolet signal.

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 柑橘藥用資源類黃酮含量

將5種柑橘藥用資源按照1.3.2和1.3.3處理和分析，結(jié)果如表7所示。所選柑橘藥用資源均含有蕓香柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素等4個(gè)黃烷酮類成分和川陳皮素；除橘核外，其他4種柑橘藥用資源中都檢出了柚皮苷。不同藥用資源所含優(yōu)勢(shì)黃烷酮化合物的類別有所差異。陳皮、青皮、橘絡(luò)和橘核中的優(yōu)勢(shì)成分是蕓香柚皮苷和橙皮苷，其中以青皮中蕓香柚皮苷含量最高(10.49 mg/g)，約為含量最低的橘核的40倍；陳皮中的橙皮苷含最高(10.78 mg/g)，是含量最低的橘核的10.5倍、化橘紅的3.6倍?；偌t的優(yōu)勢(shì)黃烷酮物質(zhì)為柚皮苷，其含量也為5種柑橘藥用資源中最高的，達(dá)到19.20 mg/g，是含量最低的陳皮的137倍；橘核中未檢出柚皮苷。

表5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 加標(biāo)回收率

表7 5種柑橘藥用資源中黃烷酮類成分和川陳皮素的含量

3 結(jié)論

本研究開發(fā)了一套同時(shí)準(zhǔn)確分析檢測(cè)柑橘藥用資源中黃烷酮類成分和川陳皮素等類黃酮物質(zhì)含量的方法。采用70%乙醇浸提，將提取液稀釋后通過固相萃取除雜并濃縮，采用高效液相色譜分離6種目標(biāo)物質(zhì)，利用紫外光譜結(jié)合保留時(shí)間做定性分析及色譜峰純度檢驗(yàn)，采用外標(biāo)法在各物質(zhì)的最大波長(zhǎng)處測(cè)定其含量。結(jié)果表明：樣品稀釋液乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，利用SPE富集各類黃酮成分效率最高。對(duì)陳皮、青皮、化橘紅、橘絡(luò)和橘核等5種柑橘藥用資源進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：青皮中蕓香柚皮苷含量最高(10.49 mg/g)，化橘紅中柚皮苷含量最高(19.20 mg/g)，陳皮中的橙皮苷含最高(10.78 mg/g)；而柚皮素、橙皮素、川陳皮素在各柑橘藥用資源中含量較低。該方法的加標(biāo)回收率為95.83%～103.56%，RSD為0.49%～2.55%，具有良好的精密度和重現(xiàn)性。該方法適用于常規(guī)HPLC對(duì)柑橘藥用資源中類黃酮的定性和定量檢測(cè)。